专利名称：一种培育转基因斑马鱼的方法及其专用质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育转基因鱼的方法及其专用质粒，特别涉及一种培育转基因斑马鱼的方法及其专用质粒，尤其涉及一种培育apoaequorin转基因斑马鱼的方法及其专用质粒。
背景技术：
钙离子被看作细胞中的第二信使，在细胞，组织器官间传递重要信号，介导机体内部和外部环境间的通讯，通过调控钙敏转录因子基因的表达而协调生物个体的正常发育、行使功能。
Apoaequorin(E14215.1 GI5708898 inGenbank)是水母中发现的一种发光蛋白，它与一种辅助因子coelenterazine结合成aequorin，aequorin与钙离子结合后能够自动分解产生coelenteramide，apoaequorin，二氧化碳和一种蓝色荧光。通过显微成像设备可以把这种光信号放大并记录下来。因此aequorin可以作为钙离子受体来检测钙离子浓度及变化。现在比较成熟的方法是将apoaequorin和coelenterazine直接注射到待研究的活细胞或者受精卵中，通过光子显像设备来检测钙离子信号。但是随着细胞分离，子细胞中的apoaequorin和coelenterazine会越来越少，可检测的钙信号会越来越弱。
转基因技术可以把一个外源基因转入宿主基因组中，而且使转入的外源基因在宿主细胞内可以像宿主的内源性基因一样进行表达。斑马鱼是用于基因转移的理想脊椎动物材料。一般来讲，比较成熟的转基因技术有线性化的重组质粒的显微注射和带有外源基因的反转录病毒的侵染。这两种方法都胜任于获得一定数量的转基因斑马鱼种系，其中前者比较简单易行。
基因的表达主要受到基因的上游或内含子的顺式作用元件(如启动子，增强子等)的调控，外源基因在转基因动物中的表达同样是这样，其表达情况受到构建于表达载体中的启动子的控制。
发明创造内容本发明的目的是提供一种培育可以稳定表达apoaequorin的转基因斑马鱼的方法。
一种培育apoaequorin转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤(1)构建apoaequorin重组表达载体，所述apoaequorin重组表达载体包含apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因调控序列引导的GFP表达框；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；(3)将F0代与野生型的斑马鱼交配，得到可表达apoaequorin的转基因斑马鱼。
其中，步骤(3)中得到的转基因斑马鱼可通过传统的育种方法得到转基因斑马鱼的纯合体。apoaequorin重组表达载体可通过将apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列(Anming M.，Hong T.，Bruce A.O.，Micheal J.F.，Shuo L..(1997).Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motifrequired for neuronal expression of GATA-2.Proc.Natl.Acad.Sci..94，6267-6272.)、非洲爪蟾EF-1α基因(XEX)调控序列(Johnson A.D.，Krieg P.A..(1995).A Xenopus laevis gene encoding EF-1 alpha S，the somatic form ofelongation factor l alphasequence，structure，and identification ofregulatory elements required for embryonic transcription.Dev Genet.17(3)，280-90.)和GFP表达框(Amsterdam A.，Lin S.，Hopkins N..(1995).The Aequoreavictoria green fluorescent protein can be used as a reporter in live zebrafishembryos.Dev Biol.171(1)，123-9.)插入载体pGEM-7Zf(-)(X65311.2 GI6687355in the Genbank)而得到。apoaequorin重组表达载体可通过多种方法导入斑马鱼受精卵，如显微注射法、原生质体融合法、高压电穿孔法等，优选为显微注射法。
本发明针对随着细胞分离子细胞中的apoaequorin和coelenterazine会越来越少的问题，通过基因重组的方法培育出apoaequorin转基因斑马鱼，可以稳定表达apoaequorin。本发明的apoaequorin重组表达载体中包含GATA2启动子，制备出的转基因斑马鱼分别在肌肉和神经系统表达apoaequorin。为了便于鉴定apoaequorin转基因斑马鱼，每个表达载体上都包含由非洲爪蟾EF-1α基因(XEX)调控序列引导的GFP表达框，在成功的转基因斑马鱼中可观察到全身性表达的绿色荧光。
