表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株rDEVTK-EGFP及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株rDEVTK-EGFP及其构建方法和应用，其中所述疫苗株rDEVTK-EGFP的微生物保藏号是：CGMCC No.9456。本发明利用重组克隆技术，将包含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和sCMV启动子序列的基因片段sCMV-EGFP插入到鸭瘟病毒的TK基因区中，构建获得在TK基因相应位置插入sCMV-EGFP表达盒的重组EGFP鸭瘟病毒，该重组病毒稳定表达EGFP基因。本发明还涉及构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法，以及重组鸭瘟病毒疫苗株在制备预防鸭瘟和其他禽类传染病的疫苗中的应用。
CGMCC No.9456
2014.07.08
【专利说明】表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株 rDEVTK-EGFP及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重组病毒疫苗株，尤其涉及一种能够稳定表达外源基因的重组鸭瘟病 毒株rDEV TK-EGFP及其构建方法和应用，本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 鸭瘟又称鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE)，是由鸭瘟病毒（又称鸭肠 炎病毒（Duck enteritis virus, DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类感染的一种急性、热 性、接触性传染病。其主要特点是流行广泛,传播迅速,发病率及死亡率高,不同日龄的鸭均 易感，给养鸭业造成巨大经济损失，是危害养鸭业的重要疫病之一。
[0003] 鸭瘟病毒的自然感染仅限于雁形目的鸭科成员（鸭、鹅、天鹅等）。传染源主要是 病鸭、病鹅、带毒的家禽及野生水禽。水是本病的自然传播媒介，吸血昆虫可能是本病潜在 的传播媒介。感染该病的康复禽有可能成为带毒者，并周期性排毒。鸭瘟病毒与其它疱疹病 毒一样，DEV的潜伏和激活都可以引起该病在家养和迁徙水禽中爆发。病毒的感染与品种、 年龄和性别无关，成年鸭感染率较幼鸭高。但近年来发现DEV的感染朝低龄化方向发展，且 鹅的感染率不断增高，发病率和死亡率多在80 %以上。鸭瘟病毒只有一个血清型。免疫接种 是防治该病的最有效手段。目前国内外预防鸭瘟使用较广泛的是弱毒疫苗，此类疫苗具有 免疫效果好、免疫保护力产生快的特点，在高发季节来临前给鸭群进行免疫注射能有效预 防该病。当疫情发生时，在开始初期应当立即对于鸭群中未出现症状的鸭进行紧急免疫接 种，可以防止疫病的进一步扩散，对于控制疫情、降低经济损失具有显著效果。然而，随着畜 禽集约化养殖业的发展，单价疫苗已显示出其一定的弊端，多次免疫的防控措施费时费力， 多价联合疫苗便成为养殖业最受欢迎的疫病防控产品，因而开展禽病多价联合疫苗成为必 然选择。
[0004] DEV为疱疹病毒，其基因组为双股线性DNA，大小约为168Kb，由共价结合的两个区 域组成，包括长独特区（UL)和短独特区（US)。2009年Li等首次报道DEV VAC株的全基因 组序列，同年，Liu等报道了由DEV VAC株致弱株DEV Clone-03大多数ORF序列（Liu et al.，2009)。序列分析表明DEV VAC基因组的构型为D型基因组（Li et al.，2009)，基因 组结构为：UL-IRS-US-TRS。共包括78个开放读码框（ORF)，其中有65个ORF位于UL区， 11个ORF位于US区，另外2个ORF (ICP4和IE180)则分别位于IRS区和TRS区（Wu et al.，2012)。
[0005] 疱疹病毒基因组包含大量的复制非必需基因，包括TK、gC、gG、gK、USl、US2、US10、 UL41、UL42、US7和US8等。在相关研究中将外源基因插入或替代疱疹病毒的非必须基因， 构建重组病毒疫苗，这被认为是一种良好的重组活疫苗病毒载体，目前有关疱疹病毒作为 载体的报道包括伪狂犬病载体、传染性喉气管炎病毒载体、马力克氏病毒载体以及火鸡疱 疹病毒载体等。随着鸭瘟病毒研究的不断加深，以DEV为病毒活载体受到更加广泛的关注， DEV作为载体的优势在于该病毒宿主范围较窄，对鸡、火鸡、鸽和哺乳动物均无致病性，不会 对非宿主动物和人的健康安全造成影响。鸭瘟病毒可在非自然宿主如鸡体内一过性复制而 带动外源基因的表达，因此利用鸭瘟病毒作为载体表达鸡源病原的保护性抗原，是开发DEV 病毒活载体疫苗的新思路，具有重要的应用前景。