一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种小麦单倍体试管植株染色体加倍的方 法。
【背景技术】
[0002] 小麦单倍体植株诱导和染色体加倍是培育小麦新品种，创建用于小麦遗传分析和 基因定位DH群体的重要技术。小麦单倍体植株可W通过小麦与玉米杂交后染色体排除 化aurie等，1986,1988 ;陈新民等，1996)、花药培养（欧阳俊闻等，1973 ;朱志清等，2003) 和小抱子培养灯ouraev等，1996 ;Zheng等，2002)S种途径获得。其中，花药培养具有强烈 的基因型依赖性，多数小麦品种或Fl杂种的花药培养难W获得愈伤组织和再生植株；虽然 小抱子培养对基因型的依赖性较小，但试验操作复杂，容易污染，周期较长；小麦与玉米杂 交方式诱导单倍体植株几乎不受基因型的限制，操作容易，周期较短，但成胚率较低。在获 得植株的倍性方面，小麦与玉米杂交后通过幼胚捶救获得单倍体植株几乎不能自然加倍， 花药培养方式获得单倍体植株的自然加倍率20-30 % (李志武等，1996)，小抱子培养方式 获得单倍体植株的自然加倍率30-40%狂heng等，2002)。为了确保纯合二倍体植株的获得 并提高单倍体植株的加倍效率，需要利用秋水仙素对幼苗或愈伤组织进行染色体加倍。
[0003] 目前为止，对小麦单倍体植株进行染色体加倍利用最多的方法是苗期分葉节加 倍，即将幼苗从培养基中取出，放入质量分数为0.02-0.1%的秋水仙素水溶液中，在通气 累介导的供氧条件下处理5-10小时，然后取出幼苗，流水冲洗3-4小时，最后移栽在花盆 中。该方法的加倍率一般为50-60%，加倍植株生长发育正常（杨咖萍等，2011 ;赵愛菊等， 2013 ;陈新民等，2013)。利用0. 2%秋水仙素对小麦单倍体植株进行5小时浸根处理，加倍 率也只有37. 5% (杨丽萍等，2011)。但运2种方法操作比较繁琐，步骤较多，且秋水仙素对 环境产生污染，也增加了人体接触秋水仙素的机率。因此，鉴于目前小麦单倍体加倍技术存 在的一些缺点，需要建立一种简便、高效、安全的单倍体植株加倍方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种单倍体植株染色体加倍的方法。 阳〇化]本发明提供的单倍体植株染色体加倍的方法包括如下步骤：将秋水仙素或秋水仙 素水溶液添加在长有单倍体植株的培养基表面，处理，得到加倍的单倍体植株，实现单倍体 植株染色体加倍。
[0006] 上述方法中，所述秋水仙素水溶液的质量分数为0.2-0.6%。
[0007] 上述方法中，所述秋水仙素水溶液的质量分数为0. 4%。
[0008] 上述方法中，所述处理的时间为2地。
[0009] 上述方法中，所述处理的溫度为25°C。
[0010] 上述方法中，所述单倍体植株为小麦单倍体植株；
[0011] 所述小麦单倍体植株具体为小麦品种与玉米品种杂交得到的小麦单倍体植株。
[0012] 上述方法中，所述小麦品种为科农199、新春9号或CB037,所述玉米品种为郑58。
[0013] 上述方法中，所述培养基为1/2MS培养基；
[0014] 所述1/2MS培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质在1/2MS培养基中的浓度为 琴〇3825mg/l、KN〇3 950mg/l、CaCl2.2H2〇 220mg/l、M拆〇4.7&0 185mg/l、KH2P〇4 850mg/ 1、KI0. 42mg/l、H3B〇3 3.lmg/l、MnS〇4? 4&0 11. 2mg/l、aiS〇4 ? 7&0 4. 3mg/l、Na2Mo〇4 ? 2&0 0. 13mg/l、CuS〇4.5H2〇 0.013mg/l、CoClz.6电0 0.013mg/l、FeS〇4.7H2〇 13. 9mg/l、 胞2-邸TA? 2&0 18. 7mg/l、薦糖20g/l、维生素Bilmg/1、谷氨酷胺150mg/l、植物凝胶 (F*h}ftagel) 2. 4g/l。
[0015] 本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。
[0016] 本发明提供了上述方法在提高小麦单倍体植株染色体加倍率中的应用。
[0017] 本发明还提供了上述方法在小麦育种中的应用。
[0018] 本发明分别通过秋水仙素溶液在培养基表面添加、加注根部、涂抹叶片3种加倍 方法对小麦单倍体试管苗进行加倍处理，试验结果表明：移栽前在单倍体试管苗培养基表 面分别添加质量分数为0. 2%、0. 4%、0.6%秋水仙素溶液，小麦单倍体植株加倍率分别为 76. 9%、95. 2%、84.6%，而对照不加倍处理的加倍率为0,表明培养基表面添加秋水仙素溶 液方式对小麦单倍体植株的加倍效果非常明显（表3,图5,图6)，加倍率显著提高，明显高 于目前应用的传统加倍方法。本发明的方法不仅高效、简单、易行、环保，对小麦单倍体植株 的加倍效果具有普遍性，而且减少了秋水仙素的潜在污染，对于利用细胞工程途径改良小 麦和小麦基因工程研究具有重要意义。
【附图说明】
[0019] 图1为小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交后幼胚捶救培养获得的幼苗。
[0020] 图2为小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交获得的小麦单倍体植株染色体构 成。
[0021] 图3为小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交后幼胚捶救培养获得的幼苗。
