专利名称：：一种培育转基因杨树的方法
技术领域：
：本发明涉及一种培育转基因杨树的方法。
背景技术：
：杨树(poplar)是世界上分布最广、适应性最强的树种，主要分布于北纬22°-70°的北半球温带和寒温带，且从低海拔到海拔4800米高度的地区均有分布。杨树天然林分面积约2000多万公顷(世界天然林中以杨树为优势种林分)，天然种约100多种。杨树天然树种分布最广的国家有俄罗斯、中国、加拿大、美国、意大利、法国等。我国有丰富的杨树资源，天然林面积约300万公顷，天然种有53种之多，且分布范围广。从最北端的大小兴安岭的甜杨、大青杨，直到南方的滇杨；从东部到西部有耐干旱、耐盐碱的胡杨，还有银白杨、银灰杨等。杨树具备早期速生、无性繁殖容易两大特点，但是我国东西部人工林地区存在两大问题一是三北防护林中的杨树人工林为400万公顷，每年2/5的资金和劳力投入杨树发展，占同期造林面积的27％。目前存在严重问题是小老头树多达140万公顷；天牛、木蠹蛾危害严重，受害县已由最初的30个发展到240个，面积约60万公顷。其原因为环境恶化；不适地适树；集约栽培水平低。二是东部商品林生产力低下，真正形成商品林的占人工林总面积不到30％，其原因是品种单一；品种老化；生产力低；集约栽培水平低。因此迫切需要一种培育转基因杨树的方法以高效定向改良杨树品种，并解决植被恢复等生态问题及木材问题。植物转基因技术主要采用农杆菌介导法和基因枪介导法。农杆菌介导法因具有操作简单、成本低、转化效率高、重复性好、可以导入大片段DNA，且导入的基因一般为单拷贝或低拷贝整合，可以减少发生基因沉默现象等优点，应用最为广泛，已在大豆等双子叶经济作物的改良中得到推广应用。随着人们对农杆菌介导法转化机理认识的深入，转化方法也不断得到改进，如选用高侵染力的菌株、超双元载体、适宜的外植体、高效的启动子、适宜的共转化培养基、合适的选择剂、较高浓度的酚类化合物如乙酰丁香酮(acetoayringone，AS)处理等(孔英珍，周功克，王根轩，王亚馥，影响根癌农杆菌转化的因素及其在单子叶作物上的应用，应用生态学报，2000，11(5)791-794)。利用改良的农杆菌介导法已经在水稻、玉米、小麦、大麦等有重要价值的单子叶植物中也已成功获得了转基因植株，并得到了详细的分子生物学和遗传性证据(HieiY，KomariT，KaboT.，TransformationofricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.，PlantMolBiol，1997，35205-218；IshidaY，SaitoH，OhtaS.Highefficiencytransformationofmaize(ZeamaysL)mediatedbyAgrobacteriumtumefaciens，NatBiotech，1996，14745-750；ChengMing，E.F.Joyce，PangShengzhietal.，GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens，PlantPhysiol，1997，115；971-980)。目前，人们致力于拓宽农杆菌转化单子叶植物的宿主范围和转化效率的提高，如柴宝峰等经研究建立了单子叶早熟禾农杆菌介导的转基因方案(CHAIBao-Feng，LIANGAi-Hua，WANGWei，HuWei，Agrobacterium-mediatedTransformationofKentuckyBliuegrass，ActaBotanicaSinica，2003，45(8)966-973)。但是，获得转基因杨树的关键不在于基因转化技术，而是转化细胞如何再生完整植株，所以杨树高效、实用的转化体系建立，是获得转基因杨树的重要“瓶颈”，迄今为止，杨树基因转化成功的例子还是依靠离体杨树的器官，在无菌条件下，利用植物细胞的全能性来实现的，可是，由于杨树不同品种、不同无性系或个体间差异较大，往往需要转基因的杨树品种及其外植体，没有再生植株的技术，还需要进行探索和研究，从而使得急于转化的杨树植株在短期内不能获得定向基因转化的转基因植株，所以，如何建立简便、可行、实用又便于操作的树木转基因再生技术，成为科学飞速发展的今天，高新
技术领域：
必需面临的重要任务之一。如何诱导产生适宜农杆菌转化的非胚性组织，研制适宜的共培养条件是目前农杆菌介导的单子叶植物基因转化的任务之一。
