一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组鸭瘟病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于重组病毒疫苗技术领域，具体涉及一种重组鸭瘟病毒转移载体及重组 鸭瘟病毒。
【背景技术】
[0002] 鸭瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV)，又名鸭病毒性肠炎（Duck Enteritis Virus, DEV)为痕疼病毒科（Herpesvirales)、α-痕疼病毒亚科（Alphaherpesvirinae)马 立克病毒属（Mardivirus)成员，能够引起鸭、鶴及其他雁形目禽类发生急性、热性、败血性 为特征的烈性传染病。在自然条件下鸭瘟病毒引起鸭大批发病和死亡，主要见于成年鸭，尤 其是母鸭；不同年龄、性别的鸭均易感，但不同品种鸭的易感性不同。鸭瘟病毒感染后鸭只 的典型病理变化以血管损伤、组织出血、消化道粘膜糜烂为主。目前对鸭瘟病毒的研宄相对 于其他疱瘆病毒较少。
[0003] 当前市场上的鸭瘟病毒疫苗多是通过人工致弱疫苗株来制备，但通过传代致弱的 疫苗株是非克隆变异株的混合物，易回复突变，同时具有一定的神经毒力，易存在潜伏感 染。因此，有必要提供一种更稳定的鸭瘟病毒疫苗株。
[0004] 目前以不同种类病毒作为载体，表达不同病原的外源基因，已成功的应用于人及 动物疾病的预防。研宄表明，疱瘆病毒基因组较大，能够提供多个外源基因的插入位点，或 者替换基非必须区基因，如猪伪狂犬病毒（PRV)成功的表达猪瘟病毒Ε2等外源基因，取得 良好的免疫效果。因此，疱瘆病毒被认为是一种良好的活病毒载体。鸭瘟病毒作为疱瘆病 毒科成员之一，不仅具有基因工程疫苗载体的特点，以其为载体开发的基因工程疫苗在控 制鸭、鹅等水禽疾病具良好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种重组鸭瘟病毒转移载体及应用该载体构建的重组鸭瘟病 毒，使构建的重组鸭瘟病毒制备的疫苗能够同时预防鸭瘟及鸭坦布苏，从而弥补现有技术 的不足。
[0006] 本发明首先提供一种用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段，所述核苷酸 片段是在TK基因同源臂之间插入鸭坦布苏病毒E基因和筛选标记基因；且筛选标记基因的 两侧为IoxP核苷酸序列；
[0007] 作为实施例的优选，上述的筛选标记基因为筛选标记基因 IacZ ;
[0008] 上述的核苷酸片段，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 1 ;
[0009] 本发明另一个方面提供一种重组鸭瘟病毒转移载体，该重组表达载体为插入有上 述用于重组到鸭瘟病毒TK基因上的核苷酸片段的表达载体；
[0010] 作为实施例的优选，该表达载体为PUC57载体。
[0011] 本发明的重组表达载体用于制备重组鸭瘟病毒；是将该重组表达载体以同源重组 方式将所携带的核苷酸片段插入到鸭瘟病毒基因组内的TK基因内，构建能够表达鸭坦布 苏病毒E基因的重组鸭瘟病毒。
[0012] 上述制备的重组鸭瘟病毒用于制备疫苗。
[0013] 本发明通过同源重组的方法获得的重组鸭瘟病毒在神经细胞等非分裂细胞中的 复制能力降低，使得潜伏于神经组织的病毒难以激活，大大降低鸭瘟病毒疫苗株的神经毒 力，从而保证该重组鸭瘟病毒作为疫苗具有更优的安全性。而且，本发明所提供的重组鸭瘟 病毒转移载体利用BrdU及X-gal蓝斑筛选方法，减少重组病毒筛选工作。而且，本发明将 免疫原性基因 E引入到鸭瘟病毒内，从而达到同时预防鸭瘟及鸭坦布苏的目的。
【附图说明】
[0014] 图1 :鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ模式图；
[0015] 图2 :是本发明的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ质粒图谱。
[0016] 图3 :是本发明的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ酶切鉴定结果。
[0017] 图4 :是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ构建流程。
[0018] 图5 :是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ PCR鉴定电泳图谱。
[0019] 图6 :是本发明的重组鸭瘟病毒rDPV-E/lacZ的Westernblot及IFA鉴定。
【具体实施方式】
[0020] 本发明利用分子克隆及同源重组技术，提供一种鸭瘟病毒转移载体的构建方 法及应用，利用该载体通过与鸭瘟病毒发生同源重组，将包含鸭坦布苏病毒E基因 、CMV 启动子序列及BGH polyA序列的基因片段CMV-DTMUV-E-polyA替换鸭瘟病毒（Duck Plague Virus，DPV)TK基因内第248-250位核苷酸，从而构建获得在TK基因内部插入 CMV-DTMUV-E-polyA表达框的鸭瘟病毒基因工程毒株。利用该基因工程毒株可制备鸭 瘟-鸭坦布苏的双价基因工程疫苗，应用于鸭瘟及鸭坦布苏的防制。此外该基因工程病毒 基因组内插入IacZ基因，它不仅可作为一个筛选标记，还可被其他外源基因替换以构建预 防多种疫病的多价基因工程疫苗。另外，在该基因工程毒株的IacZ基因表达盒两侧设计有 IoxP位点，可通过Cre-LoxP重组系统去除IacZ基因，获得不含有筛选标记基因的重组病 毒。
[0021] 以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应理解，所述实施例只是举例说明的 目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0022] 实施例1.鸭瘟病毒核酸的制备
