专利名称：：一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说涉及一种杨树利用具生物安全的甘露糖选择标记基因的遗传转化方法。
背景技术：
：杨树是世界上重要的造林树种之一，在我国人工林中杨树也有较大比重。在林木植物中杨树是较早开展转基因研究的树种之一，据报道通过基因工程技术已成功转入了抗病虫、耐盐碱、抗大气污染、降低木质素含量、增加生长量等基因，为培育具有优良性状的转基因杨树新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因杨树的环境释放和推广应用。近年来转基因植物的安全性受到广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题己成为当今基因工程研究的热点。目前常用的筛选标记基因主要有两大类，即抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。这些标记基因在完成筛选后并不参与植物的性状改良，且可能对环境或非靶标生物存在潜在风险。糖类分解代谢酶基因作为安全标记基因，近年来在植物遗传转化中显示了巨大的应用潜力。这类标记基因编码产物是筛选剂糖类的分解代谢酶，使转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源而获得优势生长，非转化细胞则因饥饿生长而被抑制，故称为正筛选系统。据报道磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannoseisomerase，pmi)安全标记基因已成功应用于水稻、棉花、甜橙等转基因研究中。但目前尚未有杨树利用具生物安全的甘露糖选择标记基因的遗传转化系统建立的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，包括以下步骤(1)6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增；(2)甘露糖选择标记基因表达载体的构建并转入农杆菌；(3)将杨树试管苗置于基本培养基MS上继代繁殖；(4)在继代的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，剪成预定面积的叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上预培养；(5)挑取步骤(4)得到的农杆菌LBA4404(pMBIA1301-manA)的菌落接种到农杆菌YEB液体培养基中，振荡培养一段时间后，取预定体积转接至YEB液体培养基，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，获得侵染菌液；(6)将步骤(4)的预培养后的叶盘浸入步骤(5)的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回添加了乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上进行共培养；(7)对共培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；(8)将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；(9)待不定芽伸长至一定长度，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体。步骤(l)中所述6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增方法如下上游引物5'-GGTTACTTCCCGTAGGATTC-3';下游引物5'-CGCTACCAGCGATTTATTC隱3';扩增模板大肠杆菌K12菌株DNA;反应条件94'C反应5分钟，然后按94'C变性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸30秒进行35个循环，72'C延伸10分钟。步骤(2)中，所述的表达载体为pMBIA1301，其i的玩生素标记基因hyg利用xhol内切酶酶切后由步骤(l)中PCR扩增的manA基因替换。将在-70'C保存的农杆菌(LBA4404)感受态放于冰水中化冻或取新鲜置备的农杆菌感受态1管，加入lpL表达载体质粒(pMBIA1301-manA)，轻轻混匀，冰上30min。液氮速冻lmin，37'C温浴3-5min，冰上l2min，加入800jaLYEB液体培养基+Str卡那霉素30mg/L培养基，28。C复苏2~3小时，取200nL菌液均匀涂布于含相应抗生素的YEB固体培养基上，倒置在28°C培养48小时左右。当转化子长出，随机挑选单菌落，液体培养后待用。步骤(3)中，所述杨树试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，试管苗继代时间为约l个月；所述的基本培养基为MS，蔗糖2530g/L，pH5.6~5.8，琼脂6~7g/L，121±1°C，灭菌1620分钟。步骤(4)中，外植体接种方式为以远轴面和培养基相接触；预培养条件为培养温度25±2°C，光照3000~40001ux，光照时间1618小时/天；所述叶盘分化培养基T为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.0020.003mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.5~0.6mg/L，蔗糖25~30g/L，pH5.6~5.8,琼脂6~7g/L，121±1°C，灭菌1620分钟。步骤(5)中，所述的YEB液体培养基所述的振荡培养条件为27士rC，220~230rpm，10~12小时；离心时5000rpm，5~8分钟。基本培养基MS液体培养基悬浮菌体的OD600值为0.3~0.4。步骤(6)中，所述浸泡时间为10~15分钟，共培养时间为23天。所述的乙酰丁香酮在叶盘分化培养基T中的浓度为50~100nmol/L。步骤(7)中，所述的叶盘分化筛选培养基W为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.002~0.003mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.5~0.6mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。步骤(8)中，所述的不定芽伸长筛选培养基Y为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.001~0.002mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.2~0.3mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。步骤(9)中，所述的生根筛选培养基G为1/2MS中的生长素IAA的浓度为0.1~0.2mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。