专利名称：日本血吸虫miRNA及其用途的制作方法
日本血吸虫miRNA及其用途技术领域
本发明属于生物医学和寄生虫领域；更具体地，本发明涉及一类分离自日本血 吸虫的miRNA、其前体及反义寡核苷酸，以及它们在制备抑制日本血吸虫生长的组合物 中的用途。
背景技术：
MicroRNA (miRNA)是一类真核生物高度保守的内源性小调节RNA，长度约 18 沈个核苷酸，通过与靶mRNA特异性碱基配对引起靶mRNA降解或翻译抑制，调控 基因转录后表达。它来源于长度约为IOOObp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60 80nt的具有茎环结构的 miRNA前体(Pre-miRNA)。Pre-miRNA转运至胞质后，被Dicer酶进一步切割成长约 22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合 物(RNA-induced silencing complex, RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶 mRNA或阻遏其表达。
由于miRNA序列在不同的生物体中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA 的功能是参与生命的一系列基本过程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞 死亡、脂肪代谢以及干细胞维持和分化等。
目前，在严重危害人类健康的血吸虫病的病原体——日本血吸虫中已经发现了 一些miRNA，然而这些miRNA仅占日本血吸虫中存在的miRNA中相当少的一部分，并 且研究人员对于这些miRNA的功能了解很少。随着Solexa等高通量测序技术的快速发展 (可以检测到单拷贝的小RNA分子)，研究人员可以较为系统地鉴定某一生物体中存在的 小 RNA。
因此通过Solexa高通量测序技术进一步系统全面地鉴定出与日本血吸虫生长发 育或致病相关的 miRNA对基于miRNA的日本血吸虫诊断和治疗具有十分重要的意义。 此外，本领域需要鉴定出与日本血吸虫生长发育或致病相关的miRNA，从而为日本血吸 虫病的防治和药物的研制提供新的途径。发明内容
本发明的目的在于提供分离自血吸虫的miRNA、其前体及反义寡核苷酸，以及 它们在制备抑制血吸虫的组合物中的用途。
本发明的目的还在于提供用于调节(下调或上调)日本血吸虫miRNA表达或数 量的方法，从而发挥调节日本血吸虫生长、发育等作用；以及提供一种新的抑制日本血 吸虫生长发育的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自
(i)序列如SEQ ID NO η所示的miRNA，其中η为选自1_33的正整数；或
(ii)与 SEQ ID NO η 所示序列互补的 miRNA。
在另一优选例中，所述的miRNA分离自寄生虫。
在另一优选例中，所述的寄生虫是日本血吸虫Mchistosomajaponicum)。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的前体miRNA，所述的前体miRNA选 自
(A)序列如SEQ ID NO (n+33)所示的前体miRNA，所述的前体miRNA可在日本血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO: η所示的miRNA，其中η为选自1_33 的正整数；或
(B)与SEQ ID NO: (n+33)所示序列互补的前体miRNA。
在本发明的第三方面，提供了所述的miRNA的反义寡核苷酸，所述的反义寡核 苷酸选自
(a)序列如SEQ ID NO (n+66)所示的寡核苷酸，其中η为选自1_33的正整 数；或
(b)与SEQ ID NO: (n+66)所示序列互补的寡核苷酸。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸是核酸锁(LNA)修饰的寡核苷酸.