目前，针对DEV病毒载体研究进展顺利， Wang利用BAC技术将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入至鸭瘟病毒gC基因中，成功构建表 达表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒（Wang et al.，2011)。Liu等将H5N1 亚型禽流感病毒HA基因插入鸭瘟病毒UL41基因中以及US7与US8基因之间，构建两株表 达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒，免疫鸭群后均可以对DEV和H5N1亚型禽 流感病毒产生免疫保护（Liu et al.，2011)。但是，目前利用DEV非必须基因 TK位点开展 外源基因的重组病毒构建和应用均未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题之一是提供一种构建表达增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株的方法；
[0007] 本发明所要解决的技术问题之二是提供一种有所述方法制备得到的表达增强型 绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟病毒重组疫苗株；
[0008] 本发明所要解决的技术问题之三是提供所述鸭瘟病毒重组疫苗株在制备预防鸭 瘟的重组鸭瘟疫苗中的应用。以及所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟以及其它禽类传 染病的重组疫苗中的应用。
[0009] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段来实现的：
[0010] 本发明的一种构建表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方 法，其特征在于在TK基因3'端HpaI位点插入了包含SCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因序列的基因片段sCMV-EGFP，构建获得在TK基因相应位置插入sCMV-EGFP表达 盒的鸭瘟重组病毒株。
[0011] 在本发明中，优选的，构建表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒 株的方法包括以下步骤：
[0012] (I)PCR扩增获得鸭瘟病毒基因组TK及其两侧的侧翼序列，并将可供病毒识别的 真核启动子sCMV启动子以及EGFP基因插入TK基因的3'端HpaI位点，构建获得含有EGFP 表达盒的重组转移载体，命名为pTK-EGFP。
[0013] (2)提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA ;
[0014] (3)利用步骤⑴中获得的重组转移载体pTK-EGFP与步骤⑵中获得的鸭瘟病毒 基因组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病 毒，再经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株rDEV TK-EGFP。
[0015] 其中，优选的，步骤（1)中重组转移载体pTK-EGFP是通过以下方法构建得到的：
[0016] (1)根据DEV病毒基因组TK基因序列及其侧翼序列，应用Oligo 6. 0软件设计1 对引物，引物序列如下：
[0017] Tl (上游）：5，-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3，
[0018] T4 (下游）：5，-AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3，
[0019] (2)应用所述引物扩增DEV TK基因及其侧翼序列，并将其克隆至pMD18-T Simple 载体中，构建质粒pTK;将包含sCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因序列的基因 片段sCMV-EGFP插入载体pTK中的Hpa I位点，构建转移载体pTK-EGFP，优选的，所述sCMV 启动子来源于PCS2+质粒，优选的，在EGFP基因两端加入了 Hind III和Stu I限制性内切 酶位点,可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。
[0020] 在本发明中，优选的，所述的包含sCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因 序列的基因片段sCMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示（图2)，扩增获得的DEV TK 基因及其侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示（图1)。
[0021] 进一步的，本发明还提出了按照所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株。