本发明与现有技术相比，其显著优点是通过利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，可消除由于使用抗生素标记基因可能对生态、环境等带来危害的风险。并且，因为甘露糖标记棊因是正选择标记基因，可提高转化效率，本发明的转化效率为20%以上，而使用抗生素标记基因的转化效率仅为1~5%。利用该遗传转化技术可在短时间内培育出具生物安全的转基因杨树新品种。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例l:6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增。扩增方法如下PCR反应体系为DNA(10250ng)，2pL;PCR缓冲液2pL;MgCl225mM1.2nL;dNTP2mM2pL;上游引物10pMlpL;下游引物10pM1^L;TaqDNApolymerase1M0.3^L;ddH20补足20nL体系；上游引物5'-GGTTACTTCCCGTAGGATTC-3';下游引物5'-CGCTACCAGCGATTTATTC-3';扩增模板大肠杆菌K12菌株DNA;Taq酶购自Promega公司；引物由上海博亚生物技术有限公司合成；其它试剂为Sigama公司或国内分析纯试剂。反应条件94'C反应5分钟，然后按94'C变性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸30秒进行35个循环，72'C延伸10分钟。MJresearchPCR扩增仪、Beckman台式超速冷冻离心机、BIO-RAD电泳槽、BIO-RADPAC3000电泳仪。实施例2:甘露糖选择标记基因表达载体的构建并转入农杆菌。所述的表达载体为pMBIA1301，其上的抗生素标记基因hyg利用xhol内切酶酶切后由步骤(l)中PCR扩增的manA基因替换。将在-70'C保存的农杆菌(LBA4404)感受态放于冰水中化冻或取新鲜置备的农杆菌感受态1管，加入l^L表达载体质粒(pMBIA1301-manA)，轻轻混匀，冰上30min。液氮速冻lmin，37。C温浴35min,冰上12min，加入800nLYEB液体培养基+Str链霉素30mg/L培养基，28。C复苏2~3小时，取200pL菌液均匀涂布于含相应抗生素的YEB固体培养基上，倒置在28'C培养48小时左右。当转化子长出，随机挑选单菌落，液体培养后待用。实施例3:GFP(绿色荧光蛋白)基因和NP1(兔防御素)基因的遗传转化。南林895杨试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，基本培养基为MS，蔗糖2530g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L，121±1°C，灭菌1620分钟。在继代约1个月的试管苗上选取幼嫩、平展的第35片叶，叶的大小、形状和色泽基本一致。剪去叶边缘，剪成0.8cm2的叶盘为外植体，以远轴面和培养基接触的方式接种。培养温度为25±2°C，光照40001ux，光照时间17h/d。置于T培养基预培养3d，叶盘远轴面与培养基接触。挑取分别携带有GFP基因和NP1基因的农杆菌LBA4404(质粒pMBIA1301-manA)单菌落接种到YEB液体培养基中，于27士1。C振荡培养(220230rpm)，过夜；次日取lmL转接30mL的YEB液体培养基。培养至一定浓度(进入指数生长期)；5000rpm离心8分钟收集菌体，取适当MS液体培养基悬浮菌体至OD600值为0.3-0.4左右备用。将预培养后叶盘浸入侵染菌液，轻微振荡，充分浸泡15分钟左右，在无菌滤纸上吸去多余菌液，放回添加了5010(^mol/L乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上进行共培养。暗中共培养3d后，叶盘洗涤4次以除去农杆菌，叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W培养，直至分化出不定芽。将不定芽连同原外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y，2~3周继代1次。待不定芽伸长至1.5cm左右，将每个不定芽分离独立接入生根筛选培养基G，直至形成完整植体。上述具体参数是基本培养基MS;南林895杨叶盘分化培养基(T):MS+TDZ0.002~0.003mg/L+BA0.5~0.6mg/L+蔗糖25~30g/L+琼脂6~7g/L，pH5.65.8;南林895杨分化筛选培养基(W):MS+TDZ0.002~0.003mg/L+BA0.5~0.6mg/L+甘露糖8g/L+蔗糖22g/L+琼脂67g/L，pH5.65.8;南林895杨不定芽伸长筛选培养基(Y):MS+TDZ0.001~0.002mg/L+BA0.2~0.3mg/L+甘露糖8g/L+蔗糖22g/L+琼脂6~7g/L，pH5.65.8;生根筛选培养基(G):1/2MS+IAA0.1~0.2mg/L+甘露糖8g/L+蔗糖22g/L，琼脂6~7g/LpH5.6-5.8。实施例4:细胞分裂素BA、TDZ对叶盘不定芽分化的影响。在基本培养基中附加不同浓度的细胞分裂素BA和TDZ，从实验结果(表l)可以看到，低浓度的6-BA有利于外植体的分化，随着6-BA浓度的增加，不定芽的分化率逐渐下降，当达到3.0mg/L时，严重影响其分化率。当在MS基本培养基中添加6-BA0.5mg/L,TDZ0.002mg/L时，外植体的芽分化率最高，外植体在接入6天后就有可见的芽点，芽的状态好，生长旺盛，丛生芽多，说明有更多'的细胞被诱导分化，分化率100%。表lBA和TDZ不同浓度组合对南林895杨叶片再生的影响基本培养基MS外植体数分化外植体l分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例5:甘露糖浓度对南林895杨叶片分化的影响。为了评价南林895杨叶片对甘露糖的敏感性，设置了不同的甘露糖和蔗糖浓度，糖的总含量为30g/L，由表2可以看出，甘露糖对南林895杨的叶片分化有显著影响。当甘露糖浓度为6g/L时叶片分化率为86%，但总不定芽数明显减少。当甘露糖浓度为8g/L时，未见不定芽分化，且叶片呈黄绿色。而当甘露糖浓度为10g/L时，叶片边缘已经褐化。当甘露糖浓度为16g/L时，叶片整个全部褐化死亡。因此可将甘露糖浓度8g/L为南林895杨叶片分化的本底临界浓度。所以，采用甘露糖浓度8g/L+蔗糖浓度22g/L作为南林895杨的筛选浓度较为理想。表2甘露糖浓度对南林895杨叶片分化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例6:侵染时间对南林895杨叶片分化的影响。如表3所示侵染5分钟和侵染10分钟都没有获得抗性芽，说明10分钟以内的时间不足以使农杆菌和外植体的伤口充分接触，不利于抗性芽的获得；而侵染15和20分钟均获得了较多的抗性芽，转化效率较高，说明侵染15-20分钟能够使农杆菌和外植体的伤口充分接触，有利于农杆菌的转化。