统。
【附图说明】
[0032] 图1是本发明阴离子脂质体腺病毒载体GXl-Ad5-AL的合成路线图；
[0033] 图2是本发明中胆固醇琥珀酸单酯CHEMS的合成路线图；
[0034] 图3是本发明中聚合物GX1-PEG2000的分子结构式；
[0035] 图4是本发明中聚合物GX1-PEG2000的电泳检测图；其中，泳道A为Marker，泳道 B为GX1-PEG2000,泳道C为PEG2000 ;
[0036] 图5是本发明实施例中样品超滤如后的焚光强度对比不意图；
[0037] 图6是本发明实施例中胆固醇琥珀酸单酯1HNMR氢谱图；
[0038] 图7是本发明实施例中胆固醇琥珀酸单酯13CNMR碳谱图；
[0039] 图 8 是本发明实施例中GXl-Ad5-AL、GXl-AL、Ad5-AL以及GX1 对SGC-7901 和HUVEC 细胞的增殖抑制率（n= 3)，*P〈0. 05 ;
[0040] 图9是本发明实施例中细胞迀移实验结果；其中，图A为各组细胞迀移的代表图， 图B为迀移细胞数量各组的对比图；
[0041] 图10是本发明实施例中细胞摄取实验结果；其中，图A为各组细胞激光共聚焦图 像，图B为各组FITC荧光定量数据。
【具体实施方式】
[0042] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0043] 一、材料和方法
[0044] 1、材料
[0045] 荧光素标记的肽GX1购买于陶普有限公司（上海，中国）。CH30-PEG2000-C00H购 买于键凯有限公司（北京，中国）。大豆卵磷脂购买于太尉有限公司（上海，中国）。胆固 醇购买于科龙有限公司（成都，中国）。DHPE购买于Invitrogen公司（美国）。MTT来源于 Amresco有限公司（美国）。RPMI1640培养基和DMEM高糖完全培养基购买于HyClone公司 (美国）。胎牛血清（FBS)购买于四季清有限公司（杭州，中国）。Marker购买于thermo scientific有限公司（美国）。
[0046]2、腺病毒载体
[0047] 肿瘤抑制基因PTEN表达的缺失El、E3的复制缺陷型的重组腺病毒（Ad)由VGTC 基因技术获得。该载体在HEK293细胞以含10%胎牛血清的100单位/毫升青霉素100单 位/毫升链霉素硫酸盐的DMEM高糖培养过程中增值（Sigma，St.路易斯，M0)。当100%的 细胞被病毒感染时，以转速2000r/min离心lOmin，在4°C条件下收集被感染的细胞。病毒 载体由梯度氯化铯两步离心来纯化，并通过在4°C，含10mMTris-HCl(pH8)，2mM氯化镁， 5%的蔗糖的溶液中透析来进行脱盐处理。纯化的病毒分装并冷冻于_80°C。
[0048] 3、细胞
[0049] 人胃癌细胞（SGC-7901)和人脐静脉内皮细胞（HUVEC)分别购于上海细胞研究所， 中国科学院。人胃癌细胞SGC-7901在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640 培养基中培养。人脐静脉内皮细胞在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培 养基中培养。且都在含有5%C02、37°C的培养箱中培养。
[0050] 4、合成琥珀酸胆固醇单酯
[0051] 琥珀酸胆固醇酯的合成反应如图2所示。将胆固醇（0. 7733mg，2mmol)和琥珀酸 酐（0. 4003mg，4mmol)和催化剂4-二甲氨基吡啶（0. 1222mg，lmmol)在二氯甲烧（20ml)在 65°C。在氮气保护下，反应过夜，然后进行冷却、过滤，再以大量蒸馏水的提取。之后，将下 层溶液蒸发除去溶剂，并在在50°C条件下进行干燥，从而得到乳白色固体，产率为96. 8%。 纯化后的产物通过1HNMR和13CNMR验证。
[0052] 5、合成GX1-PEG2000
[0053] 由酰胺键连接形成的复合物GX1-PEG20000 (图3)是通过混合GX1和 CH30-PEG2000-C00H的活性羧基，比例1:5 (摩尔比），在纯净水中，37 °C反应2小时，其中活 性羧基是由EDC、NHS和CH30-PEG2000-C00H在37°C、反应15分钟得到的产物。最后，为了 去除多余的小分子物质，将得到的反应溶液用分子量为3kD截留量的超滤离心管，在转速 为5000r/min条件下离心10分钟。重复离心四次，得到最终纯净的聚合物GX1-PEG20000。