在另一优选例中，所述的寡核苷酸是硫代修饰磷酸二酯键骨架的寡核苷酸；或 者所述的寡核苷酸是2'-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟嘧啶修饰的寡核苷酸。
在另一优选例中，所述的反义寡核苷酸是DNA或与所述DNA序列相应的 RNA。
在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被日本 血吸虫细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在日本血吸虫细胞内被剪切且表达 成如SEQ ID NO η所示的miRNA，其中η为选自1_33的正整数。
在另一优选例中，所述的多核苷酸含有式I所示的结构
Seq正向-XIeq反向 式 I，
式I 中，
Seq1^1为能在日本血吸虫细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，
Seqfi^1为与Seq正自基本上互补(或完全互补)的核苷酸序列；
X为位于Seq1^P Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P向$ n,
式I所示的结构在转入日本血吸虫细胞后，形成式II所示的二级结构 Seq 正向
I IX式 II， Seq反向
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
(I表示在Seqfi^1之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明的第五方面，提供了所述的反义寡核苷酸的用途，用于制备抑制日本 血吸虫生长发育或杀灭日本血吸虫的组合物。
在本发明的第六方面，提供了 一种抑制日本血吸虫生长发育或杀灭日本血吸虫 的组合物，所述的组合物含有有效量的本发明第三方面中所述的反义寡核苷酸；以及药 学上可接受的载体。
在本发明的第七方面，提供了一种体外非治疗性的、抑制日本血吸虫生长发育4或杀灭日本血吸虫的方法，所述的方法包括给予日本血吸虫或感染日本血吸虫的宿主 有效量的所述的反义寡核苷酸，其中所述的宿主不是人。
更佳地，所述的宿主是钉螺。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中 具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再--累述。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1.Northern印迹检测miRNA在血吸虫童虫中的表达。
图2A-2F显示了 qPCR证实低表达水平miRNA的表达，其中各低表达miRNA的 茎环 RT-qPCR扩增曲线分别为 6EQIDN0 ) A 1，21，32 ； B 22，25，14 ； C 30，27，23 ； D 26，29，24 ； E 31, 28 ； F 33，3。其中 SEQ ID NO: 1、3、14 的扩增曲线作为阳性对照。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，从日本血吸虫中系统全面地分离获得一 类新的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA 的转录作用，从而影响相应的基因的表达。因此，本发明提供的miRNA可对于日本血吸 虫生长、发育产生影响。基于上述发现，本发明人还设计了针对所述miRNA的反义寡核 苷酸等，用于在细胞内调节(如下调或上调)miRNA的表达或数量，从而发挥调节日本血 吸虫生长、发育等作用。
如本文所用，所述的“寄生虫”包括但不限于裂体科寄生虫(如日本血吸 虫)、并殖科寄生虫等。优选的，所述的寄生虫是指任何携带本发明所提供的miRNA(其 序列如SEQ ID NO 1-33所示)或携带与所述的miRNA具有较高同源性(如具有80% 同源性或更高)的miRNA。此外，该术语还包括其mRNA的表达可被本发明所提供的 miRNA所影响的寄生虫的总称。
miRNA及其前体
本发明提供了一类从日本血吸虫中发现的miRNA。如本文所用，所述的 “miRNA”是指一种RNA分子，被从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有1816个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷 酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
日本血吸虫来源的miRNA可被从日本血吸虫细胞中分离。如本文所用，“分离 的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。 如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷 酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
日本血吸虫 miRNA 可从前体 miRNA (Precursor miRNA, Pre-miRNA)加工而 来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50_100bp之间。因此，本发明的另一方面关于可在日本血吸虫细胞中被加工产生 miRNA的前体miRNA。并且，所述的前体miRNA也是可从日本血吸虫中被分离的。所 述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条 序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
如本文所用，术语“互补”包括完全互补和基本(上)互补。
前体miRNA可被日本血吸虫细胞剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基 因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸 的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎 环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互 补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补 的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地， 两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不 匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10 个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其 可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区 域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环” 结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全 互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个 小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区 域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎 环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核 酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明人采用Solexa高通量测序的方法，系统全面地分离、鉴定出血吸虫童虫 中的miRNA。
具体地，本发明人从血吸虫童虫中提取总RNA，用15%尿素变性PAGE胶回收 18 30nt的小RNA，分别加Illumina' s专有的3'和5'-接头，然后用RT引物逆转 录加接头的小RNA，获得cDNA。将纯化的PCR产物制备成簇，采用Solexa测序技术测序。
接着，将Illumina/Solexa测序获得的序列去除两端接头和冗余序列，获得小 RNA序列。将获得的18 30nt的小RNA序列检索日本及曼氏血吸虫数据库去除rRNA， tRNA，snRNA, snoRNA和mRNA降解产物后，针对候选miRNA编码区域，以Mfold程 序分析包括候选序列两端约80bp的侧翼序列，分析其是否可形成pre-miRNA结构。本 发明人以表达长度约22nt且存在典型茎环结构的小非编码RNA定义为miRNA。同时， 由于Solexa测序能够获得低丰度的miRNA*序列，本发明人将相应miRNA*序列的获得 作为miRNA鉴定的有力证据。
