利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法

专利名称：利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用SLy CUT系统切割小麦染色体技术体系的建立,属于分子细胞遗传学领域。
背景技术：
染色体微切害I]、微分离与微克隆(chromosome micro-dissection andmicro-cloning)技术是由 Scalenghe 等(Scalenghe F. , E.Turco, J. E. Edstrom, etal. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophilamelanogaster polytene chromosome [J] · Chromosoma，1981，82 :205-216)创立的一项分子细胞遗传学新技术。该技术首先对果蝇染色体进行了切割，成功获得了 80个克隆，随后用于鼠和人类(Rohme Dan, Howard Fox, Bernhard Herrmann, et al. Molecular clone sof the mouse complex derived from microdissected metaphase chromosomes[J].Cell, 1984，36 :783-788.)。随着PCR技术的发展，微切割和微克隆技术得到了较大发展(Ludecke HJ,Gabriele Senger,Use Claussen,et al. Cloning defined regions of humangenome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification[J].Nature, 1989, 338 :348-350)。自 Sandery 等(Sandery M J, et al. Isolation of sequencecommon to A and B chromosomes of rye(Secale cereal L. )by micro cloning[J]. PlantMolecular Biology Reporter, 1991,9 (I) :21-30)利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物染色体文库的构建、特异探针筛选、抗性基因的克隆以及遗传与进化研究上得到了较为广泛应用，但是，相比较而言，植物在这方面开展的研究仍然滞后于动物和人类。目前，植物染色体显微切割技术主要存在以下几个方面的困难(I)植物细胞壁的存在、同步化的困难，阻碍了良好分散染色体标本的制备，而染色体标本的制备是影响染色体切割最基础的技术之一；背景不干净，影响了切割效率。(2)植物基因组倍性多样，染色体结构变异大，基因排列顺序不够保守；植物染色体DNA含量高、蛋白质含量低，绝大多数染色体不能象脊椎动物染色体显示G、R或Q带带纹而不影响DNA序列(Fukui k. ,M. Minezawa, Y. Kamisugi, et al. Microdissection of plantchromosome by argon-ion laser beam[J]. Theor Appl Genet. , 1992,84 :787-791);通行的C带,对染色体DNA破坏太大,不利于构建完整的DNA文库；而有些植物染色体不仅小,而且大小差异不明显，带纹相似，难于精确识别染色体及其细微结构，所有这些都加大了分析的复杂性。(3)植物染色体DNA高度重复序列多，如小麦、大麦、黑麦和燕麦核基因组有约80%的重复序列(Albani Diego, Marie-Jose Cote, Ken C, et al. PCR amplification ofmicrodissected wheat chromosome arms in a “single tube，，reaction[J]· Plant J,1993，4 =899-903)。麦类作物DNA含量高，如六倍体燕麦(2n = 6x = 42) DNA含量为13. 2 14. 3pg,约 I. 3 I. 4X IO1Vo 小麦 C 值为 I. 7X109bp,平均每条染色体 O. 8X109bp,相当于人类基因组的四分之一(Wang ML, Andrew R. Leitch, Trude Schwarzacher, etal.Construction of a chromosome-enriched HpaII library from flow-sorted wheatchromosomes [J]. Nucl Acids Res，1992，20 :1897-1901)。若每个插入片段为 lkb，每条染色体特异性DNA文库包含8X IO5以上克隆，筛库工作量巨大。