棉花热激转录因子基因GhHsf39的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及的是一个基因工程技术领域的基因启动子及其用途，属于生物技术领 域，具体设及一种棉花热激转录因子基因化化巧9的启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 绝大部分植物不能自主选择生长条件，因此需要根据不断变化的环境条件调整各 种生理活动，W完成必要的生命过程。基因的表达调控主要是通过启动子来实现基因在转 录水平上的变化，从而实现植物生长发育与代谢调节。启动子是位于基因上游的一段特定 区域内的核巧酸序列，一般含多种顺式作用元件，该些顺式作用元件和各种反式作用因子 协同作用，调控RNA聚合酶在特定的时间和空间上对基因进行不同水平的转录。
[0003] 依据植物体内启动子启动基因转录的方式，可将其分为=种；组成型、组织或器官 特异型、诱导型。前两种启动子启动基因的方式是持续性的，无条件的，RNA和蛋白质的表 达是稳定的，因此该两类启动子在利用的时候存在一定的弊端。它们无法从时空上特异的 调控基因的表达，会导致所启动的基因在植物体内持续表达，过度消耗细胞的物质和能量。 例如烟草花叶病毒35S启动子（CaMV35)。它会驱动外源基因在植物的所有组织和器官中持 续高水平表达，很可能会对植物的正常生长造成一定的危害。
[0004] 诱导型启动子的特点是只在某些特定的物理化学或生物刺激出现的时候才启动 或提高基因的表达，该类启动子可队陕速有效地诱导目的基因的"开、关"，可根据需要在植 物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号，启动基因表达；也可W随着刺激的 消除而解除诱导，停止基因的表达。该样不仅能有效地发挥基因的作用，又不会造成植物体 内物质和能量的浪费，因此克隆各种不同的诱导型启动子对于植物基因工程育种具有重要 意义。
[000引 目前，已经在不同植物中有关诱导表达启动子的报道。但是，在棉花上有关受到高 温、干旱W及高浓度盐等逆境诱导表达的启动子还没有报道。本专利W棉花为材料克隆了 P曲hsf39启动子，该启动子在棉花植株遇到不同非生物逆境胁迫时可W快速启动或上调 化服F39基因的表达。此外，本发明通过分子生物学手段建立了 P曲hsf39启动子与报告基 因的表达盒，通过转基因的功能分析，证实其可W作为植物基因工程的有效启动子来控制 不同的目的基因的表达，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一个受非生物逆境诱导的基因的启动子，具体为一种棉花 热激转录因子基因化化巧9的启动子及其应用，为植物抗逆基因工程育种提供支持。该启 动子具有多个特点；（1)可W响应多个不同逆境因素，例如高温、干旱、高盐W及高抑；（2) 启动子具有相应快速的特点；当棉花受到各种非生物逆境胁迫时，化服F39基因启动子会 迅速上调目的基因的表达量；当胁迫消失时，目的基因的表达水平又会迅速降低，恢复到原 来水平。由于P曲hsf39启动子具有快速响应的特点，因而可W有效减少植物的能量消耗。
[0007] 本发明是通过W下技术方案实现的，
[000引第一方面，本发明设及一种核巧酸P曲hs巧9,所述核巧酸的序列如SEQ ID NO. 1所 /J、- 0
[0009] 第二方面，本发明设及一对用于扩增所述核巧酸P曲hs巧9的引物对，序列分别如 沈Q ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示。
[0010] 第S方面，本发明设及一种重组载体，包含所述核巧酸p曲hs巧9,如PMD19-T克隆 载体、重组载体祀arleygatelOl-p曲hsf39::化服F39-YFP等。
[0011] 第四方面，本发明设及一种转化体，包含权利要求1所述的核巧酸P曲hs巧9。
[0012] 优选地，所述转化体采用的宿主为大肠杆菌或农杆菌。
[0013] 第五方面，本发明设及一种所述核巧酸P曲hsf39作为启动子的用途；所述启动子 连接的基因序列的来源可W是同一物种，也可W是不同物种。
[0014] 优选地，所述用途具体为核巧酸P曲hsf39作为启动子调控非生物逆境诱导基因 表达中的应用。
[0015] 优选地，所述用途具体为，W核巧酸P曲hsf39作为启动子，调控基因的表达，进而 实现调控植物抗逆性或调控抗病能力。
[0016] 优选地，所述用途具体为核巧酸P曲hsf39在非生物逆境中进行基因表达调控的 应用，所述应用包括如下步骤：
[0017] 步骤一，将P曲hsf39启动子连接目的基因编码序列并连入表达载体，得重组载 体；
[0018] 步骤二，将所述重组载体转化农杆菌，得农杆菌工程菌；
[0019] 步骤=，将所述农杆菌工程菌转化目标植物，即可实现启动子P曲hsf39在非生物 逆境中对基因表达的调控。
[0020] 优选地，所述目标植物包括烟草。
[0021] 优选地，所述用途具体为核巧酸P曲hsf39作为启动子在植物育种中的用途。
