GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物因及其所编码的蛋白质的应用，特别是涉及一个来源于大豆6^2?似基因及其所编码的蛋白质在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，属于分子生物学和生物技术领域。
【背景技术】
[0002]干旱、低温和高盐等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子，也是影响作物产量的主要非生物胁迫因素。植物中的转录因子有一部分是与抗逆性相关的，当植物受到外界的胁迫时，胁迫信号激发转录因子的表达，然后转录因子与相应的顺式作用元件结合，启动特定基因的转录表达，引起植物生理生化的变化，从而提高植物的抗逆性。近年来，相继从高等植物中分离出调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应以及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种。
[0003]Myb{v~myb avian myeloblastosis viral oncogene homo log)转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。类转录因子家族是指含有基因的N端含有特异MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。每个MYB结构域折叠成螺旋-转角-螺旋空间结构，其中含有3个色氨酸残基，这3个残基被18?19个氨基酸残基隔开，起着疏水核心的作用。类转录因子由3个保守的功能域组成:一个DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)、一个转录激活结构域(transactivat1n domain, TAD)以及一个不完全界定的负调节区(negative regulatory domain, NRD) (Frampton, 2004 ；Thompson and Ramsay，1995)。DNA结合结构域最为保守，一般包含I?3个不完全重复序列(R)。根据重复片段(R)的个数，通常可以把转录因子分为单一 MYB结构域蛋白(Rl/R2)，2R 蛋白(R2R3)和 3R 蛋白(R1R2R3)。
[0004]研宄发现有许多转录因子参与了植物在干旱逆境下的应答过程。厚叶旋蒴苣苔中的受干旱强烈诱导，同时能对PEG、高盐、低温等胁迫产生一定程度的应答。拟南芥的份？也被证实参与植物的耐旱胁迫过程。同时，#7沒转录因子还与其他应答因子共同合作应答干旱逆境。如乙烯基应答因子可以通过与目的基因启动子GCC盒的结合增强的表达，通过表达植株的qPCR分析发现汉砂的表达与CK相比较有明显的增长，从而加强了水稻的耐干旱能力。
[0005]2008年，Yong Liao等对前期获得的156个大豆MYBs基因进行比对后发现，其中的48个基因具有全长开放阅读框。在这156个GmMYBs中，有43个成员至少对盐、低温、干旱和ABA四种处理中的一种具有应答响应，氏《ΤΑ似和GmMYB177三个基因在ΑΒΑ，高盐，干旱和/或低温诱导时均表现为上调，拟南芥转基因植株表现出抗逆性的增强(Soybean GmMYB76, GmMYB92 and GmMYBl77 genes confer stress tolerancein transgenic Arab1psis plants.Cell Res, 2008, 18: 1047 - 1060)。杨文杰等分离并鉴定了四个MYB转录因子，分别命名为GwMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GwMYBJ7,利用UV-B射线、干旱和高盐处理中豆27号，诱导GmMYBJ6基因的表达水平增加，暗不GmMYBJ6基因表达与非生物胁迫密切相关(Express1n and funct1nal analysis ofGmMYBJ6 from soybean.Heredites, 2009, 31(6): 645 - 653)。2012 年，Xuyan Li 等研宄表明GmMYB62作为一个新的Rl型MYB蛋白，可以与GmMYB176蛋白互作，推测其可能参与大豆异黄酮的合成，但没有明确β?份3似基因的功能(14-3-3 proteins act as scaffoldsfor GmMYB62 and GmMYBI76 and regulate their intracellular localizat1n insoybean,Plant Signaling & Behav1r 2012, 7(8): 965-968)。这些研宄表明，研宄大豆GmMYB基因功能对于大豆抗逆分子育种十分重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一个来源于大豆的类基因及其所编码的蛋白质GmMYB62( Glycine max v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homo log 62)在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。其特征在于:
所述基因GmMYB62_ SEQ ID NO:1的DNA序列；
所述《TA似的编码蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列，或者具有将SEQ IDNO:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加成为具有转录激活功能的提高植物抗逆性的氨基酸残基序列。
[0007]具体地，上述基因沒似可为如下a)或b)或c)的DNA分子:
a)序列表中序列I所示的DNA分子，由1080个核苷酸组成；
b)在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
c)编码与序列表中SEQID NO:2相同氨基酸残基序列的多核苷酸序列。
[0008]所述高严谨条件为在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1% SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗月吴。
[0009]列表中的SEQ ID NO:1由1080个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第I位至1080位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0010]其中，序列表中的SEQ ID NO:2由359个氨基酸残基组成，通过http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLASTp结果表明该蛋白自氨基端(N端)第111位左右至第155位左右的氨基酸残基为保守的MYB家族蛋白特异保守的SANT结构域。
[0011]所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012]含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增任GmMYB62—片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0013]本发明所提供的调控植物抗逆性的应用，是将所述大豆似类基因导入植物组织或细胞，调节异黄酮的合成，植物抗逆性得到提高。
[0014]所述的《TA似基因可通过含有的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pCXSN或其他衍生植物表达载体；使用本发明的构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记(卡那霉素、潮霉素等)或抗化学试剂标记基因(如抗除草剂bar基因等)及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。
[0015]携带有的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用，既可适用于单子叶植物(小麦、水稻、玉米等)，也可以适用双子叶植物(大豆、烟草、棉花等)。
[0016]本发明提供的基因来自野生大豆，多重序列比对发现和其他植物的MYB类基因具有较高的保守性；实时荧光定量PCR检测结果表明沒似在大豆的各个生理发育时期均有表达，并且在根、茎、叶、花中表达较高，豆荚中没有检测到表达；在转基因组合植株中，实时荧光定量PCR检测结果表明过表达《TA似基因能够调节抗旱相关基因的表达，同时调节异黄酮合成相关基因的表达；在干旱胁迫处理下，与对照相比较，转GmMYB62基因的过表达组合植株抗旱性明显提高，表明该基因《/招似可作为目的基因导入植物(包括单子叶和双子叶植物)，提高植物抗逆性，具有较高的实际应用价值。
【附图说明】
[0017]图1为GmMYB62蛋白的保守结构域；
图2为GmMYB62蛋白与其他植物的MYB蛋白氨基酸的多重序列比对；
图3为MYB蛋白mRNA在不同组织器官中表达丰度的实时荧光定量PCR检测结果；
图4为PCXSN植物过表达载体物理图谱；
图5为过表达基因调节抗旱相关基因的表达情况；
图6为过表达《ΤΑ似基因调节异黄酮合成相关基因的表达情况；
图7为PCXSN:: ?TA似转基因组合植株抗旱性鉴定和PCR验证照片。
[0018]具体发明实施方式
1.材料与方法
1.1材料、菌株、试剂
实验使用的大豆材料为G.max，大肠杆菌菌株DH5a为本实验室保存。pGEM_T EasyVector T克隆试剂盒、Trizol reagent、T4 DNA连接酶来自Fermentas公司；引物由上海英潍生物技术有限责任公司提供，RNA提取试剂盒购于Promega公司，凝胶回收试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购于上海捷瑞生物工程公司，DNA marker、Taq DNA聚合酶、反转录试剂等其他生物学试剂购自上海皓嘉科技发展有限公司。
[0019]1.2总RNA提取和c DNA合成
幼苗期的根、茎、叶，开花期