发明内容本发明的目的是提供一种农杆菌介导的非离体操作技术高效培育转基因杨树的方法。本发明所提供的培育转基因杨树的方法，包括以下步骤1)自地上主茎高50-160cm处截断杨树，并将断伤面处理整齐；2)将杨树断伤面用OD600值为0.3-0.5的携带有外源目的基因的重组农杆菌菌悬液侵染3分钟-24小时；3)自农杆菌侵染后12-36小时，开始用抗生素选择压筛选生长锻炼，即每隔1-2天在步骤2)经重组农杆菌侵染的断伤面上涂浸对农杆菌具有致死作用抗生素进行选择培育，得到杨树转基因再生植株。在上述培育方法中，为获得较好的转基因效果，最好选用树龄为1-3年生的杨树植株。步骤2)中用于侵染的农杆菌可为任意一种根癌农杆菌，如EHA101、EHA105、C58c1或LBA4404等，优选为LBA4404和EHA105；可按照基因工程领域的常规方法将外源目的基因导入农杆菌，如电击转化法、冻融法等方法。步骤3)中用抗生素进行处理的间隔时间优选为1天；抗生素可为任意一种对未转化细胞具有毒性或抑制作用的抗生素，如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、利福平、头孢霉素或万古霉素等，此外，抗生素种类不同则浓度不同，如卡那霉素的浓度可为25-75mg/L，优选为50mg/L，氨苄青霉素的浓度可为400-600mg/L，优选为500mg/L，利福平的浓度可为100-200mg/L，优选为150mg/L等。杨树用上述方法被截干转化5-8天后，在切口面的韧皮部周围形成膨大的愈伤组织，不同杨树品种的愈伤组织类型不同，12-20天后，愈伤组织上分化出芽点，25-30天逐渐分化出小芽，期间，一直进行抗生素选择压筛选，直至长成15-25cm的转基因杨树新枝条，同时，进行分子检测和无性繁殖培养，得到发育成完整的转基因杨树植株。本发明提供了一种农杆菌介导的非离体操作技术高效转基因杨树的培育方法。在实际应用方面，该方法将产生以下积极效果(1)加速优良外源基因向杨树中的转移，有利于杨树品种的定向改良；(2)开辟了获得转基因杨树的高效转化新方法，大大提高了基因转化成功的可能性；(3)为杨树的无性繁殖提供一条新途径，提高了杨树的生产力及集约栽培水平，可用于解决植被恢复等生态问题及并可满足市场对林木的需求。此外，本发明为弄清影响农杆菌介导的单子叶植物转基因体系的主要因素，发掘并利用更广泛的农杆菌介导的转基因受体资源也具有重要意义。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。图1为用本发明的方法培育杨树转基因再生植株的流程2A-图2E为杨树转基因再生植株的生长过程图3为杨树转基因再生植株的PCR检测结果图4为杨树转基因再生植株的SouthernBlotting鉴定结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、转基因杨树的培育及分子检测一、转基因杨树的培育供试优良杨树品种SHY-05-HB-01(山哈杨)、YZY-05-HLJ(银中杨)、SLY-HB-05(沙兰杨)、ZL-46-05(中林46)、NM-DGY-05(帝国杨)、NM-CHMY-05(赤美杨)、SHXD-05(少先队杨)、NM-XQY-05(小青杨)。以基因DREB1A(GenBank号DR448909)、BADH(GenBank号DR448910)和SOS1(GenBank号AF256224)为例，对上述优良杨树品种用本发明的方法进行转基因实验，该方法的流程图如图1所示，具体方法包括以下步骤1)用基因工程领域的常规方法将基因DREB1A、BADH和SOS1分别导入农杆菌EHA101和LBA4404，经筛选得到分别携带有DREB1A、BADH和SOS1的EHA101和LBA4404重组子，以未转化菌株为对照(CK)，制成浓度为OD600值为0.3-0.5的菌悬液；2)自地上茎高80cm处截断上述SHY-05-HB-01(山哈杨)、YZY-05-HLJ(银中杨)、SLY-HB-05(沙兰杨)、ZL-46-05(中林46)、NM-DGY-05(帝国杨)、NM-CHMY-05(赤美杨)、SHXD-05(少先队杨)和NM-XQY-05(小青杨)8种杨树植株，第一批196株，第二批18株，第三批58株；3)将杨树断伤面用浓度OD600值为0.3-0.5的携带有外源目的基因的重组农杆菌菌悬液侵染4小时；4)自侵染后24小时，每隔1天在步骤3)经重组农杆菌侵染的断伤面上涂浸50mg/L卡那霉素进行选择培育，得到杨树转基因再生植株，再生植株过程如图2A-图2E所示，统计不同种类转化植株的再生数量、单个外植体最多的再生植株数量和培育出的大苗数量，统计结果如表1所示表1杨树在位截干农杆菌转化情况(株)<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="800">基因号转化外植体数杨树不同品种号杨树转化植株再生数量一个外植体最多再生数量培育大苗数EHA105DREB1A8SHY-05-HB-1202015EHA105BADH8SHY-05-HB-12524EHA105SOS18SHY-05-HB-1121211LBA4404DREB1A8SHY-05-HB-1227LBA4404BADH8SHY-05-HB-113109LBA4404SOS18SHY-05-HB-1454318EHA105DREB1A8YZY-05-HLJ116EHA105BADH8YZY-05-HLJ121118EHA105SOS18YZY-05-HLJ211342LBA4404DREB1A8YZY-05-HLJ846</table></tables><tablesid="table2"num="002"><tablewidth="801">LBA4404BADH8YZY-05-HLJ200138LBA4404SOS18YZY-05-HLJ48320CK1YZY-05-HLJ000EHA105DREB1A8SLY-HB-053986762EHA105BADH8SLY-HB-051002847EHA105SOS18SLY-HB-05613135LBA4404DREB1A8SLY-HB-05585838LBA4404BADH8SLY-HB-0572559LBA4404SOS18SLY-HB-056.625306CK1SLY-HB-05000EHA105DREB1A8ZL-46-05-A上5533023EHA105BADH8ZL-46-05-A上6466EHA105SOS18ZL-46-05-A上1616LBA4404DREB1A8ZL-46-05-A上64110LBA4404BADH8ZL-46-05-A上2162231LBA4404SOS18ZL-46-05-A上104136CK1ZL-46-05-A上006LBA4404DREB1A9NM-DGY-052435021LBA4404SOS18NM-DGY-051122942CK1NM-DGY-05000LBA4404DREB1A6NM-CHMY-05361310LBA4404BADH6NM-CHMY-05272312LBA4404SOS16NM-CHMY-05292711CK1NM-CHMY-0570700LBA4404DREB1A6NM-XQY-05112LBA4404BADH6NM-XQY-05552LBA4404SOS16NM-XQY-05002CK1NM-XQY-0531310LBA4404DREB1A6SHXD-0517170LBA4404BADH6SHXD-0513130LBA4404SOS17SHXD-05870CK1SHXD-05</table></tables>注SHY-05-HB-01(山哈杨)、YZY-05-HLJ(银中杨)、SLY-HB-05(沙兰杨)、ZL-46-05(中林46)、NM-DGY-05(帝国杨)、NM-CHMY-05(赤美杨)、SHXD-05(少先队杨)、NM-XQY-05(小青杨)二、转基因杨树的分子鉴定以BADH为例，对步骤一获得的杨树再生植株进行分子鉴定，具体方法如下1、BADH转基因杨树的PCR检测在对转化再生植株进行抗性筛选的基础上，选取表型抗性能力较强的转基因幼苗进行PCR检测。提取转基因杨树幼苗的DNA，根据已知的BADH序列设计如下特异引物P15’-GGTAGATGCGTCCCTGGGAG-3’和P25’-AATCTTTCAGCACCGGCACAG-3’，然后以提取的DNA为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为分子量标准，泳道1为阴性对照，泳道12为阳性对照，泳道2-10为待测样品，其中泳道5为阴性，泳道2-4，6-10为阳性)，PCR扩增出长度约为595bpDNA片段的阳性植株。统计BADH基因转化率，结果为47.1％。2、BADH转基因杨树的SouthernBlotting鉴定再对步骤1获得的其中3株阳性转基因再生植株用SouthernBlotting的方法作进一步鉴定，BADH探针序列为序列表中的序列1，鉴定结果如图4所示(泳道1为阴性对照，泳道2、3为阳性对照，泳道4-6为样品)，鉴定结果均为阳性，表明基因BADH已经整合到杨树基因组中。上述检测结果表明用本发明的方法可培育出数量较多的杨树转基因再生植株，具有较高的转化效率，可达13.4％。<160>1<210>1<211>1491<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>1atgccgacgcggcagctgtttatcgacggcgagtggcgagagcccgtccaaagaaaacgc60attccgatcataaaccccgccaacgaacaaactattggagatattccggcagctactgct120gaagagatggatattgctgtggaagctgctcggaaagcatttttccgtaacagtggcaaa180gattggtcctcgacgactggggcgcatcgagccaagtatttacgagccattgctgcaaag240attaaagacaggaaagtagaactagtggaacttgaagctattgatagtgggaaaccattg300gaagaagcatctttggatatggataatgtcattggatgttttgagtattttgctggcata360gctgaaagattggattcagaacaaaggacacctgtttctttaccaatggaaacgttcaag