[0022] 优选地，所述用途具体为调控基因的表达具体为调控化服F39基因的表达量。
[0023] 第六方面，本发明设及一种所述核巧酸P曲hs巧9的获得方法，其特征在于，包括 如下步骤；从棉花基因组中克隆热激转录因子基因化化巧9的启动子区域并转化大肠杆 菌，筛选阳性克隆进行DNA测序，用测序所得序列减去化Hsf39基因的序列，即得所述启动 子P曲hs巧9的核酸序列。
[0024] 优选地，所述棉花为陆地棉。
[0025] 本发明具有如下有益效果；本发明提供的化服F39基因启动子，可在植物受到非 生物逆境时迅速启动目的基因的表达；当逆境胁迫消失时，目的基因的表达量又会迅速恢 复，因此基本不会影响植物的整个生长发育过程，可W广泛应用于植物抗逆基因工程育种 中。
【附图说明】
[0026] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0027] 图1是P曲hs巧9启动子的克隆的电泳图；
[002引其中，1是棉花热激转录因子化服F39基因启动子克隆的PCR扩增产物；
[0029] 图2是棉花受到不同的非生物逆境胁迫时，化服F39基因在启动子P曲hsf39调控 下的不同表达变化；
[0030] 图3是瞬时转化重组载体祀arleygatelOl-p曲hs巧9::化服F39-YFP的烟草中 化服F39-YFP的表达及热激后表达情况；
[0031] 其中，A ;热激之前，暗场；B ;热激之前，明场；C ;热激之前，暗明合并；D ;热激之 后，暗场；E ;热激之后，明场；F ;热激之后，暗明合并。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进。该些都属于本发明 的保护范围。
[0033] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆；实验室手册见New York:Cold Spring Harbor L油oratory Press的1989年版 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0034] 本发明设及的农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；农杆菌 介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008, 28(3) ;38-43》文献中公开； 质粒载体祀arleyGatelOl可通过公开市售的商业渠道取得。
[00巧]连施例1热激转录肉子化服F39甚肉的后动子克陈及序列分析
[0036] (l)PCR扩增目的片段
[0037] 根据已经公布的雷蒙德棉（Gossypium raimondU)热激转录因子化服F39基因启 动子区的序列设计引物，扩增产物大小为1711bp。
[0038] 化服F39-pro F(沈Q ID NO. 2) ;5' -TAAAAATAAAATTCGGTTCGAGTAAATG-3'
[0039] 化服F39-pro R(沈Q ID NO. 3) ;5' -AGTCAAGAACGGCGGCGGACCAACCTCG-3，
[0040] 提取陆地棉（Gossypium hirsutum)基因DNA，并稀释至lOOng/ y 1作为模板，利用 上述引物进行PCR扩增。
[0041] (2)目的片段的回收和构建中间载体
[00创通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段（图1)，采用康为世纪公司的快速琼脂糖 凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书。
[0043] 如图1所示，Marker ;DL2000DNA Marker ;1 ;棉花热激转录因子化服F39基因启动 子克隆的PCR扩增产物。
[0044] 将回收的目的DNA片段与TaKaRa公司的PMD19-T克隆载体连接，具体操作步骤见 试剂盒说明书。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞D册a，均匀涂布到含有駿节青霉 素的LB培养基平板上，37°C倒置培养16-20小时。挑取平板上的菌落，摇菌培养，取菌液做 模板进行PCR阳性鉴定。
[0045] 做测序验证
[0046] 经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到上海博尚生物技术有限公司进行DNA测序，将 所得序列减去属于化服F39基因的部分，得到启动子序列，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所 示，命名为p曲hs巧9。
[0047] 连施例2 :D址hs巧9后动子歌动的化服F39甚肉在棉巧中管不同胁化时的表武分 化
[0048] 2. 1棉花幼苗的逆境胁迫处理和RNA抽提
[0049] (1)不同逆境处理棉花幼苗
[0化日]取五叶期的陆地