Gx1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗癌药物开发技术领域，尤其涉及一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病 毒载体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌是第四个最普遍的恶性肿瘤疾病，它也是世界各地的癌症相关死亡的第二大 原因（Ferlayetal.，2010)。在胃癌的早期和中期阶段，手术切除是最常见的治疗方法之 一。然而，癌症最终复发，5年生存率仅为20~25 %(Cidonetal.，2013)。随着肿瘤的 生长，它会侵入到周围的组织或器官，并转移到身体的其他部位。虽然联合化疗能使生存率 明显超过单化疗（Wagneretal.，2006)，平均存活期仍然在9到11个月不等（DeVitaet al.，2012)，总生存期仍低，5年生存率为30~36%。
[0003] 新治疗方法的发展仍然是首要任务。在关于多种癌症分子通路的理解方面，其最 近的进展引导了新靶向疗法的发现。这些靶向治疗策略包括表皮生长因子受体抑制剂， 抗血管生成剂，细胞周期抑制剂，细胞凋亡的启动子和基质金属蛋白酶抑制剂（Ngeowet al.，2011)。一些有关细胞生长，侵袭，细胞凋亡，血管生成和转移瘤的因子正逐渐成为许 多常见的恶性肿瘤的有希望的治疗策略。肿瘤血管靶向使抗癌药物更具选择性，通过它 们有针对性的传递，从而提高治疗效率，同时降低全身毒性（Changetal.，2015;Liuet al.，2015;AbdollahiandFolkman, 2010)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法 与应用，旨在开发一种新的、疗效确切的抗癌药物。
[0005] 本发明是这样实现的，一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，该 方法包括以下步骤：
[0006] (l)GXl-PEG2〇00 聚合物的制备
[0007] 将荧光素标记的肽GX1和CH30-PEG2000-C00H按摩尔比1 : (1~5)加入到纯净水 中，37°C反应2~5小时后，将反应液提纯得到修饰后的聚合物GX1-PEG2000 ;
[0008] (2)阴离子脂质体的制备
[0009] 将磷脂、琥珀酸胆固醇单酯以及胆固醇按摩尔比5 :4 :1溶于氯仿中，减压蒸发干 燥4~6小时，将得到的干膜在TES缓冲液中水化，然后在冰水浴条件下超声处理lmin，得 到阴离子脂质体AL;
[0010] (3)通过钙诱导相变方法将腺病毒负载在阴离子脂质体上，得到载有腺病毒的阴 离子脂质体；
[0011] (4)GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备
[0012] 将步骤（1)中得到的聚合物GX1-PEG2000与步骤（3)中得到的载有腺病毒的阴离 子脂质体混合，在37°C下培养2小时后，得到GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体。
[0013] 优选的，在步骤⑴中，所述荧光素标记的肽GX1 ;
[0014] 所述提纯具体为：将反应溶液用分子量为3kD截留量的超滤离心管，在转速为 5000r/min条件下离心10分钟，重复离心四次。
[0015] 优选的，在步骤（2)中，所述琥珀酸胆固醇单酯的制备包括以下步骤：
[0016] A、将胆固醇和琥珀酸酐以及催化剂加入到二氯甲烷中，在65°C、氮气保护条件 下，反应过夜；其中，所述胆固醇、琥珀酸酐、催化剂以及二氯甲烷的摩尔体积比为2_〇1 : 4mmo1 ：lmmol:20ml;
[0017] B、将步骤A中过夜后的反应液进行冷却、过滤后，用蒸馏水萃取；
[0018] C、将步骤B中水萃取后的下层溶液进行蒸发除去溶剂，并在50°C条件下干燥后， 得到琥珀酸胆固醇单酯。
[0019] 优选的，在步骤A中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
[0020] 优选的，在步骤⑵中，所述TES缓冲液包括100mMNaCl、组氨酸2mM、2mMTES，该 TES缓冲液pH7· 4 ;
[0021] 所述超声处理具体为：用功率为200瓦时、以5对5的超声波进行处理。
[0022] 优选的，在步骤⑶中，所述腺病毒为肿瘤抑制基因ΡΤΕΝ表达的缺失El、Ε3的复 制缺陷型的重组腺病毒Ad，该重组腺病毒Ad由VGTC基因技术获得。