420tgtcatcttctaaaagaacccattggcgttgttggtttgatctcgccatggaattaccct480ctgttaatggcaatatggaaagttgcccctgccctagcatctggatgcactgctatactt540aaaccatctgaactagcatcagtaacgtgtttggaattggctgaagtgtgtatggaggtg600ggtcttccacctggtgtactcaacattttgactggtttggggccagaagctggtgctcca660ttggttactcatcctcatgttgccaagatttcatttacggggagtgatactacgggagtc720acaattatgactgctgctgcccaacttgtgaaaccagttacgttggagcttggtggaaaa780agcccaatcgttgtgtttgaagatgttgaccttgatacagctgctgagtggaccctcttc840ggttgcttttggacaaatggtcagatatgcagtgctacttctcgactcttggtgcatgaa900agcatagcgacaacattcttggagaagcttgtgaaatggtgcgagaaaattaaaatatca960gaccccttagaggagggttgcaggcttggccctattgttagtcgacggcagtatgagaaa1020gtgatgaagtacatctcaacagctaaggaggaaggtgccacgatcttatgtggaggtgca1080cgacctgagcatttagagaaaggttactttgttcaaccaactattataacagacgtgaag1140acttccatgcaaatctggatagaggaagtatttggacctgttctttgggttaaaacattt1200gcaactgaagatgaagccgttgaactggcaaatgatacccattatggtcttgctgctgca1260gtaatatcgaaggatcttgataggtgtgagcgaatggctaaggcatttcaagtcggagcc1320gtctgggtcaactgctcacagccttgcttctaccaagccccatggggaggcaaaaagcga1380agtggttttgggcgtgaacttggggaacggggactggacatctacttgaacgtaaagcag1440gtcacacggtatgtttctagtgagccatggggttggtacaagtctccttga149权利要求1.一种培育转基因杨树的方法，包括以下步骤1)自地上主茎高50-160cm处截断杨树；2)将杨树断伤面用OD600值为0.3-0.5的携带有外源目的基因的重组农杆菌菌悬液侵染3分钟-24小时；3)自侵染后12-36小时，每隔1-2天在步骤2)经重组农杆菌侵染的断伤面上涂浸对农杆菌具有致死作用抗生素进行选择培育，得到杨树转基因再生植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述杨树的树龄为1-3年生。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤2)中用于侵染的农杆菌为根癌农杆菌EHA101、EHA105、C58c1或LBA4404。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述农杆菌为LBA4404或EHA105。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤3)中用抗生素进行处理的间隔时间为1天；对农杆菌具有致死作用的抗生素为卡那霉素、氨苄青霉素、利福平、羧苄青霉素、头孢霉素或万古霉素。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述抗生素为卡那霉素、氨苄青霉素或利福平。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述卡那霉素的浓度为25-75mg/L；氨苄青霉素的浓度为400-600mg/L；利福平的浓度为100-200mg/L。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述卡那霉素的浓度为50mg/L；氨苄青霉素的浓度为500mg/L；利福平的浓度为150mg/L。全文摘要本发明公开了一种培育转基因杨树的方法。该方法包括以下步骤1)自地上主茎高50－160cm处截断杨树；2)将杨树断伤面用浓度OD文档编号C12N15/00GK1813524SQ200610003188公开日2006年8月9日申请日期2006年2月22日优先权日2006年2月22日发明者齐力旺,张守攻,韩素英,王建华申请人:中国林业科学研究院林业研究所