专利名称:一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的pcr方法
技术领域：
本发明涉及一次同时检测转基因羊两种基因结构的PCR方法，特别针对携带两种外源基因的转基因羊的检测，与常规方法相比，双重PCR方法不仅可节约样本材料，而且可以降低检测成本。
背景技术：
转基因动物是指人工地把外源基因导入动物的受精卵(或早期胚胎细胞)，使之与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。开展家畜转基因新品种培育，需高度重视转基因家畜的生物安全性。因此，对转基因羊外源基因结构的检测是进行安全评价必不可少的。转基因羊外源基因结构检测包括调控元件如启动子、增强子、标记基因、报告基因等的检测和目的基因检测。
绿色突光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白，其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发现清晰可见的绿光；由于检测方便，对生物体基本没有毒性，在很多领域已有取代LacZ，荧光素酶等传统标记方法的趋势，在制作转基因动物过程中更是如此。由于直接检测外源基因在动物体内的表达和分布常常是困难的，因此在制作转基因动物时，一般在目的基因旁边加上一段表达产物易于检测的标记基因(如GFP)，由于GFP发光时不需底物，能对活体进行检测等优点，已作为一种报告基因得到广泛应用。
启动子是指位于转录起始位点上游、确保转录精确而有效起始的DNA序列，是结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，通常还包括促进这一过程的调节蛋白质结合位点。CMV启动子可在多数动物细胞和组织中高效表达，在转基因上已被用于多种功能蛋白或标记基因的启动子，因此对转基因羊进行标记基因GFP和CMV启动子的检测非常必要。
文献检索披露；①冯湘玲等在《生命科学研究》2001，5 (4):339-341.)发表的“一种快速检测启动子特异性的方法”的论文，揭示了利用绿色荧光蛋白(GFP)的特性，与不同的基因启动子连接，并运用显微注射技术制备转基因蟾。根据GFP表达情况，可初步判断启动子的特异性。②纪喜文等在《化学与生物工程》2010，27(9).)上发表的“一种新型转基因斑马鱼毒物检测系统的建立”的论文，揭示了利用转基因技术成功建立一套绿色荧光蛋白(GFP)转基因斑马鱼毒物检测系统。选用芳香烃反应元件AH RDtk片段和pFRMwg+plasmid载体，通过酶切、连接和PCR鉴定等程序成功构建载体DNA，然后通过显微注射转入斑马鱼，经不断传代和筛选得到稳定的、受芳香烃反应元件AHRDtk控制的转基因斑马鱼。③王趁芳等在《畜牧兽医学报》.2009，40 (2):185-190.)上发表的“转基因小鼠的多重PCR快速检测技术“的论文，揭示了采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组DNA，用PCR方法检测其中的外源基因结构如cytomegalovirus (CMV)启动子、hGH polyA终止子及目的基因跨膜蛋白66 ( Transmembrane protein 66,Tmem66),筛选到阳性样品。优化了多重PCR引物退火温度及缓冲液浓度，并探讨了扩增速率对多重PCR的影响。④专利名称为《转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应检测方法》，公开号为CN 101906477A的发明，公开了它根据转红色荧光蛋白基因唐鱼外源红色荧光蛋白基因序列设计引物，建立了快速、有效的能特异性检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的PCR方法。披露的已有技术与本发明有显著差异。[0006]本发明通过慢病毒卵周隙注射，制备了转绿色荧光蛋白基因绵羊，采用苯酚氯仿抽提法快速提取羊尾基因组DNA，用双重PCR方法同时检测标记基因GFP和其中的CMV启动子，得到很好的扩增效果；此转基因检测技术的标准化也将为我国转基因羊的检测、生物安全评价、相关法律法规的制定提供科学依据和技术支撑。
发明内容
本发明的目在于:提供检测转基因羊的PCR方法，特别针对GFP基因及CMV启动子的特异检测；双重PCR方法为我国转基因羊和转基因羊生物安全评价提供科学依据。
本发明的目的是这样实现的:一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计两对特异性引物，其一为GFP-上游引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ；GFP-下游引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二为 CMV-上游引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV_ 下游引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ;以转基因羊基因组DNA为模板，扩增的GFP基因的片段为595bp ;扩增的CMV基因的片段为421bp ；
其中DNA模板的提取:
1)取羊脐带组织的碎块lOOPg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTriS-Cl，pH7.5 ；lmmol/L EDTA, pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ;消化前加入 l00mg/mLRNA 酶 15μ1、lOmg/mL 蛋白酶K 15μ1，不停地摇动，在55°C下消化58_63分钟待用；其中裂解液的配方:取10mmol/LTris-Cl,pH7.5 ；lmmol/L EDTA，pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ;lOOmg/mLRNA 酶；10mg/mL 蛋白酶K，置于试剂瓶中混合均匀即可；
