专利名称：一种检测黄曲霉毒素b1的印迹膜传感电极的制作方法
技术领域：
本发明涉及电化传感器技术领域，尤其是涉及到一种用于检测黄曲霉毒素BI的基于丝网印刷技术的印迹膜传感电极的方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的剧毒物质，曾被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为天然存在的一类致癌物。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素BI最为多见，其毒性和致癌性也最强。因此分析测定食品及饲料中黄曲霉毒素的含量水平对保障食品质量安全具有极其重要的意义。目前检测食品及饲料中黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、以酶联免疫为基础的免疫分析、免疫亲和分析如微孔板酶联免疫吸附分析法(ELISA)以及生物传感器法等。TLC法较为简单，费用低廉，但样品的前处理繁琐，提取和净化效果不够理想，灵敏度低、重现差，不适用现代分析的要求。HPLC法精度高、灵敏度高、能同时分析多种黄曲霉毒素类型，但该方法检测周期长、程序复杂，所需试剂繁多、操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场的要求。免疫化学分析法中，酶联免疫吸附法特异性强、灵敏度高、成本低，适于批量检测食品和饲料，但是，酶本身的不稳定性，复杂样品受干扰，检测准确度不高；放射免疫法与酶免疫法类似，但放射免疫法存存放射污染，已被淘汰；亲合层析法近年发展较快的检测方法，但是价格昂贵，难以推广。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极。本发明采用丝网印刷技术制作电化学生物传感电极，实现了微型化和集成化，在食品安全检验、生化分析以及其它领域具有较好的准确性和稳定性，通过它可以很快地检测出食品和饲料中的黄曲霉毒素BI含量，用于现场快速检测，具有很高的经济效益。本发明的技术方案如下
一种检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到
(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；
(2)在所述绝缘电极基片上对应步骤(I)的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；
(3)在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层黄曲霉毒素BI印迹膜；
(4)所述黄曲霉毒素BI印迹膜的制备方法如下
A、称取黄曲霉毒素BI模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，混合均匀后加入交联剂和引发剂，经超声波震荡使其混合均匀，向该溶液中通入氮气除氧，密封待用；
B、将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，在IOOOW紫外光照射下进行聚合反应，合成含有黄曲霉毒素BI的分子印迹膜；
C、将步骤B所得的黄曲霉毒素BI分子印迹膜用体积比为4:1的氯仿-乙酸混合溶液经索氏提取器中反复洗脱黄曲霉毒素BI，直到最后一次洗脱液中检测不到模板分子存在， 于双蒸水中保存备用； 所述黄曲霉毒素BI模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:6:35 ;所述引发剂的摩尔量为所述功能单体摩尔量的0. 2^0. 3% ;所述有机溶剂的体积为所述黄曲霉毒素BI模板分子摩尔量的10倍，其中所述有机溶剂的体积以晕升为单位，所述黄曲霉毒素BI模板分子摩尔量以毫摩尔为单位。所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种，优选甲基丙烯酸。所述有机溶剂为氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的体积比为1:7。所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸、3，5_ 二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种，优选乙二醇二甲基丙烯酸。所述引发剂为偶氮二异丁腈。所述电极基片的材质为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一种，其形状为片材或卷材；所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆的绝缘层的材质为聚氯乙烯。将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面时，滴加的溶液体积为 8 15ul，所形成的分子印迹膜为圆形，其直径为5飞mm，厚度为8(Tl00Um。步骤A中所述超声波震荡时间为5 20分钟；所述通入氮气除氧时间为5 15分钟；步骤B中所述紫外光照射下进行聚合反应时间为5 15分钟。本发明有益的技术效果在于