本发明的apoaequorin转基因斑马鱼将在生物发育研究、斑马鱼活体钙像研究中起到重要的作用，具有重要的理论意义和实际意义。本发明的apoaequorin转基因斑马鱼能够在特定的组织器官和特定的发育时期大量合成apoaequorin，能够用于在活体细胞、器官、甚至个体整体水平上对钙信号(钙像)的研究，以阐明钙信号在发育、生长等过程中的作用。本发明的apoaequorin转基因斑马鱼与既有的突变体斑马鱼通过遗传育种，可以得到有关特定基因突变和钙信号异常的关系，在遗传疾病的机理阐述和治疗上有重要的意义。
图1为可表达apoaequorin的重组表达载体的物理图谱图2为含GATA2启动子的apoaequorin转基因斑马鱼的原位杂交结果图3为含GATA2启动子的apoaequorin转基因斑马鱼GFP的表达照片具体实施方式
实施例1、培育表达apoaequorin转基因斑马鱼培育表达apoaequorin转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤(1)构建可表达apoaequorin的重组载体将克隆得到的polyA(pA)和apoaequorin编码区片段插入到载体pGEM-7Zf(-)中，得到质粒pGEM-Aeq-pA。用XhoI和BamHI消化质粒pGATA2-GM2，得到约2.1kb的GATA2启动子片段；用XhoI和SacI消化质粒pBKS-GM2，得到约1.6kb的XEX-GM2-pA片段；用BamHI和SacI消化质粒pGEM-Aeq-pA，得到约3.9kb的片段；连接这三个片段，得到重组载体pGATA2-Aeq-GM2。
所构建可表达apoaequorin的重组表达载体的物理图谱如图1所示，包含斑马鱼的GATA2调控序列，还包含一个由非洲爪蟾EF-1α基因(XEX)调控序列引导的GFP表达框，用于筛选转基因斑马鱼。
(2)重组表达载体pGATA2-Aeq-GM2转化斑马鱼受精卵显微注射线性化的重组质粒到斑马鱼受精卵中，喂养至性成熟，得到F0代。
(3)转基因斑马鱼的获得将F0代与野生型的斑马鱼交配，通过观察其子代胚胎F1代是否有GFP表达来鉴定出GFP阳性的F1代，结果如图3所示，得到全身性表达GFP的阳性F1代。再用地高辛标记的apoaequorin反义RNA探针(以apoaequorin为模板，按3’->5’方向体外转录得到的RNA序列)按常规方法做整胚原位杂交，检查F1代胚胎的apoaequorin表达情况，结果如图2所示，最终鉴定出表达apoaequorin的转基因斑马鱼，图中，黑色染色部位为神经系统的神经元。再通过传统的育种方法得到转基因斑马鱼的纯合体。
权利要求
1.一种培育apoaequorin转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤(1)构建apoaequorin重组表达载体，所述apoaequorin重组表达载体包含apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因调控序列引导的GFP表达框；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；(3)将F0代与野生型的斑马鱼交配，得到可表达apoaequorin的转基因斑马鱼。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，将apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列和非洲爪蟾EF-1α基因调控序列插入到载体pGEM-7Zf(-)中，得到所述apoaequorin重组表达载体。。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述apoaequorin重组表达载体通过显微注射法、原生质体融合法、高压电穿孔法导入斑马鱼受精卵，得到F0代。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述apoaequorin重组表达载体通过显微注射法导入斑马鱼受精卵，得到F0代。
5.一种培育apoaequorin转基因斑马鱼的质粒，它包含apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列和由非洲爪蟾EF-1α基因调控序列引导的GFP表达框。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于所述质粒为pGATA2-Aeq-GM2。
全文摘要
本发明公开了一种培育转基因斑马鱼的方法及其专用质粒，本发明提供的培育apoaequorin转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤(1)构建apoaequorin重组表达载体，所述apoaequorin重组表达载体包含apoaequorin编码基因、斑马鱼的GATA2调控序列和由非洲爪蟾EF－1α基因调控序列引导的GFP表达框；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；(3)将F0代与野生型的斑马鱼交配，得到可表达apoaequorin的转基因斑马鱼。本发明的apoaequorin转基因斑马鱼将在生物发育研究、斑马鱼活体钙像研究等方面中起到重要的作用，具有重要的理论意义和实际意义。
文档编号C12N15/87GK1607252SQ20031010045
公开日2005年4月20日 申请日期2003年10月16日 优先权日2003年10月16日
发明者孟安明, 赵知行, 苏颖, 黄慧哲 申请人:清华大学