一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法
【专利摘要】本发明涉及一种茄子花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业【技术领域】。本发明通过鉴定花粉发育时期，选取花蕾，花蕾消毒，花药接种、预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明确定了花粉发育时期，外在形态学标记。本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，愈伤诱导和分化培养基成分和培养条件调节，提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行茄子花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了茄子花药培养诱导率低的难题。本发明可以获得单倍体植株，出苗率高，若应用于育种实践，可加快育种步伐，为新品种选育提供有力的手段。
【专利说明】
【技术领域】：
[0001] 本发明属农业领域，具体涉及一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法。 一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法 技术背景：
[0002] 花药培养，是适宜条件下离体花药培养成单倍体植株的组织培养技术，是单细胞 水平上获得纯系的有效方法，是重要的育种辅助手段。茄子是重要茄科蔬菜作物之一，发展 茄子生产，寻求具有抗性、优质、高产等优良性状的品种具有重要理论和实践意义。茄子杂 交优势十分显著，在品种改良上发挥了重要作用；而未被利用的茄子种质材料日益减少，种 质资源匮乏，且常规育种手段时间长、工作量大、效率低；应用花药培养技术获得单倍体植 株，可克服杂种性状的分离，短时间固定和分析杂种植株的新遗传组合；经染色体加倍后， 得到基因位点纯合的新品系，精确、快速创造新种质。常规育种获得遗传稳定自交系一般需 要5?8年，而花药培养只需1?2年，省去多代自交的繁琐过程，且避免了优质基因的丢 失；花药培养用于茄子育种实践中，大大缩短育种周期，开辟了一条新品种选育的新途径。
[0003] 茄子花药培养有诸多优点，但由于花粉发育时期选择、花药培养组织褐化、愈伤组 织诱导及分化频率低等因素，诱导率极低，重复性操作不强，目前仍未能应用于茄子育种。
【发明内容】
：
[0004] 本发明目的在于针对【背景技术】提出的茄子花药培养效率低问题，提供一种茄子花 药培养方法，获得单倍体再生植株。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0006] -种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
[0007] ⑴取花粉发育处于单核中后期的花药；
[0008] ⑵接种至预处理培养基上，预处理；
[0009] ⑶将预处理后的花药，在24°C?28°C条件下暗培养6?7d至花药顶端出现黄 白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1°C /夜温22±1°C、光照2000? 3000LX、光周期14h ?(Γ1条件下培养12?16天后，转接至增殖培养基上继续培养至愈伤组 织直径为〇. 4?0. 6cm ;
[0010] ⑷将直径为〇. 4?0. 6cm的愈伤组织转接至1/2B5分化培养基，在昼温25± 1°C / 夜温22± 1°C、光照3000?4000LX、光周期16h ?(Γ1条件下分化培养至愈伤组织直径为1? 2cm，然后转接至Β5分化培养基继续培育获得再生植株；
[0011] (5)移栽。
[0012] 所述的预处理培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0013] 所述预处理的过程为：置于4°C暗处理45?50h ;后移至36°C处理120?150h。
[0014] 所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0. 2mg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · Γ1? 2.0mg · 1^0+2%?3%蔗糖+0.6%?0.8%琼脂，ρΗ5·8?6 ;所述的增殖培养基为 MS+O. lmg · L 1 ?0· 25mg · L 工2, 4-D+2. Omg · L 1 ?3. Omg · L % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ? 0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6。
[0015] 所述的 1/2Β5 分化培养基为 1/2Β5+0· Olmg · Γ1 ?0· 02mg · L^NAA+t Omg · Γ1 ? 6. Omg · L iT+l· Omg · L 1 ?5. Omg · L WcC 维生素 C)+2 % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ?0· 8 % 琼 月旨，ρΗ5· 8 ?6 ;所述的 B5 分化培养基为 Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+e. Omg · L 1 ? 8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ?10. Omg · L 40+2% ?3%鹿糖 +0· 6% ?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ? 6。
[0016] 本发明所述培养基中蔗糖和琼脂的浓度单位为质量百分比。
