将药物GXl-AL，Ad5-AL 和GXl-Ad5-AL用绿色荧光物质DHPE染色，将细胞核通过蓝色荧光Dapi定位。图10A结果 表明，相比Ad5-AL，GX1-AL和GXl-Ad5-AL更容易进入SGC-7901细胞。荧光强度通过ImageJ 定量分析（图10B)，GX1-AL和GXl-Ad5-AL之间没有显著性差异，而Ad5-AL的荧光强度显 著下降。这一结果表明GX1能提高SGC-7901细胞的细胞摄取能力。
[0100] 三、结论和分析
[0101] 本发明通过以下步骤构建了胃癌靶向给药系统。首先通过化学方法成功的合成 了制备阴离子脂质体的关键材料琥珀酸胆固醇单酯；其次，修饰了PEG2000到多肽GX1上 使之成为多肽聚合物，以助于延长半衰期，提高稳定性和水溶性，降低免疫原性和抗原性 (PasutandVeronese, 2007)。通过SDS-PAGE电泳和测定荧光强度，可以检测GX1是否 成功与PEG2000聚合；最后通过钙离子相位变化法制备阴离子脂质体，通过后插入法将 GX1-PEG2000插入阴离子脂质体。GXl-Ad5-AL联合制剂被设计成为GXl、Ad5和阴离子脂质 体的复合物。
[0102] 在该载药系统中，基于GX1已被证实可以与人胃癌血管特异性结合而挑选它作为 靶向肽。已有研究表明，靶向血管内皮细胞比实质肿瘤细胞具有更多的优势，即血管内皮细 胞比肿瘤实质细胞更稳定，更少可能诱导耐药性。
[0103] 此外，GX1被证实够抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC)抑瘤率为44%(Chenet al.，2009)，在这项研究中本发明也得到了类似的结果，对人脐静脉内皮细胞的抑制率 达到33. 90%。为了增强治疗效果，本发明使用抑癌基因诱导细胞凋亡，采用阴离子脂 质体（Ad5-AL)作为载体，通过阻断抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)/Akt信号通路（Xuet al.，2014)抑制胃癌实体瘤增殖。
[0104] 此外，普通脂质体在体内不稳定，已被降解，为了解决这一问题，本发明将PEG2000 修饰到脂质体表面，以提高制剂的稳定性，减少肽的降解。而且，由于其良好的生物相容性 和低毒性，PEG已被FDA批准用于医疗应用，包括生物材料和生物有用的制备表面改性的偶 联物（Bol'shakovandAkala，2014)。本发明的实验结果表明，本发明所设计的药物递送 系统不仅能抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，而且能抑制血管内皮细胞HUVEC的增殖，这意味 着该给药递送系统可以抑制肿瘤血管生成。本发明可实现对胃癌血管内皮细胞和实体癌细 胞生长的双重抑制作用。
[0105] 复合物GX1-PEG2000通过电泳和荧光强度的测定确认其连接成功，连接率可以通 过测定合成混合物超滤前后的荧光强度变化来检测。利用所构建荧光强度与浓度的标准 曲线，根据标准曲线可以发现荧光物质的总量在反应产物为〇. 48mg/ml(C1)，进行超滤后， 相应的浓度下降到0. 36mg/ml(C2)。超滤前检测到的荧光强度是游离的和聚合的GX1的 混合物，而超滤的目的就是除去其在未连接上的游离的GX1，所以超滤后的的荧光强度即 为聚合GX1(GX1-PEG2000)的荧光强度。因此，对GX1-PEG2000连接率可以计算公式（C2、 C1X100% )，结果为75%，这为进一步的实验提供了充分的基础。
[0106] 从MTT实验结果可以看到，这种药物递送系统不仅可能损害人类胃癌细胞株，也 可抑制人脐静脉内皮细胞。这一结果表明，可以通过从肿瘤新生血管在肿瘤局部注射肿瘤 细胞减少营养供应，提高肿瘤的治疗效果。
[0107] 综上所述，本实验能够证明GX1介导腺病毒-阴离子脂质体携载肿瘤抑制基因 PTEN的靶向递药系统（GXl-Ad5-AL)的成功构建，这种药物靶向输送系统证实了对肿瘤细 胞增殖抑制和胃癌血管内皮细胞迀移的抑制是有效的。
[0108] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以 下步骤： (1)GX1-PEG2000聚合物的制备 将荧光素标记的肽GX1和CH30-PEG2000-C00H按摩尔比1 : (1~5)加入到纯净水中， 37°C反应2~5小时后，将反应液提纯得到修饰后的聚合物GX1-PEG2000 ; (2) 阴离子脂质体的制备 将磷脂、琥珀酸胆固醇单酯以及胆固醇按摩尔比5 :4 :1溶于氯仿中，减压蒸发干燥 4~6小时，将得到的干膜在TES缓冲液中水化，然后在冰水浴条件下超声处理lmin，得到 阴离子脂质体AL; (3) 通过钙诱导相变方法将腺病毒负载在阴离子脂质体上，得到载有腺病毒的阴离子 脂质体； (4)GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备 将步骤（1)中得到的聚合物GX1-PEG2000与步骤（3)中得到的载有腺病毒的阴离子脂 质体混合，在37°C下培养2小时后，得到GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体。