专利名称：一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法
技术领域：
本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法。
背景技术：
苜蓿因其高产、优质、利用年限长、根系发达，可改良土壤结构，增加土 壤肥力，被誉为"牧草之王"。在我国，随着农业产业结构和畜牧业结构的调整， 节粮型畜牧业，特别是草食动物养殖业，呈现良好的发展态势，因为苜蓿在提 高奶牛、肉羊的单产中发挥决定性的作用，已成为我国"三元"种植结构调整 的首选词料作物，苜蓿产业作为新兴的朝阳产业，存在着广阔的发展空间。
由于夏季高温的原因导致紫花苜蓿在我国南方难以种植，南方的苜蓿干草 基本是从北方调运，运输成本极高，既提高了饲养成本，而且质量难以保证，
极大阻碍了南方草食畜禽的发展。CBF基因是几年前发现的一类耐逆相关基因， 其所编码的转录激活因子能与CRT/DRE的DNA调控元件特异结合，促进启动 子中含有这一调控元件的多个热和干旱诱导基因的表达，从而引起植株耐热性 和耐逆性的增强。
正是在该背景下，本发明提出一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，旨在 培育更适合南方种植的耐热紫花苜蓿新品种，推动南方紫花苜蓿苜蓿产业化发 展，增加优质饲草的供应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，以获得适合 南方种植的耐热紫花苜蓿新品种。
耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤
1) 取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25t光条 件下诱导形成愈伤组织；
2) 取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织 进入快速增殖期；
3) 取快速增殖的愈伤组织，在25"C暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天;
4) 取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液， 用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在23。C暗条件下共培养3天；
5) 取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25t暗条件 下培养2周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔2周转继1次；
6) 取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对 抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测，选留含目的基因的转 基因植株；
7) 取入选的转基因植株，转移至温度35'C和光照10000Lux下耐热鉴定1 周，移至自然环境生长1周，尔后重新置于35'C和10000Lux下再耐热鉴定1 周，选留叶片不枯黄、生长良好的转基因植株，进行种子繁育；
8) 继续种植步骤7)筛选的转基因株系，室内外评价验证耐热性的表达稳 定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。
上述的稳定性是指入选紫花苜蓿的耐热性可在不同年份间(2年及以上)、 季节间(2季及以上)以及地点间(2个地点及以上)表达一致，特性不受年份、 季节以及地点的显著影响。
本发明中，所说的诱导培养基为MS基本培养基添加NAA5mg、 BA0.5mg、 蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的继代培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的共培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的筛选培养基为MS基本培养基添加潮霉素100mg、 NAA0.5mg、 BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的分化培养基为MS基本培养基添加KTlmg、蔗糖30g、 琼脂粉6.8g ， pH灭菌前5.8。
上述的MS基本培养基为大量元素(NH4N03 650mg、 KN03 900mg、 CaCl2.2H20 440mg、 MgS04'7H20 370mg、 KH2PO4700mg)、微量元素(KI0.83 mg、 H3B036.2mg、 MnS04.4H20 22.3mg、 ZnS04.7H20 8.6mg、 Na2Mn04.2H20 0.25mg、 CuS04-5H20 0.025mg、 CoCl26H20 0.025mg、 FeS04.7H20 27.8mg Na2-EDTA'2H20 37.3mg)和有机成分(肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B10.5mg、甘氨酸2mg)。
本发明中，所说的农杆菌的菌株为超毒力型EHA105，内含质粒pCMD。 pCMD的T-DNA区携带有拟南芥耐逆相关CBF1基因、潮霉素磷酸转移酶基因 和葡糖苷酸酶基因。CBFl基因长642bp，与CaMV35S启动子和胭脂碱合成酶 终止子共同构成表达框架。菌株EHA105可方便购买或赠送获得，在一般植物基因工程实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005， 38(12): 2395-240。
本发明中，所说的葡糖苷酸酶基因组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletter, 1989， (6): 168-169，潮霉素基因分子检测方法参见吴 关庭等，中国农业科学，2005， 38(12): 2395-240。
本发明具有以下几方面的有益效果
培育的耐热紫花苜蓿新品种能正常越夏，更适合我国南方种植，推动紫花 苜蓿苜蓿在我国南方的产业开发，增加优质饲草的供应，促进我国草食动物养
殖业的发展，尤其有利于增进南方丘陵山区的农村经济发展和农民收入。
具体实施例方式
以下通过具体实例进一步说明本发明。
实施例1:
