一种瘤胃绿色荧光蛋白gfp基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌及其构建方法和应用。所述瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌，是含有原核表达载体pET15b-EGFP的瘤胃溶纤维丁酸弧菌；所述原核表达载体pET15b-EGFP是将增强型绿色荧光蛋白EGFP基因亚克隆连接入原核表达载体pET15b的BamH1位点而得到。本发明的瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌可用于瘤胃微生态微循环消化代谢检测。利用GFP基因进行基因操作、标记目标蛋白，即可通过这种生物“摄像头”实时监控靶蛋白的时间、空间变化。
【专利说明】一种瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种反刍动物瘤胃微生态研究检测用的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌的构建方法。
【背景技术】
[0002]众所周知，反刍动物的消化中重要的消化过程之一是瘤胃微生物的消化(朱伟云，2004)。但由于瘤胃微生态研究的难度较大，目前还都局限于营养素在瘤胃中的消化率、瘤胃优势菌群的培养，或用药物控制瘤胃微生物等的研究(Koenig等，2000 ;韩春艳等，2002 ；Hristov等，2004)。对于瘤胃微生态中微生物之间的互作，如细菌与原虫、真菌的共生；原虫对细菌、真菌的吞噬等还都不得而知，其主要原因就是对于这一黑箱还没有更好的研究方法。为此，同位素标记方法也曾经用于瘤胃细菌标记(刘翔等，2010)，但此方法涉及特殊设备并存在一定的环境问题，而不适宜于一般实验室的常规测定使用。我们实验室前期探索的荧光素(Fluorescein)染料标记瘤胃细菌，但研究的也是染色后是静态的死细菌(王梦芝等，2010)，没有所标记细菌的繁殖生长，不能够完全反应瘤胃真实的动态状态。因此亟待解决的关键问题是瘤胃微生态亮化的研究方法。
[0003]在Aequorea victoria水母中发现的绿色突光蛋白GFP只需蓝光激发就能发光。而且GFP其相容性强，没有种属、组织等特异性，通过基因重组水母外的生物也产生了 GFP，如:荧光的菌、鼠、兔、猪等相继培育成功。由于GFP的特殊结构与性能，利用其做生物标记工具的研究逐渐增多(Cha lfie等，1994 ;黄倩和李川源，2001 ；Southward和Surette,2002 ；DeBlasio 等，2010)。
[0004]瘤胃细菌种类繁多,据研究表明有200余种,其中溶纤维丁酸弧菌(ButyrivibriofibrivoIen )具有较宽的底物代谢范围,在瘤胃中广泛存在,是理想的基因受体。目前已经构建成功木聚糖酶基因的溶纤维丁酸弧菌重组菌(Flint和Scott，2000)。若转入绿色荧光蛋白基因，构建绿色荧光蛋白基因工程溶纤丁弧菌，用之即可亮化瘤胃微生态环境，实时、客观记录瘤胃微生态微生物的动态观察，研究瘤胃微生态消化代谢规律和机制。
[0005]本发明即是基于瘤胃细菌GFP工程菌的改造，提供一种能够进行瘤胃微循环检测的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白基因工程菌。
【发明内容】
[0006]为了突破目前不能真实模拟和反应瘤胃微生态的状态，而不能进行客观研究瘤胃微生态互作等的现状，本发明提供一种瘤胃微生态研究用的瘤胃溶纤丁酸弧菌绿色荧光蛋白基因工程菌(RGFPB)的构建方法。
[0007]本发明所述的瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌，宿主菌为瘤胃溶纤维丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表达载体pET15b-EGFP ;所述原核表达载体pET15b_EGFP是将增强型绿色荧光蛋白EGFP基因亚克隆连接入原核表达载体pET15b的BamHl位点而得到。[0008]所述瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌通构建方法是:采用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，PCR扩增其编码序列；将所扩增序列亚克隆连接入原核表达载体pET15b，构建得到pET15b-EGFP ;氯化钙法致敏瘤胃溶维纤酸丁弧菌，转化入所构建的原核表达载体pET15b-EGFP ;转化后平板上培养24~36h，荧光或紫外光下观察，有绿色荧光的菌落则为阳性克隆。
[0009]本发明还公开了所述瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微循环检测中的检测与应用。
[0010]所述的检测，例如瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌绿色荧光蛋白表达性能测试方法为:用液体和固体培养基培养瘤胃GFP基因工程菌24~36h。用722型分光光度计测定(600nm检测)并制作液体培养基中瘤胃GFP基因工程菌生长曲线、用SpectraMaxM5多功能读板机测定液体培养基中工程菌荧光强度(510nm检测)；用荧光显微镜检测固体培养基工程菌RGFPB表达情况。
[0011]本发明的原理是:
[0012]荧光一般是由荧光素(Fluorescein)染料与相应的荧光素酶(Luciferase)特异性合作而发光，同时产生具有毒性氧自由基而损害靶细胞，而具有一定的“光毒性”。GFP发光光毒性弱，适合于活细胞检测，因此研究更接近实态、结果更客观可靠。另外，荧光素染色所研究的细菌也是荧光标记的静态死细胞，没有所标记细菌的繁殖生长，不能够完全反应瘤胃微生态真实的动态状态。而在Aequorea victoria水母中发现的具有Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化结构荧光团(对羟基苯咪唑啉酮)的GFP，只需蓝光激发就能发绿色荧光。目前，GFP基因突变优化改造的研究和应用也已取得较大的进展。三肽中65位Ser被Thr替换后的改造型其荧光增强4倍以上，若利用GFP基因进行基因操作、标记目标蛋白，即可通过这种生物“摄像头”实时监控靶蛋白的时间、空间变化。
[0013]基于以上原理，采用本发明的技术方案，具有以下技术效果:
