专利名称：欧美杨组织培养获得再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
我国的杨树基因工程已经取得了许多成果，但转基因受体杨树多不是主栽品种， 已有转基因杨树其速生性和适应性都受到先天条件的局限，许多基因工程研究成果未能在 林业生产中广泛应用(参见卢孟柱胡建军于2006年在林业科技开发上发表的我国转基因 杨树的研究及应用现状)。为了使杨树基因工程改良研究与林业生产实际应用更紧密结合， 从生产中一些重要的主栽品种的遗传转化进行突破具有重大现实意义，目前世界上人工栽 培的杨属品种有90%以上都源于黑杨派即欧美杨。欧美杨2001适应性强，在耐寒、耐旱、抗 病虫等方面都具有优越性，适宜在中国西部及华北地区广泛种植；欧美杨2001是一种理想 的转基因受体材料，因此外植体的高效的组培再生体系成功建立，对其生物学研究、遗传改 良和遗传转化研究工作奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法。 本发明的技术方案在于采用一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法，该方法包
括以下步骤 ①无菌外植体的获得以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄清洗消毒获得无菌叶柄 外植体； ②愈伤组织的诱导分化将无菌叶柄接种于诱导培养基上，两周后开始分化出大 量不定芽，14-20天继代培养一次； ③抽茎及壮苗将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基上，抽茎培养至丛生芽高
于2cm后，将丛生苗转移至壮苗培养基上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗； ④生根培养将无根苗单株接种到生根培养基中，培养获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗。 所述的诱导培养基为MS+TDZO. 025-0. lmg/L+6-BAO. 025-0. lmg/ L+NAAO. 02-0. lmg/L+蔗糖20-40g/L。所述的抽茎培养基为MS+KTO. 5-lmg/L+GA3 l_4mg/L+果糖20-40g/L。
所述的壮苗培养基不含植物激素的MS+蔗糖20-40g/L。 所述的生根培养基1/2MS+IBA0. 02-0. lmg/L+IAA0. 02-0. lmg/L+活性炭l_5mg/ L+蔗糖20-40g/L。 所有培养基均含4-6g/L的琼脂，pH值为5. 6_6. 2。 所述的组织培养的培养温度应控制在24-26°C，光照强度为1500-20001x，光照时 间为12-16小时。
所述的叶柄清洗消毒的方法包括叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台 中用70% _75%乙醇处理30-508，无菌水冲洗除去残留物；再用0. 5_lg/L氯化荥溶液消毒 3-6分钟，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体。
本发明所使用的欧美杨为欧美杨2001。 本发明方法的优势在于培养过程便于操作和控制，周年可重复生产，能有效满 足全年对杨树组培苗的要求；且本发明方法中不定芽的诱导率最高可达100%，生根率达 96.7%以上，提高了通过组织培养获得再生植株的效率。
图1为本发明方法获得的再生植株各阶段生长情况示意图，a为丛生芽，b为抽茎 的丛生芽，c为壮苗后的丛生芽，d为生根后的幼苗。
具体实施方式
实施例1 本实施例欧美杨组织培养获得再生植株的方法包括以下步骤 ①无菌外植体的获得以欧美杨2001 —年生枝条扦插苗上新生健康嫩枝为材料， 将叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用70X乙醇处理30s，无菌水冲洗除 去残留物；再用lg/L氯化汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄 外植体； ②愈伤组织的诱导分化将无菌叶柄接种于诱导培养基(MS+TDZ0. 05mg/ L+6-BA0. 05mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L， pH值为5. 8)上，5d后切口部变红 膨大，开始形成绿色愈伤组织，14d后愈伤组织上开始出现大量的不定芽，芽丛生无茎(图 l-a)，每隔15d在诱导培养基上继代一次，共接种120个无菌叶柄段，所有叶柄均能诱导分 化出丛生芽，不定芽诱导率达100% ; ③抽茎及壮苗丛生芽连同原外植体转接到抽茎培养基(MS+KTO. 5mg/L+GA32mg/ L+果糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8)上，抽茎培养，丛生芽细弱(图l_b);待丛生芽高于 2cm后，将丛生苗转移至壮苗培养基(MS+蔗糖200g/L+琼脂5g/L，pH值为5. 8)上，使丛生 苗生长为茎干健壮的无根苗(图l-c); 生根培养选择4 6cm高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA0. lmg/L+IAA 0. 02mg/L+活性炭2mg/L+蔗糖200g/L+琼脂5g/L， pH值为5. 8) 上，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点，20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根数量丰富 (图l-d)，共接种50棵无根苗，其中49棵生根，生根率达98%。 其中组织培养的培养温度应控制在25t:，光照强度为20001x，光照时间为15小时。 实施例2 本实施例欧美杨组织培养获得再生植株的方法包括以下步骤 ①无菌外植体的获得以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄于流动的自来水下冲洗 后，置于超净工作台中用70X乙醇处理30s，无菌水冲洗除去残留物；再用O. 5g/L氯化汞溶 液消毒6min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体；