以紫花苜蓿品种"维多利亚"的子叶为外植体，接种至诱导培养基，诱导 形成愈伤组织；取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至 愈伤组织进入快速增殖期；取快速增殖的愈伤组织，在25'C暗条件下进行受体 愈伤组织预培养3天；取预培养的愈伤组织(约3000个培养皿，含30000块以 上的愈伤组织)，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸 吸干，接种于共培养基上，在23t:暗条件下共培养3天；取共培养愈伤组织， 洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25"C暗条件下培养4周，收集长出的抗 性愈伤组织(约200块)，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛 选，每隔4周转继1次；取3轮筛选后的抗性愈伤组织(53块)，转移至分化 培养基，诱导分化成苗49株，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和 潮霉素基因分子检测，选取含目的基因的分化小苗27株，转移至生根培养基长 成正常幼苗19株；取入选的转基因植株，转移至温度35t:和光照10000Lux下 进行耐冷性鉴定1周2个轮次，选留不受热害、生长良好的转基因植株5株； 继续种植入选的转基因紫花苜蓿株系，在2007-2008年室内外评价模拟评价耐热 的表达稳定性，获得稳定表达的转基因耐热紫花苜蓿株系1个，即THT- Alfal-l。 种植培育出的THT-Alfal-l，可正常越夏，即盛夏炎热季节叶片保持绿色，能正 常生长，可提供稳定提供优质营养的饲料，而普通紫花苜蓿材料由于不耐热， 休眠停滞生产，叶片枯黄。
权利要求
1.一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤1)取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25℃光条件下诱导形成愈伤组织；2)取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快速增殖期；3)取快速增殖的愈伤组织，在25℃暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天；4)取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在23℃暗条件下共培养3天；5)取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25℃暗条件下培养2周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔2周转继1次；6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测，选留含目的基因的转基因植株；7)取入选的转基因植株，转移至温度35℃和光照10000Lux下耐热鉴定1周，移至自然环境生长1周，尔后重新置于35℃和10000Lux下再耐热鉴定1周，选留叶片不枯黄、生长良好的转基因植株，进行种子繁育；8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，室内外评价验证耐热性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。
2. 根据权利要求1所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于所说 的诱导培养基为MS基本培养基添加NAA5mg、 BA0.5mg、蔗糖30g、琼脂粉 6.8g， pH灭菌前5.8。
3. 根据权利要求1所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于所说 的继代培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉 6.8g， pH灭菌前5.8。
4. 根据权利要求1所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于所说 的共培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
5. 根据权利要求1所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于所说 的筛选培养基为MS基本培养基添加潮霉素100mg、 NAA0.5mg、 BA2mg、蔗糖 30g、琼脂粉6.8g， pH灭菌前5.8。
6. 根据权利要求1所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于所说 的分化培养基为MS基本培养基添加KTlmg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g ， pH灭 菌前5.8。
7. 根据权利要求2-6中任一所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征 在于所说的MS基本培养基为NH4N03 650mg、KNO3 900mg、CaCl2'2H2O 440mg、 MgS04'7H20 370mg、 KH2PO4700mg、 KI 0.83 mg、 H3B03 6.2 mg、 MnS04'4H20 22.3mg、 ZnS04.7H20 8.6mg、 Na2Mn04'2H20 0.25mg、 CuS04-5H20 0.025mg、 CoCl2'6H20 0.025mg、 FeS04.7H20 27.8mg Na2-EDTA.2H20 37.3mg 、肌醇 100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素Bl 0.5mg和甘氨酸2mg。
全文摘要
本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至快速增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，鉴定含目的基因的分化小苗，对入选的转基因植株进行耐热性鉴定，选留不受热害、生长良好的转基因植株，继续种植室内外评价验证耐热性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。本发明的耐热紫花苜蓿，更适合在我国南方种植，增加优质饲草的供应。
文档编号C12N15/82GK101643746SQ20091010207
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者刘新华, 叶红霞, 吴殿星, 舒小丽, 蒋永清, 新 黄 申请人:浙江大学