一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，包括：取紫花菜花蕾，灭菌后加入B5洗涤培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；依次加入NLN‐13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子悬浮液；分装到无菌培养皿中后加入无菌甘蓝花药，Parafilm封口后热击处理；经常规培养后，得到子叶型胚状体；接种至胚状体分化培养基中直至分化，再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株。该方法将易出胚的甘蓝花药与难出胚的紫花菜游离小孢子按一定比例混合培养，从而促进难出胚的紫花菜胚胎发育，获得大量再生植株，提高培养效率。
【专利说明】一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养【技术领域】，尤其涉及紫花菜单倍体植株的培养方法。
【背景技术】
[0002] 紫花菜（Brassica oleracea var. botrytis)属十字花科芸薹属甘蓝种，原产西欧 沿海意大利一带，是花椰菜的变种，花球紫红色，品质优良，风味极佳。其他性状与花椰菜相 似。紫花菜营养丰富，富含蛋白质、维生素 C，粗纤维少，此外，还含有维生素 A，B1、B2和蔗 糖、果糖、硒等，风味鲜美，能提高人体免疫功能，促进肝脏解毒，增强人的体质和抗病能力。 含有的硒能够抑制癌细胞的生长。
[0003] 目前，生产上使用的紫花菜品种，多为外国进口，种子价格昂贵，而国内种质资源 匮乏，受制于人。紫花菜杂种优势明显，自交分离获得纯合稳定的自交系一般需要5?6年 的时间，而游离小孢子培养技术可在1?2年内获得单倍体植株，加倍后成为纯合自交系， 因此在紫花菜优良自交系的创制和提高新品种选育效率方面具有重要应用价值。虽然国 内外学者对十字花科植物小孢子培养技术应用做了大量深入的研究，但有关紫花菜小孢子 培养技术应用却没有报道。本文在前期研究的基础上，采用紫花菜游离小孢子与甘蓝易出 胚基因型花药共培养，显著促进紫花菜小孢子胚胎发育，获得了大量再生植株，所需时间较 短，操作简便。
【发明内容】
[0004] 针对目前现状，本发明提供了一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，采用紫花 菜小孢子与易出胚的甘蓝花药按一定数目配比共培养，显著促进紫花菜小孢子胚胎发育， 促进紫花菜小孢子出胚，提高小孢子培养的出胚率，获得了大量再生植株，所需时间较短， 操作简便。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] -种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)取紫花菜和甘蓝花蕾，灭菌；
[0008] 2)将混合花蕾灭菌后的紫花菜游离小孢子与甘蓝花药置于培养液中，经热击后混 合培养，诱导获得子叶型胚状体；
[0009] 3)将子叶型胚状体接种至固体分化培养基中，培养得到再生植株；
[0010] 4)从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株；
[0011] 所述紫花菜小孢子胚胎发生率较低，甘蓝较易出胚。
[0012] 所述紫花菜和甘蓝的花蕾取材时间均处于单核晚期至双核早期。
[0013] 所述紫花菜和甘蓝的花蕾与花药的数量比为1 :5?8。
[0014] 所述紫花菜小孢子与甘蓝花药混合液采用32?33°C热击处理1?3天。
[0015] 所述培养液为NLN - 13液体培养基和无菌活性炭混合液的混合物，其中活性炭混 合液的组成为：1L NLN液体培养基、2?5g琼脂糖和lg活性炭。
[0016] 所述的 NLN 液体培养基，以 1L 计，组成为：KN03125mg，Ca(N03)2 · 4H20500mg， MgS04 · 7H20 125mg，KH2P04125mg，Η3Β036· 2mg，MnS04 · H20 18. 95mg，ZnS04 · 7H20 8. 6mg， Na2Mo04 · 2H20 0· 25mg，CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，维生素 B1 0· 5mg，维生 素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，叶酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeS04*7H20 27.8mg，肌醇 100mg， 甘氨酸2mg，烟酸5mg，L -谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素 B5 5mg，丝氨酸lOOmg和 余量的无菌水。