②愈伤组织的诱导分化将无菌叶柄接种于诱导培养基(MS+TDZO. 025mg/ L+6-BA0. lmg/L+NAA 0. 02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L， pH值为5. 6)上，两周后开始分化 出大量不定芽，14天继代培养一次，共接种120个无菌叶柄段，其中109个叶柄能诱导分化 出丛生芽，不定芽诱导率达91% ; ③抽茎及壮苗将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基(MS+KTlmg/L+GA3 lmg/L+ 果糖20g/L+琼脂6g/L，pH值为5. 6)上，抽茎培养至丛生芽高于2cm后，将丛生苗转移至壮 苗培养基(MS+蔗糖40g/L+琼脂4g/L， pH值为5. 6)上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根 苗； 生根培养选择4 6cm高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA 0. 02mg/L+IAA0. lmg/L+活性炭lmg/L+蔗糖40g/L+琼脂4g/L， pH值为5. 6) 中，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点，20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根丰富的幼 苗，共接种60棵无根苗，其中58棵生根，生根率达96. 7% 。 其中组织培养的培养温度应控制在24t:，光照强度为15001x，光照时间为16小时。 实施例3 本实施例欧美杨组织培养获得再生植株的方法包括以下步骤 ①无菌外植体的获得以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄于流动的自来水下冲洗 后，置于超净工作台中用75X乙醇处理50s，无菌水冲洗除去残留物；再用lg/L氯化汞溶液 消毒3min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体； ②愈伤组织的诱导分化将无菌叶柄接种于诱导培养基(MS+TDZO. lmg/ L+6-BA0. 025mg/L+NAA 0. lmg/L+蔗糖40g/L+琼脂4g/L，pH值为6. 2)上，两周后开始分化 出大量不定芽，20天继代培养一次，共接种120个无菌叶柄段，其中112个叶柄能诱导分化 出丛生芽，不定芽诱导率达93% ; ③抽茎及壮苗将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基(MS+KTO. 5mg/L+GA3 4mg/ L+果糖40g/L+琼脂4g/L， pH值为6. 2)上，抽茎培养至丛生芽高于2cm后，将丛生苗转移 至壮苗培养基(MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 2)上，使丛生苗生长为茎干健壮的无 根苗； 生根培养选择4 6cm高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA0. lmg/L+IAA 0. 02mg/L+活性炭5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L， pH值为6. 2) 中，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点，20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根丰富的幼 苗，共接种40棵无根苗，其中39棵生根；生根率达97. 5% 。 其中组织培养的培养温度应控制在26t:，光照强度为20001x，光照时间为12小时。
权利要求
欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤①无菌外植体的获得以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄清洗消毒获得无菌叶柄外植体；②愈伤组织的诱导分化将无菌叶柄接种于诱导培养基上，两周后开始分化出大量不定芽，14-20天继代培养一次；③抽茎及壮苗将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基上，抽茎培养至丛生芽高于2cm后，将丛生苗转移至壮苗培养基上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗；④生根培养将无根苗单株接种到生根培养基中，培养获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗。
2. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的诱导培养基为MS+TDZ 0. 025-0. lmg/L+6-BA 0. 025-0. lmg/L+NAA0. 02-0. lmg/L+蔗糖 20-40g/L。
3. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的 抽茎培养基为MS+KT 0. 5-lmg/L+GA3 l_4mg/L+果糖20-40g/L。
4. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的 壮苗培养基不含植物激素的MS+蔗糖20-40g/L。
5. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的 生根培养基1/2MS+IBA 0. 02-0. lmg/L+IAA 0. 02-0. lmg/L+活性炭l-5mg/L+蔗糖20_40g/ L。
6. 根据权利要求2-5中任意一项所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征 在于所述培养基均含4-6g/L的琼脂，pH值为5. 6-6. 2。
7. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的 组织培养的培养温度应控制在24-26t:，光照强度为1500-20001x，光照时间为12-16小时。
8. 根据权利要求1所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的 叶柄清洗消毒的方法包括叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用70% -75% 乙醇处理30-50s，无菌水冲洗除去残留物；再用0. 5-lg/L氯化汞溶液消毒3-6min，最后用 无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体。
全文摘要
本发明涉及一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法，包括无菌外植体的获得，愈伤组织的诱导分化，抽茎及壮苗，生根培养。本发明方法便于操作和控制，周年可重复生产，能有效满足目前对杨树研究和栽培的需要；且本发明方法中不定芽的诱导率最高达100％，生根率达96.7％以上，很大程度上提高了组织培养获得再生植株的效率。
文档编号A01H4/00GK101715731SQ20091031118
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者刘爱荣, 周洲, 李永丽, 陈双臣, 陈迪新 申请人:河南科技大学