2. 如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于， 在步骤（1)中，所述荧光素标记的肽GX1 ; 所述提纯具体为：将反应溶液用分子量为3kD截留量的超滤离心管，在转速为5000r/min条件下离心10分钟，重复离心四次。3. 如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于， 在步骤（2)中，所述琥珀酸胆固醇单酯的制备包括以下步骤： A、 将胆固醇和琥珀酸酐以及催化剂加入到二氯甲烷中，在65°C、氮气保护条件下，反 应过夜；其中，所述胆固醇、琥珀酸酐、催化剂以及二氯甲烷的摩尔体积比为2mmol:4mmol: lmmol：20ml； B、 将步骤A中过夜后的反应液进行冷却、过滤后，用蒸馏水萃取； C、 将步骤B中水萃取后的下层溶液进行蒸发除去溶剂，并在50°C条件下干燥后，得到 琥珀酸胆固醇单酯。4. 如权利要求3所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于， 在步骤A中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。5. 如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在 于，在步骤⑵中，所述TES缓冲液包括lOOmMNaCl、组氨酸2mM、2mMTES，该TES缓冲液pH 7.4 ； 所述超声处理具体为：用功率为200瓦时、以5对5的超声波进行处理。6. 如权利要求1所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于， 在步骤（3)中，所述腺病毒为肿瘤抑制基因PTEN表达的缺失E1、E3的复制缺陷型的重组腺 病毒Ad，该重组腺病毒Ad由VGTC基因技术获得。7. 如权利要求6所述的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体的制备方法，其特征在于， 在步骤（3)中，所述钙诱导相变方法具体包括以下步骤：将100mM氯化钙添加到阴离子脂质 体AL中，阴离子脂质体AL的终浓度为10mM，在37°C下培养1小时；将培养液离心，将分离 出的沉淀物以腺病毒载体浓缩液和TES缓冲液涡旋10分钟使之悬浮；将15mMEDTA直接添 加到该悬浮液中，pH值至7. 4,将该溶液涡旋10分钟后再培养30分钟后，得到载有腺病毒 的阴离子脂质体。8. 权利要求1~7任一项所述制备方法得到的GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体在 制备抑制癌细胞迀移、癌细胞增殖以及癌细胞血管内皮细胞增殖的药物方面的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为胃癌细胞。
【专利摘要】本发明提供了一种GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体及其制备方法与应用，通过将荧光素标记的肽GX1和CH3O-PEG2000-COOH加入到纯净水中反应、提纯得到修饰后的聚合物GX1-PEG2000；将磷脂、琥珀酸胆固醇单酯以及胆固醇溶于氯仿中，干燥，将得到的干膜水化，然后超声处理，得到阴离子脂质体；通过钙诱导相变方法将腺病毒负载在阴离子脂质体上，得到载有腺病毒的阴离子脂质体；最后将聚合物GX1-PEG2000与载有腺病毒的阴离子脂质体混合培养，得到GX1修饰的阴离子脂质体腺病毒载体。本发明阴离子脂质体腺病毒载体能显著抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移；并能抑制SGC-7901细胞、血管内皮细胞的人脐静脉内皮细胞的增殖，表明它可以抑制肿瘤新生血管，防止肿瘤细胞的营养供应。
【IPC分类】A61K48/00, A61K9/127, A61K47/48, A61P35/00, A61K38/08
【公开号】CN105396121
【申请号】CN201510818939
【发明人】钟志容, 刘中兵, 熊丹, 张孝琴, 柯发敏
【申请人】钟志容
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月20日