[0022] 图4为小麦品种新春9号与玉米品种郑58杂交获得的小麦单倍体植株染色体构 成。
[0023] 图5为小麦品种CB037与玉米品种郑58杂交后幼胚捶救培养获得的幼苗。
[0024] 图6为小麦单倍体植株经秋水仙素溶液培养基表面添加获得加倍植株的染色体 构成。
【具体实施方式】
[00巧]下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[00%] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 下述实施例中的玉米新鲜花粉的定义：在玉米开花期间，上午8:OOam抖落玉米雄 穗上的旧花粉，9:OOam收集玉米雄穗上的新鲜花粉。
[0028] 下述实施例中的小麦遗传资源：科农199、新春9号和CB037均可从中国农业科学 院作物科学研究所国家农作物种质资源库获得。
[0029]下述实施例中的玉米遗传资源：郑58可从中国农业科学院作物科学研究所国家 农作物种质资源库获得。
[0030] 下述实施例中的1/2MS培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质在1/2MS培养基 中的浓度为NH4NO3825mg/l、KN〇3 950mg/l、CaCl2.2H2〇 220mg/l、M拆〇4*7&0185mg/l、 KH2PO4850mg/l、KIO. 42mg/l、H3BO33.lmg/1、MnS〇4? 4&0 11. 2mg/l、ZnS〇4? 7&0 4. 3mg/ 1、NazMcA? 2&0 0. 13mg/l、CuS〇4? 5&0 0. 013mg/l、C0CI2?6H2O0. 013mg/l、FeS〇4? 7&0 13. 9mg/l、Naz-EDTA? 2&0 18. 7mg/l、薦糖 20g/l、维生素Bilmg/1、谷氨酷胺 150mg/l、植 物凝胶（Phytagel) 2. 4g^。1/2MS培养基的pH值为6. 0,加热煮沸后分装在玻璃培养管中 (直径3. 5cm，高度12cm)，12rC、高压湿热条件灭菌15分钟。 阳03U 下述实施例中的DA处理液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在DA处理液 中的浓度为2, 4-DlOOmg/L和AGP2g/L。DA处理液的具体配制方法为：先准确称取50mg 2, 4-D，加入200ml无水酒精，用微量移液器充分吸打溶解后加入到500ml蒸馈水中，然后准 确称取IgAGP加入到上述500ml溶液中。
[0032] 下述实施例中的2, 4-D化4-二氯苯氧乙酸）是Sigma公司产品，货号为D7299。
[0033] 下述实施例中的AGP(A;r油inogalactanproteins,阿拉伯半乳聚糖蛋白）是 Sigma公司产品，货号为G9752。
[0034] 下述实施例中的秋水仙素为Sigma公司产品，货号为C9754。
[0035] 下述实施例中的质量分数为0. 2%的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与 100mL的蒸馈水混匀得到的。
[0036] 下述实施例中的质量分数为0. 4%的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与50ml 的蒸馈水混匀得到的。
[0037] 下述实施例中的质量分数为0.6%的秋水仙素溶液是将200mg的秋水仙素与 33. 3ml的蒸馈水混匀得到的。
[0038] 实施例1、秋水仙素对小麦单倍体植株的加倍效果方式的摸索
[0039] 一、秋水仙素根部加注对小麦单倍体植株的加倍效果试验
[0040] W小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交诱导的小麦单倍体幼苗为试验对象，小 麦与玉米杂交幼胚捶救培养和小麦单倍体植株加倍处理步骤如下：
[0041 ]( 一）小麦单倍体植株的获得W42] 1、小麦与玉米杂交
[0043] 将小麦品种科农199种植在中国农业科学院作物科学研究所试验农场（2013年9 月），越冬前覆盖塑料布（2013年12月），返青期掲开塑料布（2014年3月）；将玉米品种 郑58种植在中国农业科学院作物科学研究所溫室（2014年2月，分期播种）；小麦品种科 农199抽穗时及时人工去雄、套袋（2014年4月），共去雄40穗；3天后收集玉米品种郑58 的新鲜花粉授W去雄后的科农199 ;先后于授粉后24小时和48小时用DA处理液喷洒杂交 穗各1次；授粉后16-17天取样杂交穗（40个麦穗）。
[0044] 2、小麦与玉米杂交幼嫩巧粒灭菌和小麦单倍体植株获得
[0045] 从小麦品种科农199与玉米品种郑58杂交后的40个麦穗上收集了 506个幼嫩巧 粒，70 %酒精表面消毒1分钟，15 %次氯酸钢灭菌20分钟，无菌水冲洗5次；在解剖镜下取 出小麦与玉米杂交幼胚，将小麦与玉米杂交幼胚进行捶救培养：胚轴端向上接种至1/2MS 培养基上，每个培养管接种3-4个杂交幼胚，共接种杂交幼胚43个；先在黑暗、25°C条件下 培养3天，然后在光照、25°C条件下培养20天，最终获得了 31株试管单倍体植株（图I)。
[0046] (二）小麦单倍体植株染色体加倍
[0047] 1、小麦单倍体植株染色体检查
[0048] 移栽前取获得的31株小麦单倍体试管苗l-2cm长度的根尖，冰水处理24小时，然 后浸泡在酒精与乙酸溶液（酒精与乙酸的体积比为3:1)中固定24小时后放入95%酒精中 保存。经固定的根尖用IN肥1在60°C下水解14分钟，然后用醋酸洋红进行染色，在显微 镜下观察单倍体植株染色体。检查结果表明，获得的31株试管