稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒及制备方法和应用，应用包括在解析脑神经环路、乙型脑炎病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选中的应用。
【背景技术】
[0002]人脑是自然界中最为复杂的系统之一，而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研宄而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。
[0003]乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个结构蛋白(C、pr M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型脑炎病毒具有广泛的宿主范围，包括:人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够进入神经系统而引起脑炎。给人类的健康和农业生产带来了巨大损失。目前，有预防该病毒感染的疫苗，对于保障人类的健康和提高农业生产的效率发挥了重要作用。但是，目前还没有有效的药物来特异的治疗该病毒感染引起的疾病。另外，乙型脑炎病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。但是目前尚无能够稳定携带绿色荧光蛋白基因的JEV。而本发明通过一系列的遗传学筛选及反向的多途径分析，获得了能够稳定携带绿色荧光蛋白基因的重组JEV。
[0004]随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研宄提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了具有稳定表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、抗原表位分析、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一种稳定携带绿色焚光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Pr otein，EGFP)基因的乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)全长感染性克隆，其序列为SEQ ID N0:17所示。
[0006]本发明的目的在于提供了一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。
[0007]本发明的目的在于提供了一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可应用于脑科学研宄和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
[0008]为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下:
[0010](I)构建稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆:
[0011]以携带有EGFP的JEV全长感染性克隆质粒pJEFL_EGFP为模板(序列为SEQ IDNO: 10)，使用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所示引物扩增片段 SEQ ID NO: 11;使用 SEQID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示引物扩增片段SEQ ID NO: 14 ;按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。
[0012]使用XhoI+SacI酶切，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 11和SEQID NO: 14片段插入到PJEFL-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为PJEFL-EGFP-N15K，其序列为SEQ IDNO: 17所示。
[0013]稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的应用，包括以下应用:
[0014](I)稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆(pJEFL-EGFP-N15K)制备病毒的能力:
[0015]用KpnI酶切pJEFL-EGFP-N15K，回收被酶切的产物，使用MEGAscript T7Transcript1n Kit分别体外转录酶切后的pJEFL-EGFP成为RNA，并转染BHK21细胞，37°C，5% (v/v)CO2培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。本发明的全长感染性克隆成功制备稳定表达EGFP的重组JEV。。
[0016](2)pJEFL-EGFP-N15K制备的重组JEV在研宄脑神经环路平台中的应用:
[0017]取0.3 μ I重组JEV病毒定位注射到鼠嗅球，分别在感染后5天和7.5天后麻醉动物，用0.9% (V/V)生理盐水灌流，然后用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4%(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然后置于30% (V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻Ih后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。
[0018]所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、大鼠、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。
[0019](3)PJEFL-EGFP-N15K制备的重组JEV在分析抗原表位和抗乙型脑炎病毒药物(抗体药)筛选中的应用:
[0020]在6孔细胞培养板中接种8Χ105ΒΗΚ21细胞/孔，在37°C，5%卜八)0)2培养条件下，汇合度达到90%时。将50 μ I重组JEVPO代病毒液与50 μ I乙型脑炎病毒的抗体混合，37°C吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37°C，5% (v/v) CO2的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。
[0021]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0022]1.本发明制备了稳定表达EGFP的乙型脑炎病毒，其具有可视化的特点，便于开展相关的研宄。目前国内外还没有用于稳定表达绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒，本发明填补了该空白。
[0023]2.本发明对于开展JEV的基础性研宄(如致病机制、复制机制等)和应用性研宄(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；
[0024]3.解析神经环路结构是开展脑科学研宄的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。JEV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研宄。
【附图说明】
[0025]图1为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图。
[0026]A:一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图；
[0027]B:一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的RNA转染BHK21细胞后的荧光表达情况。
[0028]C:一种携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒的产生的plaque形态不稳定；
[0029]D:一种携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒的携带EGFP在扩增的过程中发生丢失。
[0030]图2为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒的筛选示意图。
[0031]A:筛选流程；
[0032]B:筛选获得的稳定表达EGFP的重组JEV的plaque形态特征；
[0033]C:筛选的稳定表达EGFP的JEV重组病毒的全基因组测序分析导致稳定携带EGFP的原因。
[0034]图3为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。
[0035]A:未感染病毒的细胞；
[0036]B:稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒感染BHK21细胞产生的细胞病变；
[0037]C:稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒感染BHK21细胞表达荧光蛋白。
[0038]图4为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒的稳定性检测
[0039]A:一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒的产生的plaque形态稳定；
[0040]B:一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒的在增殖的过程中携带的EGFP基因稳定；[0041 ]C:一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒体外表达EGFP的检测；
[0042]D:一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒体内稳定表达EGFP的检测。
[0043]图5为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒解析鼠脑神经环路的示意图。
[0044]A:在感染后5天稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒标记鼠VPM和皮层区