本发明人进一步通过Nothern印迹杂交和茎环RT-qPCR验证。
结果，本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO η所示的序列，其中η为选自1-33的正整数(也即η选自1，2，3，…或32，33)。本发明所述的前体miRNA具有如SEQ ID NO (n+33)所示的序列，其中η为选自1_33的正整数。
反义寡核苷酸
根据所述的日本血吸虫miRNA序列，本发明人还设计出了所述miRNA的反义 寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反 义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO) ”又称为“反义核苷酸”，是 指长度约为1846nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
本发明所述的反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO (n+66)所示的序列，其中η为 选自1-33的正整数(也即η选自1，2，3，…或32，33)。较优选的，所述的反义寡核 苷酸具有如SEQ ID NO 67-86所示的序列(分别对应于SEQ ID NO 1-20所示序列的 miRNA)。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架 修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活 性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid, LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来 的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的 范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等 方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如 将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原 子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部 分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，宜对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫 代修饰。
本发明还提供了所述的反义寡核苷酸的用途，用于制备抑制日本血吸虫生长发 育或杀灭日本血吸虫的组合物。
组合物
本发明还提供了一种组合物(尤其是药物组合物或杀虫组合物)，所述的组合物 可抑制日本血吸虫生长发育或杀死日本血吸虫。
所述的药物组合物含有有效量的本发明上述的反义寡核苷酸，以及药学上可接 受的载体。
所述的杀虫或抑虫组合物含有杀虫或抑虫有效量的本发明上述的反义寡核苷 酸，以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如 毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可 对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接 受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药 剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本 领域普通技术人员所熟知的。在 Remington ‘ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub.Co.， N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的 载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。
本发明的反义寡核苷酸的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等 而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通 过临床试验)。所述的因素包括但不限于反义寡核苷酸的药代动力学参数例如生物利 用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的 途径等。通常，当本发明的反义核苷酸每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/ kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果。
本发明还提供了一种体外抑制日本血吸虫生长发育或杀日本血吸虫的方法，所 述的方法优选是非治疗性的，所述的方法包括体外给予日本血吸虫或感染日本血吸虫 的宿主有效量的所述的反义寡核苷酸；或者在生长或可能生长日本血吸虫的场所施用本 发明上述的杀虫或抑虫组合物。
在优选例中，所述的日本血吸虫的宿主例如是非人哺乳动物，尤其是钉螺。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的日本血吸虫miRNA序列，可设计出在被导入日本血吸虫中 后可被日本血吸虫加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即 所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分 离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被日本血吸虫细胞转录成前体 miRNA,所述的前体miRNA可被日本血吸虫细胞裂解且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构
Seq正向-XIeq反向 式 I，
式I 中，
Seq1^1为可在日本血吸虫细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seqfi^1S 与Mq1^1基本上互补(或完全互补)的核苷酸序列；或者，为可在日本血吸虫细胞 中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq1^1为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq1^P Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P向$ H ;
式I所示的结构在转入日本血吸虫细胞后，形成式II所示的二级结构 Seq E 向
IiX 式 II，Seq 反向
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
(I表示在Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
本发明还提供一种抑制目的基因表达的方法，所述的方法包括步骤
(1)提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸可被日本血吸虫细胞转录成前体 miRNA,所述的前体miRNA可被日本血吸虫细胞剪切且加工成能够与该目的基因对应的 mRNA的至少一部分序列互补的miRNA ；
(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到日本血吸虫细胞中，从而抑制所述目的基因 的功能。
将所述的多核苷酸构建物导入到日本血吸虫中，该多核苷酸构建物在体内被转 录成前体miRNA，之后所述的前体miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可与相应的 mRNA的部分序列相互补，从而抑制该mRNA相应的目的基因的表达。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载 体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动 子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需 的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所 述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞 的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
