专利名称：一株平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株平菇及其应用，特别是涉及平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是黄曲霉(A.fIavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)及特曲霉(A.nomius)等真菌产生的次级代谢产物，现已分离出AFB1、AFB2、AFGpAFGyAFMpAFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等18种之多，其中AFBi的毒性最强。大量的流行病学调查及研究均证实，黄曲霉毒素B1的主要靶器官是肝脏，可导致肝脏坏死、肝癌的形成。黄曲霉毒素B1还会影响动物胚胎，造成免疫抑制和反复感染，降低某些动物的产奶和产蛋量。黄曲霉毒素主要存在于玉米、花生等农作物中，严重影响我国花生及其制品的出口，给我国的出口贸易带来了巨大的损失。因此，迫切需要一种高效安全的脱毒方法消除这类毒素对人畜健康的危害。目前，黄曲霉毒素的生物学脱毒方法主要有以下几种:1、微生物菌体本身及其细胞壁提取物吸附去除黄曲霉毒素:例如鼠李糖乳杆菌ATCC53103、鼠李糖乳杆菌DSM-705、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌干酪亚种CGMCC 1.539及某些酿酒酵母等，上述菌株能通过物理方式与黄曲霉毒素结合，形成毒素-菌体复合物，但如何将复合物从食品和饲料中分离去除，成为一个难题。2、微生物代谢产生的酶降解黄曲霉毒素:例如从嗜麦窄食单胞 菌、诺卡氏菌DSM 12676、假密环菌、分枝杆菌DSM 44556T及红串红球菌中提取出的降解酶，此方法降解效率高，降解条件温和，成本低而受到越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一株平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明提供的平燕(Pleurotus ostreatus) LY65,简称平燕LY65,已于2011年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.5428。平菇LY65的发酵液可用于降解黄曲霉毒素B1 (AFB1),具有较高的降解能力，同时由于平菇菌株是可食用菌株，该发酵液对人畜无毒无害。本发明还保护一种制备平菇LY65的发酵液的方法，是液体培养平菇LY65，然后收集发酵液。所述液体培养所采用的培养基的组成具体可为:蔗糖2%、酵母提取物0.3%、(NH4)2S040.45%、K2HPO40.3%、MgSO4.7H20 0.1%,柠檬酸 0.025%, CaCl2.2Η200.005%,微量元素混合液10mL，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量。所述发酵培养基的pH值可为6.3。所述微量元素混合液的制备方法具体可为:取甘氨酸7.Sg、MgSO4.7H2012g、MnSO4.H2O 2.9g、NaCl 17g、FeSO4.7H20 0.359g、CoCl20.775g、CaCl2.2H20 0.9g、ZnSO4.7H20 0.348g、CuSO4.5H20 0.04g、KAl (SO4) 2.12H20 0.021g、H3BO30.16g、NaMoO40.041g,用蒸馏水定容至1L。所述液体培养的条件具体可为:28 V -30 V、180rpm-200rpm(旋转半径具体可为20mm-26mm)振荡培养9天-10天。所述收集发酵液的方法具体如下:完成所述液体培养后离心收集上清液，即为发酵液。所述离心的条件具体可为 IOOOOrpm 离心 5min。以上任一所述方法制备得到的发酵液也属于本发明的保护范围。所述发酵液可用于降解黄曲霉毒素所述降解黄曲霉毒素B1的条件具体可为:30°C、72h。所述降解过程中，可采用200rpm振荡。本发明还保护平菇LY65在制备降解黄曲霉毒素B1的产品中的应用。本发明还保护所述发酵液在制备降解黄曲霉毒素B1的产品中的应用。本发明还保护一种培养平菇LY65的方法，是在28°C _30°C条件下培养5天_6天。所述培养具体可采用固体GMY培养基。所述固体GMY培养基的组成为:葡萄糖1%，麦芽提取物I %，酵母提取物0.4%，琼脂1.5%，其余为水；所述百分含量均为质量百分含量。所述固体GMY培养基为自然pH。实验证明，平菇LY65的发酵液对黄曲霉毒素B1具有很强的降解能力。平菇LY65降解黄曲霉毒素B1的实验表明，790yL发酵液可以将1000.0Ong黄曲霉毒素B1降解掉790.21ng，对黄曲霉毒素B1的降解率达79.02%，黄曲霉毒素B1的浓度从1250.00ng/g降低到了 262.25ng/g。平菇LY65及其发酵液在黄曲霉毒素B1的降解中具有良好的应用前景。
图1为平燕(Pleurotus ostreatus)LY65的平板菌落形态。图2为平燕(Pleurotus ostreatus)LY65的液体培养形态。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ppb代表Ing/mL。PDA固体培养基:去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂1.5%，其余为水；所述均代表质量百分含量。GMY固体培养基:葡萄糖I %、麦芽提取物I %、酵母提取物0.4%、琼脂1.5%，其余为水；所述均代表质量百分含量。MSM 液体培养基(pH 6.3):蔗糖 2 %、酵母提取物 0.3 %、(NH4)2SO40.45K2HPO40.3%, MgSO4.7H20 0.1 %、柠檬酸 0.025%, CaCl2.2H20 0.005 %、微量元素混合液10mL，其余为水；所述均代表质量百分含量。