[0022] 在本发明的一个具体实施例中，一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因 的鸭瘟重组病毒株，命名为rDEVTK-EGFP株，分类命名为Duck Anatid Herpesvirus，保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中 科院微生物研究所，保藏日期为2014年7月8日，其微生物保藏号是：CGMCC No. 9456。
[0023] 更进一步的，本发明还提出了所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟或在制备预 防鸭瘟及其它禽类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应用，包括将所述的表达增强型绿色荧光蛋 白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为导致其他禽类 传染病的病毒的基因，优选的，所述的其它禽类传染病包括能够引起包括鸭、鹅在内的雁形 目禽类以及鸡的病毒性传染病。
[0024] 优选的，所述的导致其他禽类传染病的病毒的基因包括禽流感病毒HA基因、新城 疫病毒HN基因。
[0025] 在本发明优选的实施方案中，利用构建的重组转移载体将EGFP基因替换为其他 基因如禽流感病毒HA基因或新城疫病毒HN基因等，与TK基因缺失表达EGFP重组鸭瘟病 毒基因组共转染鸡胚成纤维细胞CEF，获得稳定表达其他外源基因（禽流感病毒HA基因或 新城疫病毒HN基因等）的鸭瘟重组病毒株。
[0026] 在本发明的一个具体实施例中，公开了一种用于预防鸭瘟以及禽流感的二价疫 苗，其特征在于含有稳定表达禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达 禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到：将所述的表达增强型绿色 荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为禽流感 病毒HA基因，即得。
[0027] 在本发明的另一个具体实施例中，公开了一种用于预防鸭瘟以及新城疫的二价疫 苗，其特征在于含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达 新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株通过以下方法构建得到：将所述的表达增强型绿色 荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为新城疫 病毒HN基因，即得。
[0028] 本发明弱毒株应用范围较宽，例如，可应用于制备成预防鸭瘟或其他禽类病原的 多价联合疫苗（活苗或灭活疫苗）等。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为本发明重组鸭瘟病毒株基因组TK基因插入位点及缺失的TK核苷酸序列；
[0030] 图2为本发明重组鸭瘟病毒株基因组TK基因内部插入的sCMV启动子和增强型绿 色荧光蛋白（EGFP)的基因序列；
[0031] 其中下划线序列为SCMV启动子的基因序列，灰色字体所示的序列为增强型绿色 荧光蛋白（EGFP)的基因序列。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 实施例1转移载体的构建
[0034] 根据DEV病毒基因组TK基因序列及其侧翼序列（GenBank登陆号为AY963569)，应 用Olig 0 6. 0软件设计1对引物，引物序列如下：
[0035] T1 (上游）：5，-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3，
[0036] T4 (下游）：5，-AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3，
[0037] 首先应用引物Tl (上游）和T4(下游）扩增DEV TK基因及其侧翼序列（SEQ ID NO: 1所示），并将其克隆至pMD18-T Simple载体中，构建质粒ρΤΚ ;将带有sCMV启动子的 EGFP表达盒（SEQ ID NO: 2所示）插入载体ρΤΚ中的Hpa I位点（图1所示），构建转移载 体pTK-EGFP。其中，所述sCMV启动子来源于pCS2+质粒，并且在扩增时在EGFP基因两端加 入了 Hind III和Stu I限制性内切酶位点，可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。
[0038] 实施例2鸭瘟病毒基因组的提取