[0017] 步骤（5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养 基，50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比 2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30?35d后定植于棚室。
[0018] 步骤（1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00? 11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾； 花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min;然后依次用75 % (体积百分比）乙醇溶 液浸0. 5min，6. 5 %次氯酸钠溶液（取市售次氯酸钠分析纯6. 5ml加水定容至100ml)消毒 15min，最后用无菌水冲洗3?4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
[0019] 本发明方法的最优选技术方案为：
[0020] ⑴取花粉发育处于单核中后期的花药
[0021] 取材：植株盛花期，于晴天上午9:00?11:00,选取对茄、四门斗或八面风花蕾；醋 酸洋红染色压片法镜检选取花粉发育时期处于单核中后期的花蕾；适宜生长环境条件下花 芽分化后24?26d，即开花前6?8d花蕾。选取对茄、四门斗、八面风等生长活跃部位、花 药活力旺盛、花粉发育至单核中后期的花蕾，提高愈伤诱导频率。
[0022] 消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min ;超净工作台内，用75%的乙醇表面 消毒0. 5min，然后用6. 5%的次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3?4次，每次 5min ;无菌条件下，将花药从消毒的花蕾中完整剥离、取出。
[0023] ⑵接种至预处理培养基上，预处理
[0024] 将取出的花药接种于MS预处理培养基上，Parafilm封口膜封口。
[0025] 预处理培养基：MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0026] 预处理：接种后，置于4°C暗处理45h?50h ;然后移至36°C处理120h?150h。通 过预处理可显著提高愈伤组织诱导频率。
[0027] ⑶愈伤组织诱导、培养：预处理后的花药，移至24°C?28°C组织培养室中暗培养。 6?7d后花药顶端现黄白色组织，转接至愈伤组织诱导培养基，置于昼温25土 1°C /夜温 22±1°C、光照2000?3000LX、光周期14h · cf1条件下培养。12?16d后愈伤组织转接至 增殖培养基上继续培养至愈伤组织直径为〇. 4?0. 6cm。花药壁组织与小孢子共培养，能提 高愈伤组织的诱导频率。
[0028] 愈伤组织诱导培养基：MS+0. 2mg · Γ1 ?0· 25mg · 1^2, 4-D+l. Omg · Γ1 ? 2. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0029] 增殖培养基：]^+0.111^吨1?0.2511^吨12,4-〇+2.〇11^吨1?3.〇11^吨 10+2(%? 3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6。
[0030] ⑷植株诱导：愈伤组织直径0. 4?0. 6cm，转接至1/2Β5分化培养基，置于昼温 25±1°C /夜温22±1°C、光照3000?4000LX、光周期16h .(Γ条件下分化培养。18?24d 后愈伤组织直径1?2cm，转接至B5分化培养基继续培养。愈伤组织周围逐渐产生黄绿色 小点，并逐渐发育成小苗。
[0031] 1/2B5 分化培养基：1/2Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6. Omg · L kT+l. Omg · L 1 ?5. Omg · L 40+2%?3%鹿糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
[0032] Β5 分化培养基：Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+G· Omg · L 1 ? 8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ?10. Omg · L 40+2% ?3%鹿糖 +0· 6% ?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ? 6。
[0033] (5)移栽：移植前2d打开瓶盖；移栽时，将再生植株取出，洗净培养基，50 %多菌灵 可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干，移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比2:1)的穴盘；穴 盘置于育苗棚内驯化，30?35d后定植于棚室。
[0034] 染色体鉴定：采用染色体计数直接鉴定法，显微镜下观察统计根尖细胞中期染色 体，再生植株染色体倍性检测。
[0035] 本发明通过培养成分和培养条件的调节，降低愈伤组织褐化的发生，提高诱导频 率。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 本发明提供了一种茄子花药培养技术，利用茄子花药培养获得了单倍体再生植 株，出苗率高，若应用于育种实践，可加快育种步伐。
[0038] 本发明采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，愈伤诱导和 分化培养基成分和培养条件调节，提高了愈伤诱导频率和愈伤组织的分化能力。通过本发 明的方法培育爺子单倍体植株，其愈伤诱导率达到60%以上，出苗率达到80%以上。本发 明的茄子花药培养技术获得再生单倍体植株，解决了茄子花药培养诱导率低的难题；花药 培养可获得大量的新基因型纯系，丰富了种质资源，为茄子新品种选育提供更有效的手段。