微量元素混合液的组成为:甘氨酸7.8g、MgSO4.7H20 12g、MnSO4.H2O 2.9g、NaCl 17g、FeSO4.7H20 0.359g、CoCl20.775g、CaCl2.2H20 0.9g、ZnSO4.7H20 0.348g、CuSO4.5H20 0.04g、KAl (SO4)2.12H20 0.021g、H3BO30.16g、NaMoO40.041g，用蒸馏水定容至IL0实施例1、平菇LY65的获得和鉴定一、平菇LY65的获得1、2011年3月，在超净工作台中，取不同的可食用真菌，分别接种于GMY固体培养基平板中，于30°C恒温培养箱中培养5-6d，菌株长满整个平板，取出，放在4°C冰箱中保存备用。2、将活化后的菌株平板用直径7mm的打孔器在平板中央打孔，取4片接种到装有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于30°C、200rpm培养9_10d。然后将发酵液IOOOOrpm离心5min，得到上清液，将上述上清液应用到降解黄曲霉毒素B1试验中，从而筛选出对黄曲霉毒素B1降解能力最好的菌株，将该菌株命名为LY65(从平菇中筛选出来的)。二、平菇LY65的鉴定平菇LY65的平板菌落形态见图1。平菇LY65的菌丝体在琼脂培养基上表现为浓密、洁白的气生菌丝，培养后期在气生菌丝上常出现黄色分泌物，从而出现“黄梢”现象，不形成菌皮。平菇LY65的液体培养形态见图2。平菇LY65的菌丝体在液体培养基上表现一个个圆形的菌丝球，培养后期会在瓶壁上长出白色的气生菌丝体。三、平菇LY65的保藏平燕(Pleurotusostreatus) LY65,简称平燕 LY65,已于 2011 年 11 月 11 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.5428。实施例2、平菇LY65发酵液的制备将平菇LY65在GMY固体培养基平板上培养5天，然后用直径7mm打孔器打孔制备成菌丝圈，取4片菌丝圈接种到IOOmLMSM液体培养基中，在30°C、200rpm(旋转半径26mm)的条件下振荡培养9天，取发酵体系，IOOOOrpm离心5min，得到发酵液。实施例3、平菇LY65发酵液对溶液中黄曲霉毒素B1的降解作用试验黄曲霉毒素B1标准品:sigma公司货号A6636。1、将黄曲霉毒素B1标准品溶于乙腈(色谱纯)，得到浓度为lOOyg/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液。2、移取790 μ L实施例2制备的发酵液(将MSM液体培养基作为发酵液的对照)和10 μ L浓度为100 μ g/mL的黄曲霉毒素BI标准溶液(发酵液和标准溶液的总体积为800 μ L，总质量为Ig ;黄曲霉毒素B1在总体系中的初始浓度为1250ng/g)，加入到1.5mL灭菌离心管中，30°C、200rpm反应72h，取样，用黄曲霉毒素& ELISA试剂盒(北京华安麦科生物技术有限公司HE09004-1，具体操作完全按照说明书进行)检测反应体系中黄曲霉毒素&的浓度。设置三个平行处理，结果取平均值土标准差。采用发酵液的反应体系中，黄曲霉毒素B1的浓度为262.24±22.22ng/g。采用MSM液体培 养基的反应体系中，黄曲霉毒素B1的浓度为1250±54.01ng/g。
实验结果表明，平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的发酵液对黄曲霉毒素B1的降解能力很强，当发酵液的量为790 μ L，黄曲霉毒素B1的含量为IOOOng时，30°C、200rpm降解72h后，该发酵液对黄曲霉毒素B 1的降解率达79.02 ± 4.18 %，可使总体系中的黄曲霉毒素B1浓度从1250±54.01ng/g降低到262.24±22.22ng/g。即1.0OmL平菇发酵液可以将25mL黄曲霉毒素B1浓度超过国家限量标准(20ppb)1.5倍(即浓度为50ppb的黄曲霉毒素B1)降解到lOppb，此为国家限量标准的1/2。
权利要求
1.平菇(Pleurotusostreatus) LY65，它的保藏编号为 CGMCC N0.5428。
2.一种制备权利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的发酵液的方法,是液体培养权利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus)LY65,然后收集发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述液体培养的条件为:28°C-30180rpm-200rpm振荡培养9天-10天。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述收集发酵液的方法如下:完成所述液体培养后离心收集上清液，即为发酵液。
5.权利要求2至4中任一所述方法制备得到的发酵液。
6.权利要求1所述平燕(Pleurotusostreatus)LY65的发酵液在降解黄曲霉毒素B1中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述发酵液为权利要求5所述发酵液。
8.权利要求1所述平燕(Pleurotusostreatus) LY65在制备降解黄曲霉毒素B1的产品中的应用。
9.权利要求6所述发酵液在制备降解黄曲霉毒素B1的产品中的应用。
10.一种培养权利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的方法，是在280C -30°C条件 下培养5天-6天。
全文摘要
本发明公开了一株平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明提供的平菇(Pleurotus ostreatus)LY65，简称平菇LY65，保藏号为CGMCC No.5428。平菇LY65的发酵液可用于降解黄曲霉毒素B1，具有较高的降解能力，同时由于平菇菌株是可食用菌株，该发酵液对人畜无毒无害。平菇LY65及其发酵液在黄曲霉毒素B1的降解中具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/645GK103215191SQ20121001797
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者刘阳, 王会娟, 邢福国 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所