[0039] 将DEV Clone-03细胞毒以0. 001个MOI接种于铺满CEF单层的5mL细胞瓶中（鸡 胚成纤维细胞的制备参照《体外培养的原理与技术》操作（薛庆善，2001) )，37°C吸附2h， 弃掉病毒液，换DMEM细胞维持液（含2 % FBS)，待细胞病变达到80 %?90 %后，弃掉细胞 维持液，加入细胞消化液（1860μLSTE;100μL10%SDS;40μL蛋白酶K20mg/mL)，37°C 消化过夜，加入等体积酚抽提一次，等体积酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等体积氯仿抽提一 次；加入1/10体积NaAC(3M，pH5. 2)，2. 5倍体积无水乙醇，置于-20°C沉淀过夜，4°C离心 15min，风干后加入适量去离子水溶解病毒基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整 性，储存于_2〇°C备用。
[0040] 实施例3转染
[0041] Day 1 :准备细胞
[0042] 预先将CEF细胞传代并铺于5mL细胞瓶中，37°C 2%恒温培养箱培养。
[0043] Day 2 :转染
[0044] (1) ·于转染前3_4h更换细胞培养液
[0045] (2).转染体系：A液：18 μ L 2M CaC12, IOyg DNA (转移载体与病毒基因组比例为 3:1)，加去离子水补足体积至 150 μ L。B 液：150 μ L 2XHepes Buffered Saline(HBS)
[0046] (3).用移液器将A液逐滴加入B液，在加 A液的同时利用另一个移液器向B液中 缓慢吹入空气，此过程应在l_2min之内完成。
[0047] (4).将A B混合液置于室温孵育30min。
[0048] (5).将混合液加入细胞培养液中。
[0049] (6).将细胞置于37°C 2%恒温培养箱培养中继续培养。
[0050] Day 3 :更换细胞培养液并对细胞进行休克
[0051] (1).更换细胞培养液。
[0052] (2) ·用I X PBS轻洗细胞2次。
[0053] (3).利用DMSO对细胞进行休克。
[0054] 1)用 IXPBS 配制 15% DMS0。
[0055] 2)将2mL DMSO休克液加入轻洗后的细胞中。
[0056] 3)室温孵育 2. 5min。
[0057] 4)弃掉DMSO加入新鲜的细胞培养液。
[0058] (4).将细胞置于37°C 5% C02恒温培养箱培养中继续培养。
[0059] 1)用 IXPBS 配制 15% DMSO 休克液。
[0060] 2)将2mL DMSO休克液加入轻洗后的细胞中。
[0061] 3)室温孵育 2. 5min。
[0062] 4)弃掉DMSO休克液加入新鲜的细胞培养液。
[0063] 细胞置于37°C，5 % C02恒温培养箱培养中继续培养。每天观察至出现细胞病变 (CPE)，荧光显微镜下观察是否有表达绿色荧光蛋白的CPE，待CPE达到80 %?90 %后收获 病毒，反复冻融3次，作为蚀斑纯化的种毒，储存于-70°C备用。
[0064] 实施例4重组病毒的筛选及鉴定
[0065] 将收获的含有重组病毒的病毒液用无血清DMEM做KT1?KT4稀释，将生长良好的 CEF细胞单层用PBS轻洗3次，加入病毒稀释液，37°C孵育a后，吸弃病毒液，加入DMEM培 养基（含1%低熔点琼脂糖，10% FBS)，室温放置30min培养基凝固后，移入37°C 5% C02 恒温箱中继续培养。待蚀斑出现后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达进行重组病 毒蚀斑的筛选，待蚀斑增长至合适大小，挑取表达荧光蛋白的蚀斑于无血清DMEM中，反复 冻融三次后，再次接种于CEF细胞继续进行蚀斑纯化。重复以上步骤，经过3轮蚀斑纯化， 获得纯净的重组病毒。将纯化的重组病毒反复冻融三次，取200 μ L病毒液提取重组病毒基 因组，方法如下：取200yL病毒液，加入5yL蛋白酶K(20mg/mL)和20yL 10% SDS，置于 56°C水浴消化2h;等体积酚氯仿（1:1)抽提一次，加入等体积氯仿抽提一次；加入1/10体 积NaAC(3M，pH5. 2)和2. 5倍体积无水乙醇，置于-20°C 15min后，4°C，离心15min收集病毒 基因组，加入适量去离子水溶解后，以该重组病毒基因组为模板，利用引物T1+T2对重组病 毒进行PCR初步鉴定，PCR产物经0. 9 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段，将其克 隆至PMD18-T载体，经筛选鉴定后阳性质粒进行测序，结果与SEQ ID NO: 2所示序列一致， 说明构建成功。
[0066] 实施例5重组病毒稳定性的测定
[0067] 1、生长稳定性（复制动力学/ 一步生长曲线）
[0068] 将预先制备好的CEF细胞传代并铺于12孔细胞培养板中，计算细胞数量。待细 胞长成单层后，将重组病毒以0. 001个MOI接种于生长良好的CEF单层，37°C孵育2h，弃掉 病毒液，加入DMEM细胞维持液（含2% FBS)置于37°C 5% C02恒温培养箱培养。分别于 12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后收获病毒，每个时间点做3个平行重复，反复冻融三 次，-20°C贮存备用。