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用SLy CUT系统切割小麦染色体的方法，以实现对小麦根尖染色体进行显微切割。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种利用SL μ CUT系统切割小麦染色体的方法，以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，在利用SLy CUT系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，成功地对小麦根尖染色体进行了显微切割。具体包括以下步骤 (I)染色体标本制备首先要挑选小麦根尖染色体为制备染色体标本的材料，制备的染色体标本要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时间，以防DNA受损；将目标染色体转移到膜上；(2)目标染色体的识别染色体标本制好之后，对目标染色体进行识别，识别方法可以采用分带、核型分析、原位杂交等方法；(3)染色体(片断)显微切割和分离借助于SLy CELLCUT (Molecular machine industry, MMI)切割系统及系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。还包括以下步骤染色体经过显微切割和分离后进行微克隆库的建立分离到的染色体必须经过体外扩增，才能进行下一步的的研究工作。显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆技术两种。I)酶切直接克隆法首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。本发明采用适于对目标染色体进行酶切。2) PCR介导的微克隆技术目标染色体经显微切割、分离得到的染色体数量有限，往往通过PCR扩增以得到更多的产物以用于后续研究。常用的PCR方法主要有以下两种兼并引物PCR(Degenerate Oligonucleotid Primed-PCR，D0P-PCR，)，D0P-PCR 即用一个简单的简并引物，经两次PCR反应来扩增(第一次复性温度低)。利用DOP-PCR技术扩增显微切割的染色体DNA，无需进行染色体DNA的限制性酶切、设计连接接头等步骤，直接以染色体DNA为模板，具有快速、高效的特点。DOP-PCR扩增产物既有高度重复序列，也有低拷贝序列。本发明采用DOP-PCR对目标染色体进行扩增。
连接体-结合体介导的PCR(Linker-adaptor_PCR，LA-PCR)，LA-PCR即将分离的染色体DNA用限制性内切酶进行消化，根据酶切后产生的粘性末端的碱基序列，分别设计一个连接体(linker)和一个结合体(adaptor),并使linker与adaptor混合后产生与某一内切酶同样的粘性末端。由于粘性末端不受限制，当酶切后的染色体DNA与连接体-结合体混合后，可大大提高连接效率。再用其中的连接体作PCR扩增的引物，由于每个酶切产物都连接一个已知的连接体(引物)，这样就可扩增任一未知DNA片段。在PCR反应前无需分离程序，所构建的染色体区带特异性文库不仅避免了分离等步骤，减少了产生污染的可能，而且由于DNA丢失少而极大提高了文库的完整性。另外，还包括微克隆的筛选和鉴定所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定I) Southern 杂交分析 Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA,与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交。其目的是初步鉴定该文库中插入片段的来源。但是Southern杂交可能存在假阳性，需要进一步验证。2)原位杂交分析用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交。其目的是检测插入片段是否源自目的染色体；鉴别该染色体特有的克隆；鉴别与其他染色体共有的克隆。所用探针可用放射性同位素和非放射性标记物如地高辛、生物素等进行标记。3) PCR扩增方法PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA，也可以是染色体DNA文库中的插入片段。只要该染色体某一基因DNA两侧序列可知，就可利用PCR鉴别该染色体的特异性。本发明利用定位于不同小麦染色体上的SSR标记进行鉴定。本发明采用普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用“原位”移膜法制备适合在SLy CUT 激光切割系统进行小麦染色体切割的染色体标本。本发明的方法具有制片简单、快速、方便，制片快速、染色体分散均匀等优点；在利用该系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，优化了切割系统切割小麦根尖细胞染色体的主要技术参数，并成功地对小麦染色体片段、单条染色体、两条/三条染色体进行了显微切割，这为特定小麦染色体、小麦中异源染色体的微切割、微克隆乃至外源染色体携带优良基因的克隆等后续研究提供了参考。