[0014]本瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌，能够模拟瘤胃微生态的状态，动态地研究瘤胃微生物间的互作。该工程菌的使用将亮化瘤胃微生态，打开瘤胃内微生物蛋白循环的“黑箱”，促进瘤胃微生态及宿主营养代谢的研究。这对于深入研究瘤胃内微生态营养消化代谢机理，有效利用瘤胃微生态营养原理的调控瘤胃营养代谢，节约饲料资源和缓解排放对环境的影响都有一定的参考意义。
[0015]进一步的，本发明和基于上述原理的先前实验室测定方法比较，具有如下优点:
[0016]1)荧光一般是由荧光素(Fluorescein)染料与相应的荧光素酶(Luciferase)特异性合作而发光，同时产生具有毒性氧自由基而损害靶细胞，而具有一定的“光毒性”。而GFP发光光毒性弱，适合于活细胞检测，因此研究更接近实态、结果更客观可靠。
[0017]2)原来使用的荧光素5-DTAF5_ (4，6-二氯三嗪基)所研究的细菌也是荧光染色的静态死细胞，没有所标记细菌的繁殖生长，不能够完全反应瘤胃真实的动态状态。而GFP只需蓝光激发就能发绿色荧光。利用GFP基因进行基因操作、标记目标蛋白，即可通过这种生物“摄像头”实时监控靶蛋白的时间、空间变化。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为感受态转化菌落照片。[0019]图2为紫外灯下液体培养基接种转化细菌照片。
[0020]图3转化菌生长曲线(OD6cicinm)tj
[0021]图4转化菌荧光度随生长变化曲线(OD51tlnm)15
[0022]图5原虫吞噬细菌量与时间的回归分析(35min)。
【具体实施方式】
[0023]本发明包括有以下步骤:1)绿色荧光蛋白GFP基因原核表达载体pET15b构建；2)瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌的构建；3)瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌绿色荧光蛋白表达性能测试；4)置瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌于亨盖特滚管固体培养基中4°C冰箱保存。
[0024]下面对各步骤进行详细阐述:
[0025]本发明的I)步骤中的增强型绿色荧光蛋白GFP基因原核表达载体pET15b的构建方法为:采用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，PCR扩增EGFP编码序列。将所扩增序列直接常规亚克隆连接入原核表达载体pET15b (购自Novagen公司)，以构建能够在细菌中表达的原核表达载体pET15b-EGFP。
[0026]本发明的2)步骤中的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌的构建方法为:氯化钙法致敏溶纤维丁酸弧菌(OD6tltol为0.6时为宜)，溶纤维丁酸弧菌为本实验室从瘤胃中经过亨盖特滚管技术(Hungate，1950)厌氧培养、分离纯化获得并保存。转化入所构建的原核表达载体pET15b-EGFP。转化后平板上39°C厌氧培养24~36h，荧光或紫外光下观察，有绿色荧光的菌落则为阳性克隆(图1)。
[0027]本发明的3)步骤中的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌绿色荧光蛋白表达性能测试方法为:用液体(人工唾液盐+无细胞瘤胃液+葡萄糖2.0%+L-谷氨酰胺1.0%)过夜培养GFP基因工程菌24~36h (图2)。用722型分光光度计测定(600nm检测)并制作液体培养基中工程菌生长曲线(图3)、用SpectraMax M5多功能读板机测定液体培养基中工程菌荧光强度(510nm检测)(图4)。
[0028]本发明的4)步骤中的瘤胃溶纤丁弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌保存方法为:接种瘤胃溶纤丁弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌液于有培养基的亨盖特滚管中，冰上滚管，39°C厌氧培养24~48h后保存于4°C冰箱中。
[0029]采用本发明的工程菌进行多次原虫吞噬试验，其中之一试验如下:
[0030]I)取3头1.5周岁、体重(29.4±2.7)kg、装有永久性瘤胃瘘管的山羊，单圈饲养，以玉米+豆柏+羊草为常规饲粮，每日按体重的2.5%干物质量供料，07:00和19:00分2次等量饲喂，自由饮水。
[0031 ] 2)试验分为添加3%硬脂酸(A组)、油酸(B组)、亚油酸(C组)、α-亚麻油酸(D组)、花生四烯酸(Ε组)、二十碳五烯酸(F组)的试验组和添加3%棕榈酸钙的对照组，每组各设3个重复，另外设I个无底物的空白对照。培养底物组成见表1。
[0032]表1培养底物组成％
[0033][0034]
【权利要求】
1.一种瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌，其特征在于:宿主菌为瘤胃溶纤维丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表达载体pET15b-EGFP ;所述原核表达载体pET15b_EGFP是将增强型绿色荧光蛋白EGFP基因亚克隆连接入原核表达载体pET15b的BamHl位点而得到。
2.构建如权利要求1所述瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌的方法，其特征在于，采用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，PCR扩增其编码序列；将所扩增序列亚克隆连接入原核表达载体pET15b，构建得到pET15b-EGFP ;氯化钙法致敏瘤胃溶纤丁弧菌，OD600nm为0.6时为宜，转化入所构建的原核表达载体pET15b-EGFP ;转化后平板上培养24~36h，荧光或紫外光下观察，有绿色荧光的菌落则为阳性克隆。
3.权利要求1所述瘤胃绿 色荧光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微生态微循环消化代谢检测中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103789249SQ201410054672
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】王梦芝, 经语佳, 高健, 皮宇, 王洪荣, 喻礼怀 申请人:扬州大学