[0054] 6、SDS-PAGE电泳和荧光检测表征复合物GX1-PEG2000
[0055] 为了评估GX1-PEG2000复合物，将制备好的复合物进行SDS-PAGE电泳。简言之， 将掺有适量缓冲溶液的样品沸水浴5min，先以浓缩胶（5% )在电压为90V时进行30分钟， 再以分离胶（12% )在120V时进行1. 5小时。以纯CH30-PEG2000-C00H作为对照。电泳过 后，用0.lmol/L碘进行染色，观察条带。
[0056] 此外，在GX1-PEG2000合成过程中，超滤操作以去除未反应的荧光标记的GX1。因 此，为了进一步确认GX1-PEG2000、判断在超滤装置中的游离小分子GX1和PEG2000是否基 本上被除尽了，将在指定的时间里，用F-7000荧光分光光度计检测超滤装置的外部液体和 内部的标本的平均荧光强度（EX= 488nm;EM= 517nm)。分别进行三次。
[0057] 7、制备GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体（GXl-Ad5_AL)
[0058] 首先，薄膜水化和超声分散技术制备阴离子脂质体AL。脂质混合物由磷脂/ CHEMS/胆固醇（5:4:1，摩尔比）溶于氯仿和在减压下蒸发干燥4-6小时。干膜在TES缓冲 液（100mMNaCl，组氨酸2mM，2mMTES，pH7. 4)中水化，然后在200瓦时，以5对5的超声 波在冰水浴模式下超声处理1分钟。
[0059] 第二，参照先前的报道，通过钙诱导相变方法制备阴离子脂质体的腺病毒载体 (AL-Ad5)。将氯化钙（100mM)添加到先制备好的AL溶液（终浓度为10mM)，再37°C培养1 小时。将所得的沉淀物颗粒通过离心分离，再以病毒浓缩液或者TES缓冲液涡旋10分钟使 之悬浮。将H)TA(15mM)直接添加到该溶液中，再用NaOH调pH值至7. 4。将该溶液涡旋10 分钟后再培养30分钟。
[0060] 最后，将制备好的PEG2000-GX1连接到载有腺病毒的阴离子脂质体，在37°C下培 养2小时从而形设计好的GXl-Ad5-AL制剂（图1)。
[0061] 8、粒度和Zeta电位测定
[0062] 复合物的平均直径，Zeta电位，多分散性指数是通过光子相关光谱法测定的 (PCS)。在测量之前，样品用TES缓冲液稀释，比例为1:3 (v/v)。测量时在25°C，一个固定 角度为90°的条件下进行的。Zeta电位的测定依据是应用smoluchowsky关系时电场中颗 粒的流动性。每次测量时间为2分钟（η= 3)。
[0063] 9、细胞增殖抑制实验
[0064] GX1 -Ad5_AL对细胞增殖的抑制效果的测定是采用ΜΤΤ法将其分别作用于正常 人脐静脉内皮细胞和胃癌细胞SGC-7901细胞株来进行的。简单来讲，即将细胞浓度调整 为1*105个/ml，接种于96孔板（100μL/孔），37°C下培养48小时。然后，细胞分别给予 GX1 (0. 35mM)，GX1-AL(0. 35mM)，Ad5-AL(M0I50)，GXl-Ad5-AL(GXl:0. 35mM，Ad5 :Μ0Ι50) 和空白AL，且所有样品的脂质浓度分别为4mg/mL。
[0065] 培养4小时后，含各制剂的培养基被替换为完全培养基，再培养24小时。每孔中 加入20yLMTT试剂（5mg/mL)，孔板置于黑暗中、37°C孵育4h。除去残留培养基部分，将剩 余的晶体用150μLDMS0溶解。在用酶标仪以吸光度为490nm处测量之前，先在37°C条件 下轻轻晃动培养10分钟。用以下公式计算细胞增殖的抑制率：抑制率=1-(A#S )/ )。每个试验进行了三次，以不给药的为阴性对照，以只含有细胞培养基的为空 白对照。
[0066] 10、细胞迀移实验
[0067] 细胞迀移实验中，将8. 0μm孔径的Transwell小室分别置于24孔板。在迀移实 验之前，将六孔板中的癌细胞SGC-7901分别用PBS，GX1-AL(0. 35mM)，Ad5-AL(M0I50)和 GXl-Ad5-AL复合物