但若侵染时间过长，如超过20分钟可能会有过多的农杆菌附着在外植体上，对外植体的生长产生不利影响。表3侵染时间对南林895杨叶片分化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>南京林业大学〈120〉一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法〈130〉njfu081027〈160〉2<170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211>20〈212〉DNA<213>Artificial<220><223〉上游引物〈400〉1ggttacttcccgtaggattc20〈210〉2<211〉19<212〉DNA<213〉Artificial<220〉〈223〉下游引物<400>2cgctaccagcgatttattc19权利要求1、一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增；(2)甘露糖选择标记基因表达载体的构建并转入农杆菌；(3)将杨树试管苗置于基本培养基MS上继代繁殖；(4)在继代的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，剪成预定面积的叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上预培养；(5)挑取步骤(2)得到的农杆菌菌落接种到农杆菌液体培养基中，振荡培养一段时间后，取预定体积转接至农杆菌液体培养基，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，获得侵染菌液；(6)将步骤(4)的预培养后的叶盘浸入步骤(5)的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回添加了乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上进行共培养；(7)对共培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；(8)将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；(9)待不定芽伸长至一定长度，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体。2、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于步骤(l)中所述6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增方法如下上游引物5'-GGTTACTTCCCGTAGGATTC-3';下游引物5'-CGCTACCAGCGATTTATTC-3';扩增模板大肠杆菌K12菌株DNA;反应条件94'C反应5分钟，然后按94'C变性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸30秒进行35个循环，72t:延伸10分钟。3、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于步骤(2)中所述的表达载体为pMBIA1301，其上的抗生素标记基因hyg由步骤(l)中PCR扩增的manA基因替换。4、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(3)中，所述杨树试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，所述的基本培养基为MS，蔗糖2530g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。5、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(4)中所述的预培养条件为培养温度25±2°C，光照3000~40001ux，光照时间16~18小时/天；所述叶盘分化培养基T为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.002~0.003mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.5~0.6mg/L，蔗糖25~30g/L，pH5.6~5.8，琼脂6~7g/L。6、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于步骤(5)中所述基本培养基MS液体培养基悬浮菌体的OD6oo值为0.3~0.4。7、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(6)中所述的乙酰丁香酮在叶盘分化培养基T中的浓度为50100拜ol/L。8、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(7)中所述的叶盘分化筛选培养基W为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.002~0.003mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.5~0.6mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。9、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(8)中所述的不定芽伸长筛选培养基Y为MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.001~0.002mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.2~0.3mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。10、根据权利要求1所述的杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，其特征在于在步骤(9)中所述的生根筛选培养基G为1/2MS中的生长素IAA的浓度为0.1~0.2mg/L，甘露糖8g/L，蔗糖22g/L，pH5.6~5.8，琼脂67g/L。全文摘要本发明公开了一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，该方法包括从甘露糖标记基因表达载体的构建、受体材料的选择、培养基及培养条件的筛选等方面建立杨树利用甘露糖选择标记基因的高效遗传转化技术系统。本发明的方法在短时间内可选育杨树具生物安全的转基因新品种及与其它选择标记基因表达载体结合使用进行多个目的基因的遗传转化。文档编号A01H4/00GK101381737SQ20081015532公开日2009年3月11日申请日期2008年10月27日优先权日2008年10月27日发明者琳查,王伟东,晨续,诸葛强申请人:南京林业大学