图I为“原位”移膜法制得的小麦根尖染色体标本；图2为染色体显微切割(示激光参数设置不当)a :表示分离之前；b :分离之后；图3为CXD机相关参数设置；图4为单步收集示意图；图5为单条染色体显微切割；a :切割前b :切割后；图6为2条染色体显微切割；a :切割前b :对一条染色体切割c :对另一条染色体切割；图7为切割后染色体的PCR扩增产物鉴定。
具体实施例方式I、根尖细胞染色体标本的制备(I)催根将小麦烟农15、中国春、小偃麦山农0095、中间偃麦草种子在室温下浸泡至露白，1-4°C冰箱中冰冻24h，然后在25°C条件下培养，根长I. 5-2. Ocm时取根尖；或在温暖的天气傍晚将田间生长的材料浇水，第二天上午9-10时挖取根尖；(2)固定与保存根尖先在冰水中处理24h，再用卡诺氏液于1_4°C条件下固定24h以上后，转入70%酒精保存；

(3)预处理将根尖细胞从保存液中取出，无菌蒸馏水低渗处理IOmin ；(4)初步镜检对根尖细胞分裂相进行初步镜检，挑选大多数处于中期的根尖细胞备用；(4)酶解将挑选过的根尖细胞放于2%纤维素酶+2%果胶酶(Sigma公司)混合酶液于37°C下酶解1-1. 5h，无菌蒸馏水冲洗IOmin ；(5)制片用无菌镊子将根尖细胞捣碎于载玻片(盖玻片亦可)，然后覆膜压片将染色体“原位”转移到分离膜上，再将玻片与膜剥离，70%、100%酒精各脱水3min，最后制成如图I所示的小麦根尖染色体标本。需要注意的是，制片之前为了清洁和增加分离膜的粘性，可以用紫外光照射，也可以用多聚赖氨酸处理以增加粘性；但是不能采用常规冷冻揭片的方法，因为冷冻揭片特别容易撕烂分离膜。2染色体显微切割的有关技术参数设置(I)普通光源照明强度设置120V/100W的普通光源照明强度，能够满足所有倍数下对染色体切割的要求，以下有关参数就是在该强度下进行的设置。(2)紫外激光参数设置在120V/100W普通光源照明强度下，对紫外激光参数进行了调试。如图2所示，当在100X物镜下进行切割，激光速度偏高(设置不当)，切割速度过快，切割不彻底，需要多次进行切割，影响切割效率；加之紫外激光的热效应，容易导致目标染色体变形，严重者可能造成“焦煳”染色体，影响回收效率，也影响进行下游PCR扩增等工作。当各种激光参数设置适当时，切割的切口自然圆滑，激光的热效应对目标染色体影响小(图5-b所示)。一般情况下，在不改变激光聚焦的情况下，适当调高激光的能量(如以5-10 %的比率递增)，或是降低激光的速度(如以5-10 %的比率降低)，均可以提高激光切割效率。经过多次调试和试验，初步确定不同倍数显微镜激光参数设置如下表I不同物镜下的紫外激光参数设置一览表物镜激光速度聚焦激光能量
Object lensLaser rateFocusingLaser energy
4X827970
497279
IOX
597466
20 X515075
40 X104960
IOOx(3) CXD摄像机设定可以通过CellCut 软件的Option菜单更改CCD摄像机设定(如图3)。在软件中，可以调整白平衡、曝光时间和增益等参数。具体操作可以根据实际情况加以自主设置，只要达到清晰即可。(4)激光校正多次使用后，激光的位置可能会略有偏差。当激光不遵循选定的切割路径，或是位置与指针位置有所偏差时，需要调整和确认激光的位置。应该在每一个物镜倍数下进行染色体切割，都需要进行调整。(5)切割样本的选择原则上，使用软件中所列的所有绘图工具均可以完成对样本的切割，但是，在实际操作过程中，建议采用圆形或者矩形等规则工具进行绘图，如果采用用手勾画不规则形状，容易出现如图2所示的情形；另外，要将样本选择的区域与待切割样本保持一定的距离，以免激光在切割过程中由于热效应造成对样本的损伤。(6)单步收集在操作CellCut 显微切割系统时，可以在全部操作过程中将反应管盖放置在组织上，因为管盖中包含扩散体，可以显著地提高成像质量。原则上，在切割之前，管盖需要放置在染色体标本上(如图4)，激光从下面照射上来，切割染色体和膜。在实际切割过程中，经多次试验，低倍物镜下，管盖可以放在膜上，也可以提起来切割；但是在40XU00X物镜下进行切割，则要求必需提起来切割；切割完毕，把管盖放下进行收集，每次切割之后可以单独收集样本,也可以将几次切割的样本收集在同一个反应管中。3染色体显微切割根据调试好的技术参数，依次打开相应激光器、照明电源、CXD机和Cell⑶T软件开关，将制备好的染色体标本置于载物台上，以备切割。(I)小麦根尖细胞单条染色体(片段)的微切割对小麦的根尖细胞单条染色体进行切割。如在40X物镜下，对图5-a箭头所示的单条染色体进行切割，切割之后放下Eppendorf管管盖进行收集，图5_b表明，该条染色体已经被成功切割并进行了收集。(2)小麦根尖细胞两条/多条染色体的微切割