此外，利用本发明所述的miRNA序列，还可以点制miRNA芯片研究其表达谱 以及miRNAs的调节方式，具有很高的应用价值。通过利用所述的miRNA制备的miRNA 芯片，可分析miRNA基因的表达模式，可了解日本血吸虫中相应的基因对日本血吸虫生 长发育不同周期的调节情况；可设计相应的策略，调节和修饰靶基因，调节日本血吸虫 的生长发育。因此本发明还提供一种用于鉴定miRNA表达谱的芯片，所述的miRNA芯 片包括
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对 应于SEQ ID NO I-SEQ ID NO 33所示的序列。
较佳的，所述的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO 67-SEQ ID NO 99所述的序列。
更佳的，所述的寡核苷酸探针是生物素化的探针。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经 活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例 如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可 将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定 的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸 不含氨基修饰，则其制备方法也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作 手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer, P.O.BROWN.Exploring themetabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science, 1997 ； 278 680 和马立人，蒋中华主编.生物芯 片.北京化学工业出版社，2000，1-130。
本发明的主要优点在于
从日本血吸虫童虫中系统全面地分离获得一类新的miRNA，这些miRNA是调节 日本血吸虫生长发育相关的，能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA 的转录作用，从而影响相应的基因的表达。针对所述新的miRNA，获得了一类反义寡核 苷酸，具有下调所述miRNA的作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例l.miRNA的获得
1.小RNA的提取纯化
日本血吸虫尾蚴经贴片感染实验动物(新西兰大白兔或昆明鼠)，21天后剖杀动 物，获取童虫。
血吸虫童虫标本液氮研磨至粉末状，用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。用 DEPC处理水将无降解的总RNA调整浓度到lmg/ml，加入终浓度为0.5M的NaCl和5% PEG8000,混勻，室温沉淀ΙΟη ι，12000rpm, 4°C, 15min,取上清，加入2.5倍体积的 无水乙醇，混勻，_20°C沉淀Zh以上。然后13000rpm，4°C, 30η ι。弃去上清，沉淀室 温干燥5η ι。加入适量DEPC处理水或者甲酰胺溶解RNA，测定浓度，用于18 30nt 小RNA分离。
2.构建小RNA文库和测序
用15%尿素变性PAGE胶回收18 30nt的小RNA，分别加Illumina' s专有的3'和5'-接头，然后用RT引物逆转录加接头的小RNA，获得cDNA。将纯化的PCR 产物制备成簇，采用Solexa测序技术测序。
3.序列分析
将Illumina/Solexa测序获得的序列去除两端接头和冗余序列，获得小RNA序 列。选择18 30nt长度序列进一步分析。所有同样的序列被计数并从最初的数据库 中删除多余序列，从而得到有相应拷贝数的唯一序列(unique sequences)。将获得的唯 一序列比对(BLAST)日本血吸虫(S.japonicum)的基因组数据库(http://lifecenter.sgst. cn/schistosoma/cn/schistosomeBlast.do)。曼氏血吸虫基因组数据库(S.mansoni) (http:// www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni)也用于辅助解析获得的序列。若与报道的序列存在 3个或3个以上碱基差异将不进一步分析。在排除rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA及 mRNA序列之后，剩余的小RNA序列进一步二级结构预测。从基因组选择包括候选序列 2端约IOObp的侧翼序列，应用RNA 二级结构预测软件Mfold (http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/mfold)分析形成稳定茎环结构可能。
本发明人以表达长度约22nt且存在典型茎环结构的小非编码RNA定义为 miRNA。 同时，由于Solexa测序能够获得低丰度的miRNA*序列，本发明人将相应 miRNA*序列的获得作为miRNA鉴定的有力证据。
4.结果
通过以上分析，共获得33条新的成熟miRNA，其序列如SEQ ID NO: I-SEQID NO 33 (表1)所示。这些miRNA的前体序列如SEQ ID NO 34-SEQ ID NO 66 (表2)所示。
表1 33条新的成熟miRNA序列
权利要求
1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自(i)序列如SEQIDNO η所示的miRNA，其中η为选自1_33的正整数；或(ii)与SEQIDNO η所示序列互补的miRNA。
2.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA分离自日本血吸虫。
3.—种分离的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA选自(A)序列如SEQID NO (n+33)所示的前体miRNA，所述的前体miRNA可在日本 血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO η所示的miRNA，其中η为选自1_33的正 整数；或(B)与SEQID NO (n+33)所示序列互补的前体miRNA。
4.权利要求1所述的miRNA的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸选自(a)序列如SEQID NO (n+66)所示的寡核苷酸，其中η为选自1_33的正整数；或(b)与SEQID NO: (n+66)所示序列互补的寡核苷酸。
5.如权利要求4所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸是核酸锁 (LNA)修饰的寡核苷酸。
6.如权利要求4所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸是硫代修饰磷酸 二酯键骨架的寡核苷酸；或者所述的寡核苷酸是2'-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟 嘧啶修饰的寡核苷酸。
7.—种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被日本血吸虫细胞转录成 前体miRNA，所述的前体miRNA能在日本血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO η所示的miRNA，其中η为选自1_33的正整数。
8.如权利要求4-6任一所述的反义寡核苷酸的用途，用于制备抑制日本血吸虫生长发 育或杀灭日本血吸虫的组合物。
9.一种抑制日本血吸虫生长发育或杀灭日本血吸虫的组合物，其特征在于，所述的 组合物含有有效量的如权利要求4-6任一所述的反义寡核苷酸；以及药学上可接受的载 体。
10.—种体外非治疗性的、抑制日本血吸虫生长发育或杀灭日本血吸虫的方法，其特 征在于，所述的方法包括将给予日本血吸虫或感染日本血吸虫的宿主有效量的如权利 要求4-6任一所述的反义寡核苷酸，其中所述的宿主不是人。
全文摘要
本发明涉及日本血吸虫miRNA及其用途。具体地，本发明公开了一类新的从日本血吸虫中分离获得的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA的转录作用，从而影响相应的基因的表达。本发明还提供了鉴定到的日本血吸虫miRNA及其前体序列、调节所述miRNA表达的反义寡核苷酸等在日本血吸虫病诊断和防治中的用途。
文档编号A61K48/00GK102021165SQ20091019539
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者孙军, 汪章勋, 潘卫庆, 薛向阳 申请人:同济大学