【具体实施方式】：
[0039] 本实例以综合优良性状的杂交一代茄子组合S8847、S8889作为试验材料，采用本 发明方法获取了单倍体植株。实施过程如下：
[0040] 一、取材
[0041] 5月上旬，试材盛花期于晴天上午10:00采集对茄、四门斗的花蕾。醋酸洋红染色 压片法镜检花粉发育时期，确定花粉发育时期和花药形态的相关性。选取花粉发育处于单 核中后期的花蕾，蕾长12. 0?13. 5_，蕾直径6. 5?7. 5_，花萼包裹花冠、先端微微张开 略现花冠顶部，花药呈绿黄色；适宜生长环境条件下，花芽分化后24?26d，即开花前6? 8d花蕾。
[0042] 二、消毒
[0043] ⑴培养基灭菌与分装：60mm培养皿、三角瓶、固体培养基等121°C、1. IMpa灭菌 20min。超净工作台内分装，每一培养皿8ml培养基。
[0044] ⑵试材消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗30min ;超净工作台内，冲洗后的花蕾用
【权利要求】
1. 一种茄子花药培养获得单倍体再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤： ⑴取花粉发育处于单核中后期的花药； ⑵接种至预处理培养基上，预处理； ⑶将预处理后的花药，在24°C?28°C条件下暗培养6?7d至花药顶端出现黄白色组 织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25 ± 1 °C /夜温22 ± 1 °C、光照2000?3000LX、光 周期14h · cf1条件下培养12?16天后，转接至增殖培养基上继续培养至愈伤组织直径为 0. 4 ?0. 6cm ; ⑷将直径为0. 4?0. 6cm的愈伤组织转接至1/2B5分化培养基，在昼温25土 l°C /夜 温22土 1°C、光照3000?4000LX、光周期16h · cf1条件下分化培养至愈伤组织直径为1? 2cm，然后转接至B5分化培养基继续培育获得再生植株； (5)移栽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预处理培养基为MS+0. lmg · Γ1? 0.211^*]^12,4-0+0.511^*]^1?1.011^*]^11(丁+2 (%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8? 6。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述预处理的过程为：置于4°C暗处理 45?50h ;后移至36°C处理120?150h。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的愈伤组织诱导培养基 为 MS+0. 2mg · L 1 ?0· 25mg · L 4-D+1. Omg · L 1 ?2. Omg · L % ?3 % 蔗糖+0. 6 %?0. 8 %琼脂，pH5. 8?6 ;所述的增殖培养基为MS+0. lmg · L-1? 0· 25mg *L 4-D+2. Omg *L 1 ?3. Omg *L ?3%鹿糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ? 6。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的1/2Β5分化培养基为 l/2B5+0. Olmg · L 1 ~ 0. 02mg · L 1NAA+4. Omg · L 1 ~ 6. Omg · L ^T+l. Omg · L 1 ~ 5. Omg · I^VC+2 %?3 %蔗糖+0· 6 %?(λ 8 %琼脂，pH5. 8?6 ;所述的B5分化培养 基为 Β5+0· Olmg · L 1 ?0· 02mg · L iNAA+e. Omg · L 1 ?8. Omg · L ^Τ+δ. Omg · L 1 ? 10. Omg · L-1VC+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5)中所述移栽的过程为：提前2d打 开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养基，50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移 植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30?35d后定植于 棚室。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中所述单核中后期花药的取出过 程为：植株盛花期于晴天上午9:00?11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉 发育时期，选取处于单核中后期花蕾；花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min ; 然后依次用75%乙醇溶液浸0. 5min，6. 5 %次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗 3?4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。
【文档编号】A01H4/00GK104041415SQ201410274444
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】张燕燕, 缪其松, 唐懋华, 刘叶琼, 黄忠阳, 魏猷刚, 胡静, 孙雪花 申请人:南京市蔬菜科学研究所