[0017] 所述小孢子悬浮液与花药混合热击后，先在25°C、黑暗条件下恒温培养10?15天 至肉眼可见细胞团出现后，移到25°C、黑暗条件下50?60rpm振荡培养10?15天，得到叶 型胚状体。
[0018] 所述固体分化培养基为B5培养基+蔗糖30g/L，琼脂10?12g/L，pH 5. 9?6. 1。
[0019] 所述的 B5 液体培养基，以 1L 计，组成为：NaH2P04 · 2H20 169. 5mg，KN03 2 5 00mg， (NH4)2S04 1 34mg，MgS04 · 7H20 500mg，MnS04 · 4H20 10mg，H3B03 3mg，ZnS04 · 7H20 2mg，KI 0· 75mg，Na2Mo04 · 2H20 0· 25mg，CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，Na2 - EDTA 37.3mg，FeS04*7H20 27.8mg，CaCl2.2H20 150mg，VBl 10mg，VB6 lmg，VPP lmg，肌醇 lOOmg和 余量的蒸馏水。
[0020] 所述生根培养基由1/2MS培养基1L+0. 1?(λ 2mg/L ΝΑΑ+(λ 1?(λ 2mg/L IBA、蔗 糖或白砂糖20?30g/L和琼脂7?8g/L组成，pH 5. 8?6. 0。
[0021] 所述的 MS 培养基，以 1L 计，组成为：NH4H03 1650mg，KN03 1 900mg，CaCl2 · 2H20 440mg，KH2P04 170mg，MgS04 · 7H20 370mg，FeS04 · 7H20 27. 8mg，Na2EDTA 37. 3mg，H3B03 6. 2mg, MnS04 ·Η20 16. 9mg, ZnS04 ·7Η20 8. 6mg, Na2Mo04 ·2Η20 0. 25mg, CuS04 ·5Η20 0. 025mg, C〇C12.6H20 (X 025mg，KI (X83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸(X5mg，维生素 B1 O.lmg，维 生素 B6 0. 5mg和余量的无菌水。
[0022] 本发明的有益效果为：
[0023] (1)本发明针对紫花菜小孢子培养难出胚的问题，提供了一种快速获得单倍体植 株的简便方法。以易出胚的甘蓝花药与紫花菜游离小孢子按一定比例混合共培养，以易出 胚的甘蓝花药带动难出胚的材料出胚，提高出胚率。本发明方法共培养紫花菜出胚率最高 达15. 5个/蕾，而对照出胚率最高仅为1. 4个/蕾，且胚状体的质量也得到很大改善，解决 了紫花菜小孢子培养胚胎发生率低的问题，提高了小孢子培养技术的应用效率。
[0024] (2)最终在相同培养条件下，混合培养最后得到了 68株紫花菜小孢子再生植株， 而单独培养的对照株数为2株。
[0025] (3)所采用的方法简便易行，培养得到的小孢子再生植株群体均为紫花菜，不需要 对植株类型进行鉴定，从而减少了工作量，提高了培养效率，具有可操作性。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] 培养方法按如下步骤进行。
[0028] (1)培养基配制：包括小孢子不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培 养基中所含的重量为 ：
[0029] 1)B5洗涤培养基：B5液体培养基1L+蔗糖30g/L，pH 6. 0,高温高压；
[0030] 所述的 B5 液体培养基，以 1L 计，组成为：NaH2P04 · 2H20 169. 5mg，KN03 2 5 00mg， (NH4)2S04 1 34mg, MgS04 · 7H20 500mg, MnS04 · 4H20 lOmg, H3B03 3mg, ZnS04 · 7H20 2mg, KI 0. 75mg, Na2Mo04 · 2H20 0. 25mg, CuS04 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, Na2 - EDTA 37.3mg,FeS04.7H20 27.8mg,CaCl2.2H20 150mg,VBl 10mg,VB6 lmg,VPP lmg,肌醇 lOOmg和 余量的蒸馏水。
[0031] 2)胚状体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂10g/L，pH 6. 0,高温高压灭 菌；
[0032] 3)NLN - 13诱导培养基，NLN液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 0,过滤灭菌；
[0033] 所述的 NLN 液体培养基，以 1L 计，组成为：KN03 125mg，Ca(N03)2 · 4H20 500mg， MgS04 · 7H20 125mg，KH2P04125mg，Η3Β036· 2mg，MnS04 · H20 18. 95mg，ZnS04 · 7H20 8. 6mg， Na2Mo04 · 2H20 0· 25mg，CuS04 · 5H20 0· 025mg，CoCl2 · 6H20 0· 025mg，维生素 B1 0· 5mg，维生 素 B6 0.5mg，生物素 0.05mg，叶酸 0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeS04*7H20 27.8mg，肌醇 lOOmg， 甘氨酸2mg，烟酸5mg，L -谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B5 5mg，丝氨酸lOOmg和 余量的无菌水。
[0034] 4)生根培养基：MS培养基+蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH 5. 8,高温高压灭菌；
[0035] 所述的 MS 培养基，以 1L 计，组成为：NH4H03 1650mg，KN03 1 900mg，CaCl2 · 2H20 440mg，KH2P04 170mg，MgS04 · 7H20 370mg，FeS04 · 7H20 27. 8mg，Na2EDTA 37. 3mg，H3B03 6. 2mg, MnS04 ·Η20 16. 9mg, ZnS04 ·7Η20 8. 6mg, Na2Mo04 ·2Η20 0. 25mg, CuS04 ·5Η20 0. 025mg, C〇C12.6H20 (X 025mg，KI (X83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸(X5mg，维生素 B1 O.lmg，维 生素B6 0. 5mg和余量的无菌水。
[0036] (2)紫花菜小孢子与甘蓝花药共培养促进胚胎发生的培养方法：
[0037] 1)花蕾选取：取紫花菜花瓣和花药长度比为0. 85、甘蓝为0. 9、单核晚期至双核早 期、健康、无病虫害的花蕾，作为小孢子培养的供体；
[0038] 2)花蕾的灭菌：用lg升汞+1L无菌水配制成灭菌液；把紫花菜和甘蓝混合花蕾放 入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒10分钟，再在超净工作台上 用无菌水荡洗3次后，备用；
[0039] 3)在超净工作台上将12个无菌花蕾置于无菌烧杯中，加入10ml B5洗涤培养基， 用平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液；该悬浮液用45 μ m孔径的无菌滤网过滤到50ml离心管 中，盖紧，600rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5洗漆培养基，按 上述方法再离心2次，弃上清液；加入NLN - 13诱导培养基40ml，再加入由NLN - 13液体培 养基+琼脂糖5g/L+lg/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的 浓度为1X 1〇5个/mL的小孢子混合悬浮液；
[0040] 4)将该小孢子悬浮液分装到60mm塑料无菌培养皿中，每60mm培养皿加4ml小孢 子混合悬浮液和5个甘蓝无菌花药，加盖后用parafilm膜封口，后置于32. 5°C恒温生化培养 箱里、黑暗条件下热激处理2天；然后取出置于25°C恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养； 至肉眼可见胚状体时，置于25°C摇床上、黑暗条件下摇动培养20天，得到子叶型胚状体并 发育成熟；
[0041] 5)将子叶型胚状体接种至胚状体分化培养基中，在每天16小时光照、25°C下培养 3周至形成胚状体；按照一定大小把胚状体切成3块大小差不多的块，接种到胚状体分化培 养基中在相同条件下继续培养，直至分化、再生成芽；
[0042] 6)切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C下进行 生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗3天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基， 后把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养10天后移栽，得到 再生植株；
[0043] (3)除了步骤1)中仅取紫花菜生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体 植株之外，其它操作同"（2)紫花菜小孢子与甘蓝花药共培养促进胚胎发生的培养方法"，作 为对照。
[0044] 结果：混合培养紫花菜出胚率为9. 5个/蕾，而对照出胚率仅为0. 8个/蕾。最 终，混合培养得到67株紫花菜小孢子再生植株，而对照获得0株。
[0045] 实施例2
[0046] 除了步骤（1)中1)B5洗涤培养基：B5液体培养基1L+蔗糖30g/L，pH 6. 0,高温高 压；2)NLN - 13诱导培养基：NLN - 13液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 1，过滤灭菌；3)胚 状体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂llg/L，pH 6. 0,高温高压灭菌；4)生根培养 基：MS培养基+白糖20g/L，琼脂7g/L，pH 5. 9,高温高湿灭菌；
[0047] (2)紫花菜小孢子与甘蓝花药共培养促进胚胎发生的培养方法：
[0048] 1)花蕾选取：取紫花菜花瓣和花药长度比为1. 0、甘蓝为1. 0、单核晚期至双核早 期、健康、无病虫害的花蕾，作为小孢子培养的供体；
[0049] 2)花蕾的灭菌：用lg升汞+1L无菌水配制成的灭菌液；把紫花菜和甘蓝混合花蕾 放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒12分钟，再在超净工作台 上用无菌水荡洗4次后，备用；
[0050] 3)在超净工作台上将13个无菌紫花菜花蕾置于无菌烧杯中，加入10ml B5洗涤 培养基，用平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液；该悬浮液用45 μ m无菌滤网过滤到50ml离心管 中，盖紧，900rpm/min离心5min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5诱导培养基，按 上述方法再离心1次，弃上清液；加入NLN - 13诱导培养基40ml，再加入由NLN - 13液体培 养基+琼脂糖2g/L+lg/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的 浓度为〇. 8X 105个/mL的小孢子悬浮液；
[0051] 4)将该小孢子悬浮液分装到90mm玻璃无菌培养皿中，每90mm培养皿加10ml小孢 子混合悬浮液和8个甘蓝花药，加盖后用parafilm膜封口，后置于33°C恒温生化培养箱里、 黑暗条件下热激处理3天；后取出置于25°C恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养；至肉眼可 见胚状体时，置于25°C摇床上、黑暗条件下摇动培养25天，得到子叶型胚状体并发育成熟；
[0052] 5)将子叶型胚状体接种至胚状体分化培养基中，在每天16小时光照、25°C下培养 2周至形成胚状体；把胚状体直接接种到胚状体分化培养基中在相同条件下继续培养，直 至分化、再生成芽；
[0053] 6)切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C下进行 生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗5天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基， 后把植株植于蔬菜育苗基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养8天后移栽，得到再生植 株；
[0054] 其余操作同实施例1。
[0055] 结果：共培养紫花菜出胚率为14. 2个/蕾，而对照出胚率仅为1. 5个/蕾。最终， 混合培养得到66株紫花菜小孢子再生植株，而对照获得1株。
[0056] 实施例3
[0057] 除了步骤（1)中1)B5洗涤培养基：B5液体培养基1L+蔗糖30g/L，pH 6. 0,高温高 压；2)NLN - 13诱导培养基：NLN - 13液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH 6. 1，过滤灭菌；3)胚 状体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂llg/L，pH 6. 0,高温高压灭菌；4)生根培养 基：MS培养基+白糖20g/L，琼脂7g/L，pH 5. 9,高温高湿灭菌；
[0058] (2)紫花菜小孢子与甘蓝花药共培养促进胚胎发生的培养方法：
[0059] 1)花蕾选取：取紫花菜花瓣和花药长度比为1. 1、甘蓝为1. 1、单核晚期至双核早 期、健康、无病虫害的花蕾，作为小孢子培养的供体；
[0060] 2)花蕾的灭菌：用lg升汞+1L无菌水配制成的灭菌液；把紫花菜和甘蓝混合花蕾 放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒11分钟，再在超净工作台 上用无菌水荡洗5次后，备用；
[0061] 3)在超净工作台上将11个无菌紫花菜花蕾置于无菌烧杯中，加入10ml B5诱导 培养基，用平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液；该悬浮液用45 μ m无菌滤网过滤到50ml离心管 中，盖紧，700rpm/min离心5min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5诱导培养基，按 上述方法再离心2次，弃上清液；加入NLN - 13诱导培养基40ml，再加入由NLN - 13液体培 养基+琼脂糖3. 5g/L+lg/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子 的浓度为1. 2 X 105个/mL的小孢子混合悬浮液；
[0062] 4)将该小孢子悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4ml小孢 子混合悬浮液和6个无菌甘蓝花药，加盖后用parafilm膜封口，后置于33°C恒温生化培养箱 里、黑暗条件下热激处理2天；后取出置于25°C恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养；至肉 眼可见胚状体时，置于25°C摇床上、黑暗条件下摇动培养22天，得到子叶期胚状体并发育 成熟；
[0063] 5)将子叶期胚状体接种至胚状体分化培养基中，在每天16小时光照、25°C下培养 2. 5周至形成胚状体；把胚状体切成2块大小差不多的块接种到胚状体分化培养基中在相 同条件下继续培养，直至分化、再生成芽；
[0064] 6)切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25°C下进行 生根培养；3周后炼苗4天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，然后把植株植于育苗专 用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养9天后移栽，得到再生植株；
[0065] 其余操作同实施例1。
[0066] 结果：共培养紫花菜出胚率为13. 6个/蕾，而对照出胚率仅为1. 5个/蕾。最终， 混合培养得到70株紫花菜小孢子再生植株，而对照获得3株。
【权利要求】
1. 一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，包括以下步骤： 1) 取紫花菜和甘蓝的花蕾，灭菌； 2) 将混合花蕾灭菌后的紫花菜游离小孢子与甘蓝花药置于培养液中，经热击后混合培 养，诱导获得子叶型胚状体； 3) 将子叶型胚状体接种至固体分化培养基中，培养得到再生植株； 4) 从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株。
2. 根据权利要求1所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于，所述紫 花菜和甘蓝的花蕾取材时期均为单核晚期至双核早期。
3. 根据权利要求1或2所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于，所述 紫花菜花蕾与甘蓝花药的数量比为1 :5?8。
4. 根据权利要求3所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于，步骤2) 中所述紫花菜小孢子与甘蓝花药混合液采用32?33°C热击处理1?3天。
5. 根据权利要求1或2或4所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于， 步骤2)中所述培养液为NLN -13液体培养基和无菌活性炭混合液的混合物，其中所述活性 炭混合液的组成为：1L NLN液体培养基、2?5g琼脂糖和lg活性炭。
6. 根据权利要求4所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于，所述小 孢子悬浮液与花药混合热击后，先在25°C、黑暗条件下恒温培养10?15天至肉眼可见细胞 团出现后，移到25°C、黑暗条件下50?60rpm振荡培养10?15天，得到子叶型胚状体。
7. 根据权利要求1或2或4或6所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在 于，步骤3)中所述固体分化培养基为B5培养基+蔗糖30g/L，琼脂10?12g/L，pH 5. 9? 6. 1。
8. 根据权利要求1或2所述一种快速获得紫花菜单倍体植株的方法，其特征在于，所 述生根培养基由1/2MS培养基1L+0. 1?0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 1?0. 2mg/LIBA、蔗糖或白砂糖 20?30g/L和琼脂7?8g/L组成，pH 5. 8?6. 0。
【文档编号】C05G1/00GK104186310SQ201410371326
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】张振超, 毛忠良, 潘跃平, 吴国平, 王建华, 戴忠良, 秦文斌, 姚悦梅, 潘永飞, 肖燕, 孙春青, 马志虎, 孙国胜 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所