对小麦根尖多条染色体进行切割，用同一个Eppendorf管进行收集。如图6_a所示的两条染色体进行切割，首先对其中一条进行了切割和收集(如图6-b所示)，然后对另外一条再行切割，并用同一个管盖进行收集(如图6-c所示)。这表明，同时切割两条相同的或者不同的多条染色单体，用同一个管盖进行收集，不会影响收集效率，还会大大提高工作效率，也能为下一步的PCR扩增提供更多的摸板或者底物。4切割染色体的DOP-PCR扩增(I)扩增前预处理切割染色体用黏性的Eppendorf管盖进行收集，然后加入20μ lX20ng/y I的蛋白酶K处理液(内含用于DOP-PCR的I XTaq DNA聚合酶缓冲液)于O. 2mlEppendorf 管，1000r/min 离心 3min, 37°C处理 4h, 70°C灭活 20min, -20°C保存备用；(2) DOP-PCR 扩增进行两轮 PCR
第一轮向含有上述酶解液的Eppendorf管中添加4 μ I 10XBuffer、3 μ IMg2+(25mM) ,4 μ I dNTP (2. 5mM)、0· 4 μ I Taq 酶(5U/μ I)、2 μ I 兼并引物(15ng/yl)、ddH20配成体积为50 μ I的反应体系，然后按如下程序进行扩增94°C预扩增IOmin ;然后940C lmin, 30°C I. 5miu,72°C 3min，其中，30°C变化至 72°C需要 3min，共计 5 个循环；接着，940C lmin，57°C I. 5miu,72°C 1.5min，共计 25 个循环，最后 72°C延伸 lOmin，4°C保存备用。第二轮取第一轮的PCR扩增产物5 μ I作为第二次扩增的模板，其他反应条件不变。反应程序94°C预扩增 5min，然后 94°C lmin, 55°C I. 5miu,72°C I. 5min，共计 30 个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。为避免外源DNA的污染，上述整个单染色体体外扩增过程均在无菌条件下进行，并设立严格不含染色体DNA的阴性(无菌水)对照和以IOpg总DNA为模板的阳性对照。(3)扩增产物的检测将第二次扩增产物中加入适量溴酚兰(产物/溴酚兰4V/1V)，6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压IlOV电泳，银染显色，然后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察。具体结果详见图7。有关试剂的配置方法如下(I)蛋白酶K处理液的配置称取O. 3mg蛋白酶K溶入500 μ I ITaq DNA聚合酶缓冲液，配成600ng/ μ I的蛋白酶K溶液，用时稀释至20ng/l·! I。 (2)兼并引物序列5 ’ -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ’，由上海生物工程公司(Sangon)合成。(3)小麦基因组DNA的提取I)取5g叶片置液氮中速冻后研成粉末，装入50ml离心管。2)加入 20ml 已预热到 65°C 的提取液(IOOmM Tris. HCl pH8. 5，IOOmM NaCl, 50mMEDTA pH8. 0,2% SDS) 每管中加入 ΙΟΟμΙ 10mg/ml 蛋白酶 K，混匀。3)置65°C水浴中l_2h，不时轻轻倒转离心管以混匀。4)从水浴中取出离心管，加入20ml酚/氯仿(I I)抽提，轻轻混匀20min。5)3000转/分离心20min，取上清，加入等体积氯仿，轻轻混匀。6)3000转/分离心20min，取上清，加入0. 6体积异丙醇，轻轻混匀，用玻璃钩将DNA缠出，70%酒精冲洗，稍气干，溶于5ml 1XTE。
7)加入 10 μ I 10mg/ml RNA 酶，轻轻混匀，置 37°C lh。8)加入5ml酹/氯仿抽提,3000转/分离心15min,取上清。9)加入等体积氯仿抽提,3000转/分离心15min,取上清。10)加入1/10体积3M醋酸钠，混匀，然后加入2倍体积冷乙醇，混匀。11)用玻璃钩钩出DNA，70%酒精冲洗，置于I. 5ml离心管，气干，溶于1XTE，测DNA浓度经琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量。(4)硝酸银染色步骤I)电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3min。2)用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40S。 3)于银染液中染色5_7min。4)用水快速冲洗(IOS)，不超过20S。5)放入显影液中显影至第一条带出现(一般以泳道出现为准)。6)最后放入停影液中停影。所用试剂的配制6%聚丙烯酰胺凝胶的配方(一块板用量30ml)