[0023] 优选的，在步骤（3)中，所述钙诱导相变方法具体包括以下步骤：将100mM氯化钙 添加到阴离子脂质体AL中，阴离子脂质体AL的终浓度为10mM，在37°C下培养1小时；将培 养液离心，将分离出的沉淀物以腺病毒载体浓缩液和TES缓冲液涡旋10分钟使之悬浮；将 15mMEDTA直接添加到该悬浮液中，pH值至7. 4,将该溶液涡旋10分钟后再培养30分钟后， 得到载有腺病毒的阴离子脂质体。
[0024] 本发明进一步提供上述制备方法得到的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体在 制备抑制癌细胞迀移、癌细胞增殖以及癌细胞血管内皮细胞增殖的药物方面的应用。
[0025] 优选的，所述癌细胞为胃癌细胞。
[0026] -种GX1的寡肽（（噬菌体肽段CGNSNPKSC/GX1)被确定为一个能够结合到人胃肿 瘤血管的识别基序。而且，事实上，已经证实它在体外可以抑制内皮细胞增殖，在体内可以 抑制新血管形成（Huetal.，2014)。Folkman的研究（Folkman，2003)表明，革E1向肿瘤血 管是一种很有前景的肿瘤成像和治疗策略，因为肿瘤生长和转移很大程度上取决于血管生 成。因此，GX1可以同时充当靶向载体和抗血管生成剂，显示出通过靶向血管来治疗人胃癌 的潜力（AbdollahiandFolkman，2010;Chenetal.，2009 ;Folkman，2003)αΡΤΕΝ基因是位 于染色体10q23. 3的一个200kb的肿瘤抑制基因。一些研究报道，PTEN基因失活是与胃癌的 发病率和疾病的进展密切相关的多进程事件。以下为可能的主要机制：首先，PTEN基因对 肿瘤细胞的作用是通过拮抗磷脂酰肌醇3~激酶（PI3K)/Akt信号通路；其次，它也通过下 调粘着斑激酶活性控制细胞粘附，迀移和肿瘤浸润；第三，它可以限制通过负调节丝裂原活 化蛋白激酶（MAPK)介导的信号来抑制细胞分化（Xuetal.，2014;Zaitsuetal.，2015)。
[0027] 同时，以前的研究还表明，PTEN基因具有抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠存活期。因 此，在本发明中，PTEN作为抑癌基因、GX1作为靶向分子可以共同作用于胃肿瘤从而抑制 肿瘤上的增殖和转移，这种方案是可取的（Liuetal.，2012;Lietal.，2013)。另外， 在基因靶向治疗研究中寻找一种安全、高效的基因转移系统是一个关键。以前的研究成 功地通过钙引起的相位变化的方法将腺病毒载体包合到了阴离子脂质体中，从而制备了Ad5和阴离子脂质体的复合物（Ad5~AL)(Zhongetal.，2010)。这种药物传递系统克 服了阳离子脂质体的缺点，如毒性，低传输效率和组织特异性。此外，作为真核细胞膜本 身就存在的部分，阴离子脂质体有较少的细胞毒性，低免疫原性和高水平传导（Zhonget al. , 2010, 2011, 2012) 〇
[0028] 基于上述研究结果，本发明使用钙离子融合法制备阴离子脂质体，应用简单的化 学方法将GX1与PEG2000连接，并且通过SDS-PAGE电泳和荧光强度的检测进行确认；通过 后插入法将双功能多肽GX1连接到阴离子脂质体上面，最终得到由GX1介导的药物靶向给 药系统，即GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体GXl-Ad5-AL(如图1所示）。
[0029] 通过MTT实验考察该给药系统对细胞的增殖抑制作用，transwell实验考察对细 胞迀移的影响，细胞摄取情况考察GX1的靶向作用。结果发现，GXl-Ad5-AL靶向给药系统 对36〇7901和!1爪^(：细胞的增殖抑制率分别是68.36%和64.13%，均高于单独使用6父1 或Ad5-AL;GX1-Ad5-AL对细胞迀移的抑制明显高于GX1 -AL和Ad5-AL;激光共聚焦的结果 中，连接有GX1的药物的摄取效果明显更好，能够抑制胃癌血管内皮细胞和实体胃癌细胞 的生长。
[0030] 由此，本发明GX1能靶向胃癌血管内皮细胞介导腺病毒阴离子脂质体携载抑癌基 因PTEN发挥肿瘤抑制作用。
[0031] 相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明药物递送系统 能显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迀移；并能抑制SGC-7901细胞、血管内皮细胞的人脐静脉 内皮细胞的增殖，这表明它可以抑制肿瘤新生血管，防止肿瘤细胞的营养供应。GXl-Ad5-AL 可能成为一种很有前途的治疗肿瘤的基因传递系