2)取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、异戊醇的混合液，其混合比为25:24:1，混合均匀后置于室温下静置4-5分钟，12000转/分钟、离心8-10分钟，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室温下静置5-6分钟，12000转/分钟、离心10-12分钟待用；
3)取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇，室温静置7-10分钟，沉淀DNA；经12000转/分钟、离心9-11分钟，用ImL 70%乙醇洗涤I次；12000转/分钟、离心1.5-2.0分钟，弃上清，室温静置干燥7-12分钟；加入50μ1 TE，即为10mmol/L Tris-Cl, pH7.4 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ;溶解 DNA，4°C贮存备用；
其中PCR反应体系:
50μ1 反应体系为:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1
;dNTP Mix (2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1; DNA模板 lOOPg/mL 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;总体积为 50μ1 ；
其中PCR反应条件:
94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C延伸7分钟；
其中琼脂糖凝胶电泳检测:
PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，电泳结束、凝胶成像，在595bp和421bp处出现清晰条带。
本发明提供的双重PCR检测方法:包括(I)引物设计根据绿色荧光蛋白(GFP)基因序列和PLEX载体的CMV启动子序列设计两对特异性引物GFP-上游引物、GFP-下游引物；CMV-上游引物、CMV-下游引物:以转基因羊基因组DNA为模板，扩增GFP基因，片段为595bp ;扩增CMV基因，片段为421bp ; (2)模板DNA的提取；(3)PCR反应体系及反应条件设计；(4)琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为80V，凝胶成像等技术特征。
本发明的构思是将单一的PCR方法设计为双重的PCR方法，针对GFP基因及CMV启动子的特异检测，十分高效精准，具有重要的实用价值，彰显技术进步。
本发明结合附图作进一步的说明。
附图为GFP检测结果的对照基因片段图；
如图所述:M: 150bp Marker;水:阴性对照；+:非转基因羊阳性对照；1，2, 4, 6, 8为转GFP基因阳性羊；3，5，7为转GFP基因阴性羊。
具体实施方式
实施例
对转基因羊体内绿色荧光 蛋白基因及启动子同时进行检测的双重PCR方法分步实施:
(一)引物设计
根据绿色荧光蛋白(GFP)基因序列和pLEX载体的CMV启动子序列设计特异性引物GFP-上游引物、GFP-下游引物；CMV-上游引物、CMV-下游引物:
GFP-上游引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC GFP-下游引物 AGGACCATGTGATCGCGCTTCT CMV-上游引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG CMV-下游引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA
以转基因羊基因组DNA为模板扩增GFP基因，以转基因羊基因组DNA为模板扩增CMV基因，非转基因羊基因组DNA为模板无扩增片段出现。
(二)模板DNA的提取
(I)取待检测的转基因羊脐带组织约IOOPg剪碎后(同时以非转基因羊脐带组织做对照)，加入0.5mL的裂解液，其配方为10mmol/LTris-Cl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH7.5 ;lmmol/L EDTA (乙二胺四乙酸);,pH7.5,0.1% (m/V) SDS(十二烷基磺酸钠);临用前加入lOOmg/mLRNA酶15μ1 ;10mg/mL蛋白酶K 15微升，在55°C下消化I小时，其间不时轻轻摇动；
(2)取上述消化物，加入0.5mL的按25:24:1比例混合的酚、氯仿、异戊醇混合物，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟、离心10分钟，取上清液，再用0.5mL氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟、离心10分钟，取上清液；
(3)取上部上清液加入两倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟、离心10分钟；
(4)用lmL70%乙醇洗涤I次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μ1 TE (10mmol/L Tris-Cl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH7.4 ；1 mmol/LEDTA (乙二胺四乙酸)，pH 8.0)溶解DNA，4°C贮存备用。
(三)PCR反应体系
50μ1 反应体系为:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1
;dNTP Mix(2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1;模板DNA(lOOPg/mL) 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;总体积为 50μ1。
(四)PCR反应条件
94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C延伸7分钟。