去离子水19.5ml
5 XTBE缓冲液6ml
39 I (丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺)4.5ml(39g+lg+100ml水)用之前先过滤。
TEMED16μ1
过硫酸氨(0.1g/ml)160μ1其中，后两者是催化剂，用量可随温度升高酌情减少。固定液40ml乙醇+360ml水+2ml乙酸银染液0·6 克 AgN03+300ml 水即 O. 2% AgN03显影液3% Na0H(12gNa0H+400ml水+2ml甲醛)，甲醛用时现用现加停影液10%乙酸(30ml乙酸+270ml水)其中，固定液和银染液可以重复利用，前者2次，后者可用3次。电泳电压一般掌握在低于120V。
权利要求
1.ー种利用SLy CUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用SLy CUT系统对小麦根尖细胞染色体初歩切割的基础上，对小麦根尖染色体进行了显微切割。
2.根据权利要求I所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于所述的普通小麦为烟农15或中国春。
3.根据权利要求I所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于具体包括以下步骤 (1)染色体标本制备 首先要挑选小麦根尖染色体为制备染色体标本的材料，将目标染色体转移到膜上； (2)目标染色体的识别 染色体标本制好之后，对目标染色体进行识别； (3)染色体(片断)显微切割和分离 借助于 SLy CELLCUT (Molecular machine industry, MMI)切割系统及系统软件直接对目标染色体进行可视化切割，然后运用带有黏性的Eppendorf管的管盖对目标染色体回收，进而进行下游工作。
4.根据权利要求3所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于步骤(2)中的识别方法可以采用分带、核型分析或原位杂交。
5.根据权利要求3所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于在染色体经过显微切割和分离后进行微克隆库的建立。
6.根据权利要求5所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于显微切割染色体微克隆文库的建立主要包括酶切直接克隆和以PCR为介导克隆方法。
7.根据权利要求6所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于酶切直接克隆法为首先将分离出的多个同一目标染色体片段抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。
8.根据权利要求3所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于还包括微克隆的筛选和鉴定步骤。
9.根据权利要求8所述的利用SLyCUT系统切割小麦染色体的方法，其特征在于所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特定片段的PCR扩增进行鉴定 . 1)Southern杂交分析 Southern杂交时可用一定的标记物标记基因组DNA，与建立的染色体DNA文库进行杂交，或标记建立的DNA文库中插入片段，用其作为探针与基因组DNA进行杂交； . 2)原位杂交分析 用得到的染色体DNA文库中插入片段作探针进行原位杂交； . 3)PCR扩增方法 PCR扩增时所用DNA模板可以是微分离的染色体DNA，也可以是染色体DNA文库中的插入片段，利用定位于不同小麦染色体上的SSR标记进行鉴定。
全文摘要
本发明涉及一种利用SLμCUT系统切割小麦染色体的方法，以普通小麦(烟农15与中国春)、小偃麦异代换系山农0095、中间偃麦草根尖细胞为材料，利用SLμCUT系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，对小麦根尖染色体进行了显微切割。本发明的方法具有制片简单、快速、方便，制片快速、染色体分散均匀等优点；在利用该系统对小麦根尖细胞染色体初步切割的基础上，优化了切割系统切割小麦根尖细胞染色体的主要技术参数，并成功地对小麦染色体片段、单条染色体、两条/三条染色体进行了显微切割，这为特定小麦染色体、小麦中异源染色体的微切割、微克隆乃至外源染色体携带优良基因的克隆等后续研究提供了参考。
文档编号C12Q1/68GK102677179SQ20121001835
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者李兴锋, 王洪刚, 王黎明, 袁建国, 袁瑛, 高居荣 申请人:河南科技大学