[0023] (1)鸡胚成纤维（CEF)细胞的制备：取9-10日龄鸡胚，置于蛋槽中，气室向上，用 碘酒和酒精棉球由中央向四周涂抹蛋壳除菌消毒；用镊子敲开气室并轻轻去除蛋壳，用弯 头镊子从鸡胚脖子处轻轻挑出鸡胚并放入已经灭菌的细胞培养皿中。依次将头、四肢及内 脏全部取出，用灭菌的PBS冲洗三次，直至胚体发白，然后用眼科剪均匀剪成大约Imm 3的组 织块。加入0. 25%胰酶约5mL置于37°C水浴中消化10_20min，期间每5min摇动一次，当 组织块变得疏松时，中止消化，1000 rpm离心10min，取上清，用灭菌的4-6层纱布过滤，在过 滤液加入细胞培养基DMEM后混匀，制成IO 6-IO7细胞/mL，分装到细胞瓶或六孔细胞培养板 中，放入C02培养箱内培养24-48h。
[0024] (2)鸭瘟病毒接种：在长成致密单层的CEF细胞中，按常规方法接种鸭瘟病毒疫苗 株（CVCC AV1222,中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222,购自中国兽医药品 监察所），注意观察，待细胞出现80-90%病变时收获细胞，并反复冻融三次，将细胞混悬液 分装到I. 5mL Eppendorf管中，-20°C保存备用。
[0025] (3)鸭瘟病毒核酸制备：
[0026] 采用天根生物的TIANamp Virus DNA/RNA Kit，根据说明书进行具体操作。
[0027] 实施例2.鸭瘟病毒转移载体的构建
[0028] (1)所构建的鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ模式图如图1所示，分别在pUC57载 体的Nde I与Hind III酶切位点之间，依次有TK基因同源臂A元件、鸭坦布苏病毒E基因 表达框C元件、筛选标记基因 IacZ表达框D元件及TK基因同源臂B元件。另外在D元件 的两侧设有IoxP序列E元件，图1。
[0029] 具体构建方法如下：
[0030] (2)质粒pUC-LS的构建
[0031] 设计含有IoxP位点的基因序列，在该序列两端分别设计Nde I与Hind III酶切 位点，含两个同向的34bp的Ioxp序列（斜线部分）：
[0032] CATATGAGATCTGAATTCTCGCGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCGAGC TCGCTAGCGGTACCTCTAGATATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGCTGCA GAAGCTT〇将上述合成序列连接到pUC57的Nde I与Hind III位点构建质粒并命名为 pUC-LS〇
[0033] (3)鸭瘟病毒TK基因扩增
[0034] 根据鸭瘟病毒VAC株基因组（GenBank:EU082088. 2)序列，设计扩增TK基因及其 上下游片段的引物：
[0035] TK-F:5' -AACCCCATAGTCGCAATAGTCGTA-3'
[0036] TK-R:5r -TCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3r
[0037] 以提取鸭瘟病毒疫苗株AV1222的DNA为模板扩增含TK基因及其上下游序列的 1982bp片段，连接于pMD18-T载体中，命名为pMD-TK，并进行测序鉴定。
[0038] (4)鸭瘟病毒通用转移载体pDTK-lacZ的构建
[0039] 应用Hind III与Xho I双酶切质粒pMD-TK得到的片段连接到pUC-LS载体相应 的酶切位点内，命名为PLS-TK-L。
[0040] 设计以下引物：
[0041] SV40-F:5' -GAAGATCTAAGAACCAGCTGGGGCTCTA-S r
[0042] SV40-R:5' -CCGCTCGAGCGACGGTATACAGACATGAT-3'
[0043] 以pCDNA3. 1 (+)为模板扩增含SV40启动子及SV40polyA的Neo基因表达框，琼脂 糖凝胶回收后应用Bgl II与Xho I双酶切连接到载体pLS-TK-L内BamH I与Sal I位点 内，构建载体pDTK-L-Neo 〇
[0044] 设计扩增IacZ基因 ORF引物：
[0045] IacZ-F:5' -GCCCGGGATGATAGATCCCGTCGTTT-3'
[0046] IacZ-R:5， -GCTTCGAATTATTTCTGACACCAGACC-3'
[0047] 以质粒pLenti6/V5-GW/lacZ为模板扩增IacZ基因，回收片段应用Sma I与 BstPKM双酶切后连接到载体pDTK-L-Neo相应的酶切位点，替换Neo基因，命名为 pDTK_L_lacZ〇
[0048] 设计扩增同源臂TK-R引物：
[0049] TK-RF:5, -GAAGATCTTCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3,
[0050] TK-RR:5' -CGGGATCCACATAGCAACAACTGACGCAAAAG-3'
[0051] 以质粒pMD-TK为模板扩增TK-R片段，回收后经Bgl II与BamH I双酶切后连接 到载体pcDNA3.1(+)内的Bgl II位点，鉴定连接产物正反向后，选择正向连接的质粒并命 名为 pcDNA-TK-R。
[0052] 设计扩增TK-R及CMV启动子、多克隆位点MCS及BGH polyA引物：
[0053] TK-RF:5, -GAAGATCTTCCCCGGCCATGGTAAAAGATAG-3,
[0054] BGHpA-R:5，-TCCCCCGGGTCAGAAGCCATAGAGCCCACCGCAT-3'
[0055] 以上述构建的质粒pcDNA-TK-R为模板进行扩增，回收片段以Bgl II和Sma I双 酶切后连接到已构建的PDTK-L-IacZ内Bgl II与Nru I位点内并命名为pDTK-lacZ(SEQ ID NO:3)〇
[0056] (5)鸭瘟病毒转移载体pDTK-E/lacZ构建
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