[0069] 将不同时间点收获的病毒液做KT1?10_7倍稀释。将病毒原液与无血清DMEM细 胞培养液以1 :1〇的比例充分混匀。吸取100 μ L病毒稀释液加入至装有900 μ L无血清 DMEM细胞培养液的EP管中，重复以上步骤直至病毒稀释至KT7倍，将病毒稀释液接种于预 先铺满CEF单层的96孔细胞培养板中，每个稀释度8个重复，37 °C孵育2h，弃掉病毒液，每 孔加入IOOuL的DMEM细胞维持液（含2% FBS)。每个时间点收获的3个不同孔的病毒 液按照以上方法进行平行测定。12h后开始观察细胞病变情况，连续观察，7d后判定结果。 按照Karber法计算病毒的TCID 5tl。统计所有时间点病毒液的TCID5tl，同时对亲本病毒DEV Clone-03的生长规律进行平行测定，以0. 001个MOI接种于生长良好的CEF单层，分别于 接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后收获病毒，每个时间点做三个平行重复。经 测定，rDEV TK-EGFP在7此收获的重组病毒滴度最高，为106 8TCID5(l/mL，随着感染时间的 增加，病毒的复制对细胞的损伤越来越大，活细胞数目逐渐减少，导致病毒的复制由于宿主 细胞的死亡而受到抑制，病毒滴度在72h达到最高后逐渐下降。亲本病毒DEV Clone-03在 72h收获的滴度达到最高，为107 9TCID5(l/mL，随着感染时间的增加，其滴度逐渐下降。可见 rDEV TK-EGFP重组病毒增殖滴度较亲本野毒稍有下降，但其滴度仍可达到106 8TCID5(l/mL。
[0070] 2、重组病毒遗传稳定性测定
[0071] 将重组病毒接种于CEF细胞连续传代。将重组毒以0. 001M0I接种CEF细胞，37°C， 5 % C02孵育2h，弃掉病毒液，加入DMEM细胞生长维持液（含2 % FBS)。荧光显微镜下观察 绿色荧光蛋白的表达，当CPE达到80 %?90 %时收获病毒。连续传代至25代，每5代进行 鉴定。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定和序 列测定，结果表明，重组病毒经连续传代均能保持遗传稳定性。
[0072] 本发明的一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株，命 名为rDEVTK-EGFP株，分类命名是Duck Anatid herpesvirus,保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所， 保藏日期为2014年7月8日，其微生物保藏号是：CGMCC No. 9456。
[0073] 本发明将外源基因插入鸭瘟病毒TK基因内部，以EGFP基因为报告基因，在报告基 因插入的同时造成TK基因的缺失，构建表达绿色荧光蛋白的TK缺失鸭瘟重组病毒。为了验 证本发明作为重组模式病毒在TK基因内部插入其他外源基因的可能性与表达蛋白的有效 性，通过本发明构建重组病毒的方法相继构建了稳定表达禽多种疫病病原免疫原基因，如 禽流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因，并将不同重组病毒作为抗原免疫上述病原宿主动 物均激发产生相应病原免疫原蛋白的抗体，说明利用本发明获得的稳定表达其他外源基因 的重组鸭瘟病毒株和构建稳定表达其他禽类病原外源基因的重组鸭瘟病毒疫苗株的方法， 能够制备获得预防鸭瘟和其他禽类传染病的重组疫苗，具有广泛应用价值。为印证本发明 获得的重组病毒株和构建方法在制备预防鸭瘟和其它禽类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应 用，通过以下实施例和实验例来进一步阐述本发明的应用，但应该理解的是，以下实施例和 实验例只是举例说明的目的，并不意味着限制本发明的范围和精神。
[0074] 实施例6稳定表达禽流感病毒HA基因的重组病毒的构建及免疫效力评价
[0075] 1、稳定表达禽流感病毒HA基因的重组病毒的构建
[0076] 携带禽流感病毒HA基因的质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建并保 存，应用01 igo 6. 0软件设计HA基因引物，上游引物引入Hind III位点，下游引物引入Stu I位点。利用限制性内切酶Hind III和Stu I处理pTK-EGFP转移载体，敲除EGFP基因， 质粒骨架仍带有TK侧翼序列和可供病毒识别的真核启动子sCMV启动子，将预先处理的带 有Hind III和Stu I粘性末端的禽流感病毒HA基因插入pTK骨架中，构建含有HA表达盒 的转移载体ρΤΚ-ΗΑ。具体地，利用Hind III和Stu I对pTK-EGFP质粒和HA片段进行酶 切处理，反应体系（30yL) :dH20:17yL，10XHBuffer:3yL，Xho I 和 Not I:各 lyL，质粒 8 μ L，37°C水浴2h后，经0. 9%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳 后，采用DNA凝胶回收试剂盒（Omega)纯化回收目的DNA片段。将酶切后的载体和HA片段 链接，反应体系为=IOXT 4DNA Ligase Bufferd μ L，T4DNA 连接酶：1 μ L，载体 1.5 μ L，目 的片段6.5 μ L，16°C连接过夜。链接产物转化大肠杆菌TG 1，鉴定并筛选阳性克隆，提取阳 性质粒并经克隆测序，保证序列无误。
[0077] 将rDEV TK-EGFP重组病毒以0.001个MOI接种于铺满CEF单层的5mL细胞瓶 中，37°C孵育2h，弃掉病毒液，换DMEM细胞维持液（含2% FBS)，待细胞病变达到80%? 90%后，弃掉细胞维持液，加入细胞消化液（1860yL STE ;100yL10% SDS ;40yL蛋白酶K 20mg/mL)，37°C消化过夜，加入等体积酚抽提一次，等体积酚氯仿（I: 1)抽提一次，加入等 体积氯仿抽提一次；加入1/10体积NaAC (3M，pH5. 2)，2. 5倍体积无水乙醇，置于-20°C沉淀 过夜，4°C离心15min，风干后加入适量去离子水溶解rDEV TK-EGFP基因组DNA。
[0078] 采用转染试剂，将转移载体pTK-HA与rDEVTK-EGFP基因组DNA共转染至CEF细胞， 方法同实施例3,获得鸭瘟重组禽流感HA重组病毒rDEVTK-HA，重组病毒的筛选和纯化方法 同实施例4,对重组病毒的鉴定则利用引物T1+T2进行鉴定。同时将重组病毒接种生长良 好的CEF单层，在感染后6h、12h、24h、48h、72h分别收获细胞，弃掉上清，PBS轻洗三次，力口 入RIPA，置于冰上裂解20min后，用细胞刮将细胞刮下，加入1/4体积5 X SDS上样缓冲液， 沸水浴煮沸IOmin,冰上放置5min，进行蛋白质的SDS-PAGE电泳，完毕后按照常规Western blot方法将转膜滤纸和硝酸纤维膜（NC膜）剪成与凝胶同样大小，按照滤纸、NC膜、凝胶、 滤纸的顺序依次叠放在一起，排净气泡，置于半干电转仪中（NC膜侧位于阳极、凝胶侧位于 阴极），40mA、300V转印90min，取出NC膜，经丽春红染色确定转印效果，将转印成功的NC膜 置于含5%脱脂乳的PBS中，37°C封闭lh，PBST洗涤3次，每次IOmin ;以鸡抗禽流感HA抗 体（1:300)为一抗，37°C孵育2h后，PBST洗涤3次，每次IOmin ;以兔抗鸡IgG-HRP (1:5000) 为二抗，37°C孵育2h后，PBST洗涤3次，每次lOmin，DAB显色，待检测的目的片段显色后， 终止反应。结果显示，在重组病毒rDEVTK-HA感染CEF细胞48h后可检测到禽流感病毒HA 基因的表达，72h后HA基因的表达量更多，而接种亲本毒株的CEF细胞和CEF细胞未检测到 相应的蛋白。
[0079] 实施例还依照实施例5的方法对重组病毒rDEVTK-HA进行了生长稳定性和遗传稳 定性的测定，发现重组病毒rDEVTK-HA经连续传代能保持遗传稳定性，并持续表达禽流感 病毒HA蛋白。
[0080] 2、重组病毒rDEVTK-HA接种鸭后的免疫效力评价
[0081] 2.1试验材料
[0082] 2. I. IrDEVTK-HA株重组病毒由本研究团队构建并在CEF细胞增殖，野生鸭瘟强毒 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存鉴定。
[0083] 2. I. 2SPF试验鸭：来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
[0084] 2· 2试验方法
[0085] 将rDEVTK-HA株重组病毒以0. Iml肌肉注射接种15只4周龄SPF鸭，另外15只 作为对照，接种后7天其中10只免疫鸭和10只对照鸭分别肌肉注射途径攻击致死剂量的 DEV强毒株；剩余的5只免疫鸭和5只对照鸭分别采集血清测定流感病毒的血凝抑制价。
[0086] 2. 3、试验结果
[0087] 2. 3. IrDEVTK-HA株重组病毒对DEV强毒的免疫保护
[0088] 用重组病毒免疫鸭后7天，所有免疫组鸭均对强毒攻击产生完全保护，而10只对 照组鸭在攻毒后6天之内均死亡（详见表1)。
[0089] 表I rDEVTK-HA株重组病毒免疫鸭对DEV的免疫保护试验结果
[0090]
【权利要求】
1. 一种构建表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的方法，其特征 在于在TK基因3'端HpaI位点插入了包含sCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基 因序列的基因片段sCMV-EGFP，构建获得在TK基因相应位置插入sCMV-EGFP表达盒的鸭瘟 重组病毒株。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) PCR扩增获得鸭瘟病毒基因组TK及其两侧的侧翼序列，并将可供病毒识别的真核 启动子sCMV启动子以及EGFP基因插入TK基因的3'端HpaI位点，构建获得含有EGFP表 达盒的重组转移载体，命名为PTK-EGFP ; (2) 提取鸭瘟病毒的完整基因组DNA ; (3) 利用步骤（1)中获得的重组转移载体pTK-EGFP与步骤（2)中获得的鸭瘟病毒基因 组DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，通过荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的病毒，再 经过病毒蚀斑纯化，获得单一的稳定表达EGFP的鸭瘟重组病毒株rDEV TK-EGFP。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（1)中重组转移载体pTK-EGFP是通过以 下方法构建得到的： (1) 根据DEV病毒基因组TK基因序列及其侧翼序列，应用Oligo 6. O软件设计1对引 物，引物序列如下： Tl (上游）：5' -GACGTGTTGGCATCGGTTC-3' T4(下游）：5' -AAACAAATAGGGAGTAGCGAAGG-3， (2) 应用所述引物扩增DEV TK基因及其侧翼序列，并将其克隆至pMD18-T Simple载体 中，构建质粒pTK;将包含sCMV启动子和增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因序列的基因片段 sCMV-EGFP插入载体pTK中的Hpa I位点，构建转移载体pTK-EGFP，优选的，所述sCMV启动 子来源于PCS2+质粒，优选的，在EGFP基因两端加入了 Hind III和Stu I限制性内切酶位 点，可通过该位点将EGFP替换为其他外源基因。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的包含sCMV启动子和增强型绿色荧光蛋 白（EGFP)基因序列的基因片段sCMV-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，扩增获得的 DEV TK基因及其侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
5. 按照权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP) 基因的鸭瘟重组病毒株。
6. -种稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株，其特征在于所 述的鸭瘟重组病毒株，命名为rDEVTK-EGFP株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No. 9456。
7. 权利要求5或6所述的鸭瘟重组病毒株在制备预防鸭瘟或在制备预防鸭瘟及其它禽 类传染病的重组鸭瘟疫苗中的应用，包括将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋 白（EGFP)基因的鸭瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为导致其他禽类 传染病的病毒的基因，优选的，所述的其它禽类传染病包括能够引起包括鸭、鹅在内的雁形 目禽类以及鸡的病毒性传染病。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中所述的导致其他禽类传染病的病毒的基因包括禽 流感病毒HA基因、新城疫病毒HN基因。
9. 一种用于预防鸭瘟以及禽流感的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达禽流感病毒 HA基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达禽流感病毒HA基因的鸭瘟重组病毒株通 过以下方法构建得到：将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭 瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为禽流感病毒HA基因，即得。
10. -种用于预防鸭瘟以及新城疫的二价疫苗，其特征在于含有稳定表达新城疫病毒 HN基因的鸭瘟重组病毒株，所述的含有稳定表达新城疫病毒HN基因的鸭瘟重组病毒株通 过以下方法构建得到：将权利要求5或6所述的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因的鸭 瘟重组病毒株的增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因替换为新城疫病毒HN基因，即得。
【文档编号】A61P31/22GK104312982SQ201410474947
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】刘胜旺, 李慧昕, 韩宗玺, 孔宪刚 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所