(五)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增产物在2 %的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，电泳结束后，凝胶成像显示在595bp和421bp处出现清晰条带。
所述的方法，选用的Tris-Cl为三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，EDTA为乙二胺四乙酸，SDS为十二烷基磺酸钠，GFP为绿色荧光蛋白，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RNA酶购自上海生工生 物工程有限公司；蛋白酶K购自Amerisco公司。
权利要求
1.一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，其特征在于:针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计两对特异性引物，其一为GFP-上游引物:TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC ;GFP-下游引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二为 CMV-上游引物:TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下游引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA ；以转基因羊基因组DNA为模板，扩增的GFP基因的片段为595bp ;扩增的CMV基因的片段为421bp ； 其中DNA模板的提取: O取羊脐带组织的碎块lOOPg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTriS-Cl，pH7.5 ；lmmol/L EDTA, pH7.5 ；0.1 % (m/V) SDS ;消化前加入 lOOmg/mLRNA 酶 15μ1、lOmg/mL 蛋白酶K 15μ1，不停地摇动，在55°C下消化58_63分钟待用；其中裂解液的配方:取10mmol/LTris-Cl,pH7.5 ；lmmol/L EDTA，pH7.5 ；0.1% (m/V) SDS ；lOOmg/mLRNA 酶；10mg/mL 蛋白酶K，置于试剂瓶中混合均匀即可； 2)取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、异戊醇的混合液，其混合比为25:24:1，混合均匀后置于室温下静置4-5分钟，12000转/分钟、离心8-10分钟，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室温下静置5-6分钟，12000转/分钟、离心10-12分钟待用； 3)取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇，室温静置7-10分钟，沉淀DNA；经12000转/分钟、离心9-11分钟，用ImL 70%乙醇洗涤I次；12000转/分钟、离心1.5-2.0分钟，弃上清，室温静置干燥7-12分钟；加入50μ1 TE，即为IOmmoI/L Tris-Cl, ρΗ7.4 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ;溶解 DNA，4°C贮存备用； 其中PCR反应体系: 50μ1 反应体系为:10XPCR Taq Buffer 5μ1 ; 25mM MgCl24μ1 ;dNTP Mix (2.5mM each ) 5μ1 ;引物(10ρΜ/μ1)各 0.5μ1; DNA模板 lOOPg/mL 6μ1 ;TaqDNA Polymerse 1.25Μ-1 ; Nuclease-free Water 26.75M-1;总体积为 50μ1 ； 其中PCR反应条件: 94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C延伸7分钟； 其中琼脂糖凝胶电泳检测: PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，电泳结束、凝胶成像，在595bp和421bp处出现清晰条带。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于:选用的Tris-Cl为三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，EDTA为乙二胺四乙酸，SDS为十二烷基磺酸钠，GFP为绿色荧光蛋白，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RNA酶购自上海生物工程有限公司；蛋白酶K购自Amerisco 公司。
专利摘要
本发明提供了一种检测转基因羊转绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计的两对特异性引物分别为GFP-上游引物TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC；GFP-下游引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;CMV-上游引物TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下游引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA；以转基因羊基因组DNA为模板，扩增GFP基因，其片段为595bp；扩增CMV基因，其片段为421bp。本发明将单一的PCR方法设计为双重的PCR方法，可一次检测两种基因结构有独到之处，具有重要的实用价值。
文档编号C12Q1/68GKCN103088114SQ201110345398
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日
发明者张雪梅, 李文蓉, 张宁, 贺三刚, 刘明军 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan