专利名称：百合抗病性植株的离体快速培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物培养方法，尤其是一种百合抗病性植株的离体快速培养方法，属于植物培育技术领域。
背景技术：
百合(Lilium)是世界上重要的商品花卉之一，近年来生产和消费呈逐年上升趋势。据统计，目前全球百合种球的贸易额达20多亿美元，年贸易量超过25亿粒以上。东方百合杂种群主要利用天香百合(L.auratum)的花型和药百合(L.speciosum)的深红、深粉、粉色等艳丽的花色及其芳香宜人的遗传特性，培育出的具有靓丽的花型和鲜艳色泽的各种百合新品种。近年来，东方百合杂种的栽培面积越来越大，在切花生产中占据重要地位。但病虫害问题一直是制约切花百合质量提高的首要因素。由土传真菌Fusarium oxysporum f.sp.lilii引起的种球基盘腐烂是百合最严重的病害之一，全世界百合种植区均有感染和为害的报道。
为有效控制百合种球基盘腐烂而引起枯萎的病害，多年来国内外科研工作者对这种病害的病原生物学、病害流行学以及防治方法等方面进行了研究，摸清了百合枯萎病菌的习性和枯萎病的发生规律，然而，对其防治，迄今主要采取化学方法。但化学防治会带来环境方面的问题。选育和合理利用抗病品种是防治百合枯萎病的有效手段之一。但通过常规杂交选育百合新品种是一个漫长的过程，通常培育一个百合新品种至少需要10年以上的时间，采用体细胞离体筛选技术，可加速抗性育种进程。
高等植物抗病突变体的离体筛选，是利用组织培养技术，采用病菌毒素或毒素类似化学物质，在细胞水平上选择抗病突变体的新技术，是高等植物抗病育种微生物化的一种尝试。利用病原菌毒素或类似物质作为选择剂，已筛选出抗甜菜褐斑病、抗油菜黑胫病、抗烟草野火病、抗水稻纹枯病、抗玉米小斑病、抗小麦赤霉病、抗草莓灰霉病、抗茄子黄萎病、抗番茄晚疫病、抗西瓜枯萎病和抗香蕉枯萎病等突变体。但在百合上面，还没有做过相关的尝试。
发明内容
本发明的目的在于提供一种百合抗病性植株的离体快速培养方法。
本发明在东方百合组织培养过程中，利用镰刀菌毒素粗提液对组织细胞进行抗性突变体筛选，以获得抗镰刀菌的育种中间材料——百合植株。
本发明通过下列技术方案完成一种百合抗病性植株的离体快速培养方法，其特征在包括下列步骤 A、将消毒灭菌处理过的花丝、鳞片在无菌环境中，接种在pH为5.8～6.0的下列诱导培养基中 MS培养基 2，4-D 1.0-8.0mg/L Picloram1.0-8.0mg/L KT 0.1-1.0mg/L ABA 0.1-1.0mg/L TDZ 0.01-0.05mg/L 糖 30-40g/L 琼脂6g/L 并在温度为22～28℃，全黑暗条件下诱导培养至形成愈伤组织； B、将上述愈伤组织置于pH为5.8～6.0的下列继代培养基中 MS培养基 Picloram1.0-2.0mg/L KT 0.1-0.5mg/L ABA 0.1-0.5mg/L TDZ 0.01-0.05mg/L 糖 30-40g/L 琼脂 6g/L 在温度为22～28℃、全黑暗条件下进行继代培养，每20天继代一次，继代三次后得到继代愈伤组织； C、将上述继代愈伤组织接种在含有镰刀菌毒素的pH为5.8～6.0的下列选择培养基上 MS培养基 Picloram1.0-2.0mg/L TDZ 0.01-0.05mg/L 水解酪蛋白 300-600mg/L 酵母提取物 300-600mg/L 体积浓度为60～80％的镰刀菌毒素液0.3-0.4L/L 在温度为22～28℃，全黑暗条件下培养7-10天； D、将上述步骤C培养存活的愈伤组织转入下列pH为5.8-6.0的继代培养基上 MS培养基 KT 0.1-0.5mg/L BA 0.8-1.2mg/L IBA0.1-0.5mg/L 在光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-12小时/天，培养温度为22～28℃条件下，培养至分化出百合植株。
所述步骤A的消毒灭菌处理包括 a、将刚现蕾的百合小花苞依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20-40秒、质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌10-20分钟、体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒5-15分钟，用无菌水漂洗3次，将小花苞剥开后取花丝，备用； b、将鳞片依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20-40秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌20-30分钟、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒10-20分钟，用无菌水漂洗3次，备用。
所述步骤C的镰刀菌毒素液经过下列方法将镰刀菌切块接种于现有技术中的常规马铃薯蔗糖培养液中，于22-25℃，转速100-120r/min条件下，振荡培养至菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，过滤菌丝和孢子，滤液于250-300r/min转速下离心分离15-20min后，去沉淀物，上清液煮沸10-15min，冷却后，过滤灭菌，即得到无菌的镰刀菌毒素液，备用。
所述步骤C的镰刀菌毒素液也可采用市购产品。
所述镰刀菌为公知公用的市购产品。
所述培养基中的各成份均为市购产品。
本发明具有下列优点和效果采用上述方案，可为获得大量的抗镰刀菌的百合株系提供可靠技术支持，且该方法在有效提供抗病性株系的同时，还将为百合细胞工程育种提供一条快速、有效、稳定的技术路径。
本发明主要解决了下列难题诱导出较好的愈伤组织，并多次继代后获得疏松的胚性愈伤组织，利用镰刀菌毒素培养基多次加压筛选后获得抗病性百合植株，缩短了百合抗病育种的周期。
本发明通过采取百合花丝、鳞片诱导愈伤组织、利用镰刀菌毒素培养基多次加压筛选后获得抗病性百合植株，解决百合抗病育种周期长的问题，实现了百合的定向育种。其优越性体现在 1、提供了获得百合胚性愈伤组织的技术，实现了百合无性系的诱导。
2、针对东方百合抗镰刀菌差的问题，采用镰刀菌毒素加压筛选获得抗病性株系，缩短了抗病育种的周期。
3、提供了百合筛选株的抗病性相关酶活性测定的方法，实现了百合抗性突变体的快速鉴定。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步描述。本发明中未特别指明的内容，均为现有的常规技术。
实施例1 一、消毒灭菌处理 a、将刚现蕾的百合小花苞依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20秒、质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌10分钟、体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒5分钟，用无菌水漂洗3次，将小花苞剥开后取花丝，备用； b、将6-9cm的籽球鳞片依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌20分钟、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒10分钟，用无菌水漂洗3次，备用； 二、镰刀菌毒素液的制备将镰刀菌切块接种于现有技术中常规的马铃薯蔗糖培养液中，于22℃，转速120r/min条件下，振荡培养至菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，过滤菌丝和孢子，滤液于250r/min转速下离心分离20min后，去沉淀物，上清液煮沸10min，冷却后，过滤灭菌，即得到无菌的镰刀菌毒素液，备用； 三、培养 A、将消毒灭菌处理过的花丝、鳞片在无菌环境中，接种在pH为5.8的下列诱导培养基中 MS培养基 2，4-D1.0mg/L Picloram 8.0mg/L KT0.1mg/L ABA 1.0mg/L TDZ 0.01mg/L 糖30g/L 琼脂 6g/L 并在温度为22℃，全黑暗条件下诱导培养至形成愈伤组织； B、将上述愈伤组织置于pH为5.8的下列继代培养基中 MS培养基 Picloram 1.0mg/L KT 0.1mg/L ABA 0.5mg/L TDZ 0.01mg/L 糖 40g/L 琼脂6g/L 在温度为22℃、全黑暗条件下进行继代培养，每20天继代一次，继代三次后得到继代愈伤组织； C、将上述继代愈伤组织接种在含有镰刀菌毒素的pH为5.8的下列选择培养基上 MS培养基 Picloram1.0mg/L TDZ 0.01mg/L 水解酪蛋白 300mg/L 酵母提取物 600mg/L 体积浓度为60％的镰刀菌毒素液0.3L/L 在全黑暗、温度为22℃条件下，培养10天； D、将上述步骤C培养存活的愈伤组织转入pH为5.8的下列继代培养基上 MS培养基 KT 0.1mg/L BA 1.2mg/L IBA 0.1mg/L 在光照时间为10小时/天，光照强度为2200Lx，培养温度为22℃条件下，培养至诱导分化出百合植株。
实施例2 一、消毒灭菌处理 a、将刚现蕾的百合小花苞依次在体积浓度为75％的酒精中消毒40秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌20分钟、体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，用无菌水漂洗3次，将小花苞剥开后取花丝，备用； b、将6-9cm的籽球鳞片依次在体积浓度为75％的酒精中消毒40秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌30分钟、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒20分钟，用无菌水漂洗3次，备用； 二、镰刀菌毒素液为市购产品； 三、培养 A、将消毒灭菌处理过的花丝、鳞片在无菌环境中，接种在pH为6.0的下列诱导培养基中 MS培养基 2，4-D8.0mg/L Picloram 1.0mg/L KT1.0mg/L ABA 0.1mg/L TDZ 0.05mg/L 糖40g/L 琼脂 6g/L 并在温度为28℃，全黑暗条件下诱导培养至形成愈伤组织； B、将上述愈伤组织置于pH为6.0的下列继代培养基中 MS培养基 Picloram2.0mg/L KT 0.5mg/L ABA 0.1mg/L TDZ 0.05mg/L 糖 30g/L 琼脂6g/L 在温度为28℃、全黑暗条件下进行继代培养，每20天继代一次，继代三次后得到继代愈伤组织； C、将上述继代愈伤组织接种在含有镰刀菌毒素的pH为6.0的下列选择培养基上 MS培养基 Picloram2.0mg/L TDZ 0.05mg/L 水解酪蛋白 600mg/L 酵母提取物 300mg/L 体积浓度为60％的镰刀菌毒素液0.4L/L 在全黑暗、温度为28℃条件下，培养7天； D、将上述步骤C培养存活的愈伤组织转入pH为6.0的下列继代培养基上 MS培养基 KT 0.5mg/L BA 0.8mg/L IBA 0.5mg/L 在光照时间为12小时/天，光照强度为1800Lx，培养温度为28℃条件下，培养至诱导分化出百合植株。
实施例3 一、消毒灭菌处理 a、将刚现蕾的百合小花苞依次在体积浓度为75％的酒精中消毒30秒、质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌15分钟、体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒10分钟，用无菌水漂洗3次，将小花苞剥开后取花丝，备用； b、将6-9cm的籽球鳞片依次在体积浓度为75％的酒精中消毒30秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌25分钟、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，用无菌水漂洗3次，备用； 二、镰刀菌毒素液的制备将镰刀菌切块接种于现有技术中常规的马铃薯蔗糖培养液中，于25℃，转速100r/min条件下，振荡培养至菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，过滤菌丝和孢子，滤液于300r/min转速下离心分离150min后，去沉淀物，上清液煮沸15min，冷却后，过滤灭菌，即得到无菌的镰刀菌毒素液，备用； 三、培养 A、将消毒灭菌处理过的花丝、鳞片在无菌环境中，接种在pH为5.9的下列诱导培养基中 MS培养基 2，4-D 4.0mg/L Picloram 3.0mg/L KT 0.6mg/L ABA0.5mg/L TDZ0.03mg/L 糖 35g/L 琼脂 6g/L 并在温度为25℃，全黑暗条件下诱导培养至形成愈伤组织； B、将上述愈伤组织置于pH为5.9的下列继代培养基中 MS培养基 Picloram 1.5mg/L KT 0.3mg/L ABA 0.2mg/L TDZ 0.03mg/L 糖 35g/L 琼脂 6g/L 在温度为25℃、全黑暗条件下进行继代培养，每20天继代一次，继代三次后得到继代愈伤组织； C、将上述继代愈伤组织接种在含有镰刀菌毒素的pH为5.9的下列选择培养基上 MS培养基 Picloram1.5mg/L TDZ 0.02mg/L 水解酪蛋白 450mg/L 酵母提取物 400mg/L 体积浓度为60％的镰刀菌毒素液0.3L/L 在全黑暗、温度为25℃条件下，培养8天； D、将上述步骤C培养存活的愈伤组织转入pH为5.9的下列继代培养基上 MS培养基 KT0.3mg/L BA1.0mg/L IBA 0.3mg/L 在光照时间为11小时/天，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃条件下，培养至诱导分化出百合植株。
再生苗体内防御酶活性测定和抗病性鉴定 对实施例2的元帅‘Acapulco’、卡萨布兰卡‘Casa Blanca’抗病愈伤组织再生苗喷施5×105个/ml浓度的孢子悬浮液，每处理5株，重复3次，每个重复2株。CK为未经筛选的再生百合组培苗，作同样处理。分别在0、12h、24h、36h、48h取样，在美国贝克曼库尔特公司的DU640型紫外分光光度计上测定过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)的活性。7d后观察筛选株的侵染情况。病情分级参照潘其云制定的病情分级标准，并按下面的公式计算病情指数病情指数(％)＝[∑(病级植株数×病级)/(植株数总和×发病最重级)]×100。同时按样本的病情指数划分抗性等级高抗(HR)≤20，中抗(MR)20.1～50，中感(MS)50.1～80，高感(HS)≥80。
本发明经试验研究，其结果报告如下 材料和方法所用材料是选用进口百合品种“卡萨布兰卡‘CasaBlanca’”，“元帅‘Acapulco’”的种球和花苞，经实施例2得到的抗病性百合株系。
结果见表1至表11。
表1不同激素组合对花丝愈伤组织诱导的影响
表2不同激素组合对鳞片愈伤组织诱导的影响
从表1、表2可以看出，花丝、鳞片均可诱导出愈伤组织，诱导花丝愈伤组织较好的培养基是MS+2mg·L-1picloram，3个东方百合品种胚性愈伤的出愈率都在70％以上。Picloram对愈伤组织的诱导作用十分明显，随着浓度的升高形成的愈伤组织越多，但高浓度下形成的胚性愈伤组织较少，愈伤组织较硬，而在2mg/L的浓度下形成的胚性愈伤组织较好。诱导幼叶愈伤组织较好的培养基是MS+2mg·L-1picloram+0.5mg·L-1ABA，3个东方百合品种胚性愈伤的出愈率都在70％以上。ABA对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。
表3不同浓度毒素对百合愈伤组织的影响
从表3可看出，毒素对2个品种的愈伤组织的生长均表现抑制作用。随着毒素浓度的提高，愈伤组织存活率降低，抑制效果愈明显。80％粗毒素浓度下，2个品种的愈伤组织存活率分别为21.67％、26.67％。从愈伤组织表现状态上看，第10d时，80％毒素粗提液处理的愈伤组织松散、褐化死亡，只有极少数存活。因此，80％毒素浓度处理10d可视为大部分细胞生长的一个拐点，在抗性突变体的筛选试验中，可使用含80％毒素的培养基作为选择培养基。
表4愈伤组织经80％毒素抗性选择后的存活数量
从表4可以看出，元帅‘Acapulco’的240块愈伤组织经80％粗毒素筛选后有29块材料存活，存活率为12.08％，其中又有11块分化出了不定芽，分化率为37.93％；卡萨布兰卡‘Casa Blanca’的240块愈伤组织经80％毒素筛选后有47块材料存活，存活率为20.00％，其中有15块分化出了不定芽，分化率为31.25％。卡萨布兰卡‘Casa Blanca’的存活率和分化率都比元帅‘Acapulco’高。以上结果说明，经80％毒素处理过的细胞已经发生突变，并且部分抗镰刀菌毒素的突变基因得到表达，从而能在镰刀菌毒素的临界致死浓度下生存下来。因此，用镰刀菌粗毒素处理百合愈伤组织获得抗镰刀菌突变体是有效的。
表5筛选株对镰刀菌枯萎病抗性鉴定结果表
镰刀菌孢子悬浮液喷雾接种元帅‘Acapulco’和卡萨布兰卡‘Casa Blanca’筛选株后7d，观察其侵染情况，发现与对照株相比，植株正常生长，表现出一定的抗病性。抗性鉴定结果见表5。从表中可以看出，元帅和卡萨布兰卡筛选株均达到中抗水平。
表6不同处理时间对元帅叶片POD的影响
注“＊”表示同列数据间T检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 表7不同处理时间对卡萨布兰卡叶片POD的影响
注“＊”表示同列数据间t检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 表8不同处理时间对元帅叶片PPO的影响
注“＊”表示同列数据间t检验有显著差异(P＜0.05)；“＊＊”表示同列数据间t检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate significant difference between the same column data(P＜0.05)；“＊＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 表9不同处理时间对卡萨布兰卡叶片PPO的影响
注“＊”表示同列数据间t检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 表10不同处理时间对元帅叶片SOD的影响
注“＊”表示同列数据间t检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 表11不同处理时间对卡萨布兰卡叶片SOD的影响
注“＊”表示同列数据间t检验有显著差异(P＜0.05)；“＊＊”表示同列数据间t检验有极显著差异(P＜0.01) Note“＊”indicate significant difference between the same column data(P＜0.05)；“＊＊”indicate very significant difference between the same column data(P＜0.01) 从表6、表7、表8、表9可以看出，经孢子悬浮液处理后，2品种筛选株的POD、PPO的活性变化趋势均呈现先升高后降低的变化趋势。2品种再生百合苗筛选株比其对照株的POD、PPO活性均有所提高，元帅‘Acapulco’筛选株的POD变化趋势十分明显，峰值比对照株的峰值提高了106.54；其PPO活性比对照株也有明显增长。卡萨布兰卡‘Casa Blanca’的POD活性变化幅度不如元帅‘Acapulco’大，但峰值也提高了20.13；其对照株PPO活性变化一直较为平缓，活性值在整个测试过程中变化不大，但筛选株则有显著的升降趋势。T检验表明，在0.01水平下，2品种筛选株和对照株的POD活性存在极显著差异。元帅‘Acapulco’筛选株和对照株的PPO活性在0h和12h有显著差异(P＜0.05)，在24～48h间有极显著差异(P＜0.01)；卡萨布兰卡‘Casa Blanca’筛选株和对照株的PPO活性在0.01水平下，存在极显著差异。
从表10、表11可以看出，经孢子悬浮液处理后元帅‘Acapulco’与卡萨布兰卡‘Casa Blanca’的SOD活性呈现升高的变化趋势，但卡萨布兰卡‘CasaBlanca’对照株的SOD活性在36h后下降。2品种筛选株比其对照株SOD的活性均有提高。SOD活性随着处理时间的延长而增加，说明孢子悬浮液处理后百合植株清除氧自由基的能力增强。T检验表明，元帅‘Acapulco’筛选株和对照株的SOD活性在0.01极显著水平下，存在极显著差异；卡萨布兰卡‘Casa Blanca’筛选株和对照株的SOD活性在24h和36h有显著差异(P＜0.05)，在12h和48h有极显著差异(P＜0.01)；0h时差异不显著。
权利要求
1.一种百合抗病性植株的离体快速培养方法，其特征在于包括下列步骤
A、将消毒灭菌处理过的花丝、鳞片在无菌环境中，接种在pH为5.8～6.0的下列诱导培养基中
MS培养基
2，4-D 1.0-8.0mg/L
Picloram1.0-8.0mg/L
KT 0.1-1.0mg/L
ABA 0.1-1.0mg/L
TDZ 0.01-0.05mg/L
糖 30-40g/L
琼脂6g/L
并在温度为22～28℃，全黑暗条件下诱导培养至形成愈伤组织；
B、将上述愈伤组织置于pH为5.8～6.0的下列继代培养基中
MS培养基
Picloram1.0-2.0mg/L
KT 0.1-0.5mg/L
ABA 0.1-0.5mg/L
TDZ 0.01-0.05mg/L
糖 30-40g/L
琼脂6g/L
在温度为22～28℃、全黑暗条件下进行继代培养，每20天继代一次，继代三次后得到继代愈伤组织；
C、将上述继代愈伤组织接种在含有镰刀菌毒素的pH为5.8～6.0的下列选择培养基上
MS培养基
Picloram1.0-2.0mg/L
TDZ 0.01-0.05mg/L
水解酪蛋白 300-600mg/L
酵母提取物 300-600mg/L
体积浓度为60～80％的镰刀菌毒素液0.3-0.4L/L
在温度为22～28℃，全黑暗条件下培养7-10天；
D、将上述步骤C培养存活的愈伤组织转入下列pH为5.8-6.0的继代培养基上
MS培养基
KT 0.1-0.5mg/L
BA 0.8-1.2mg/L
IBA 0.1-0.5mg/L
在光照强度为1800-2200Lx，光照时间为10-12小时/天，培养温度为22～28℃条件下，培养至分化出百合植株。
2.如权利要求1所述的百合抗病性植株的离体快速培养方法，其特征在于所述步骤A的消毒灭菌处理包括
a、将刚现蕾的百合小花苞依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20-40秒、质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌10-20分钟、体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒5-15分钟，用无菌水漂洗3次，将小花苞剥开后取花丝，备用；
b、将鳞片依次在体积浓度为75％的酒精中消毒20-40秒、在质量浓度为0.15％的氯化汞中灭菌20-30分钟、在体积浓度为2％的次氯酸钠溶液中消毒10-20分钟，用无菌水漂洗3次，备用。
3.如权利要求1所述的百合抗病性植株的离体快速培养方法，其特征在于所述步骤C的镰刀菌毒素液经过下列方法将镰刀菌切块接种于现有技术中的常规马铃薯蔗糖培养液中，于22-25℃，转速100-120r/min条件下，振荡培养至菌丝体长出，且营养液由混浊变为澄清时，过滤菌丝和孢子，滤液于250-300r/min转速下离心分离15-20min后，去沉淀物，上清液煮沸10-15min，冷却后，过滤灭菌，即得到无菌的镰刀菌毒素液，备用。
全文摘要
本发明提供一种百合抗病性植株的离体快速培养方法。它采用百合鳞片、花丝诱导愈伤组织，并多次继代后获得疏松的胚性愈伤组织，利用镰刀菌毒素培养基多次加压筛选后，获得抗病性百合植株，缩短了百合抗病育种的周期，从而为获得大量的抗镰刀菌的百合株系提供技术支持。该方法在有效提供抗病性株系的同时，还将为百合细胞工程育种提供一条快速、有效、稳定的技术路径。
文档编号A01H4/00GK101810142SQ201010152130
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者张艺萍, 吴学尉, 崔光芬, 王祥宁, 汪国鲜, 吴丽芳, 王继华, 贾文杰 申请人:云南省农业科学院花卉研究所