本发明的目的在于针对黄曲霉毒素BI这种物质，采用电化学传感器技术，联合分子印迹聚合物膜的色谱、光谱学研究结果，建立起一套基于丝网印刷电极的黄曲霉毒素BI印迹传感器分析检测技术。本发明的工作原理是以目标分子为模板，与功能单体接触并通过诱发聚合反应， 围绕模板形成聚合物，其内部分布的大量模板分子的印迹“空穴”在空间结构、结合位点等方面高度匹配模板分子，用分子印迹聚合物膜作为敏感材料，对特异性物质进行检测，待测样品中的黄曲霉毒素BI能够与这种“空穴”特异性的结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大，过膜电流增加。通过将覆盖有黄曲霉毒素BI的印迹膜的丝网印刷电极与电流型传感器相连接，可以快速、灵敏的检测出样品中是否含有黄曲霉毒素BI。本发明通过丝网印刷技术与分子印迹聚合相结合获得黄曲霉毒素BI传感器，适合于现场检测，并能避免繁琐的样品预处理过程，对于不同样品，只需替换附有黄曲霉毒素 BI印迹膜的丝网印刷电极即可，具有成本低、使用寿命长、重现性良好和特异性识别能力强等优点。本发明所用乙二醇二甲基丙烯酸、氯仿和甲苯的混合溶液等亲水性溶剂作交联剂和有机溶剂，所制备的聚合物可直接应用于含水溶剂，降低了分子印迹膜制备过程及使用过程对条件的要求，扩大了材料的应用范围。
图I为本检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极的平面结构示意图，图中1、电极基片；2、接线端子；3、电极连线；4、工作电极；5、对电极；6、绝缘层；7、黄曲霉毒素BI分子印迹膜。图2为本检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极的侧视图，图中1、电极基片；6、绝缘层；7、黄曲霉毒素BI分子印迹膜。
图3为使用本发明进行检测时电信号的处理流程图。
具体实施例方式下面结合附图，对本发明进行具体描述。实施例
如图I和图2所示，取聚氯乙烯绝缘电极基片1，采用溅射石墨法涂覆分离的工作电极4和对电极5,所述工作电极4为圆形,对电极5为环绕工作电极4的半圆环形；采用采用丝网印刷技术，用导电银浆在所述绝缘电极基片I上对应工作电极4和对电极5，分别印制依次连接的工作电极连线3和接线端子2以及对电极连线3和接线端子2 ;在所述工作电极连线3以及对电极连线3表面涂覆一层PVC绝缘层6 ;制作完毕后用50%硝酸浸泡处理，再用蒸馏水冲洗3次。晾干，4°C保存备用；
其中，电极基片I的长度为35 38mm、宽9 10mm、厚O. 4 O. 5mm ；
接线端子2的长度为9 10mm、宽为I"!. 2mm ；
电极连线3的长度为20 25臟、宽为O. 8 Imm ；
两条平行电极连线3之间的间距为2. 8^3mm ；
工作电极4为直径Imm的实心圆形；
对电极5的外直径为4mm、内直径为2mm。在上述制备好的电极基片的工作电极4和对电极5表面涂覆一层黄曲霉毒素BI分子印迹膜7，所述黄曲霉毒素BI分子印迹膜7的制备方法如下
称取O. 312g (lmmol)黄曲霉毒素BI和O. 516g (6mmol)甲基丙烯酸功能单体溶于体积比为1:7 (IOml)的氯仿和甲苯混合溶液中，混合均勻后加入6. 937g (35mmol)交联剂乙二醇二甲基丙烯酸和O. 003g (O. 018mmol)引发剂偶氮二异丁氰，超声波震荡20分钟使其混合均匀，通氮气5分钟，密封。将制好的混合液滴加IOul到丝网印刷电极的工作电极和对电极区域，盖上盖玻片，1000W紫外光距离18cm照射15分钟，重复两次，得到黄曲霉毒素BI的分子印迹膜，其为直径5mm的圆形,厚度为90um。将所制得的承载分子印迹膜的丝网印刷电极用体积比为4:1的氯仿-乙酸混合溶液经索氏提取器提取16h，室温超声后离心收集上清液，直到最后一次洗脱时洗脱液中检测不到模板分子存在为止，于双蒸水中保存备用。本实施例中采用1000W紫外光照射15分钟，重复两次聚合成膜，印迹键合的效果达到最佳。采用丝网印刷电极上原位合成黄曲霉毒素BI印迹膜，可作为电流型传感器的传感元件以快速、灵敏、准确的检测黄曲霉毒素BI残留。图3为使用本实施例中丝网印刷电极上原位合成黄曲霉毒素BI印迹膜进行检测的工作原理图，丝网印刷电极上的分子印迹膜上的特异性空穴选择性的与黄曲霉毒素BI结合，造成分子印迹膜电化学性质变化，导致恒电位激励下的电流变化，电流信号经电流-电压转换器转化为电压信号并放大，再经模数转换器转化为数字信号， 经单片机分析处理后，数据在存储器中保存记录并可随时提取， 同时黄曲霉毒素BI浓度直接从液晶显示电路读出，数据可通过USB接口传输到计算机做长期储存。
权利要求
1.一种检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于由下述制备步骤得到(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；(2)在所述绝缘电极基片上对应步骤(I)的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；(3)在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层黄曲霉毒素BI印迹膜；(4)所述黄曲霉毒素BI印迹膜的制备方法如下 A、称取黄曲霉毒素BI模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，混合均匀后加入交联剂和引发剂，经超声波震荡使其混合均匀，向该溶液中通入氮气除氧，密封待用；B、将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，在IOOOW紫外光照射下进行聚合反应，合成含有黄曲霉毒素BI的分子印迹膜；C、将步骤B所得的黄曲霉毒素BI分子印迹膜用体积比为4:1的氯仿-乙酸混合溶液经索氏提取器中反复洗脱黄曲霉毒素BI，直到最后一次洗脱液中检测不到模板分子存在， 于双蒸水中保存备用；所述黄曲霉毒素BI模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比为1:6:35 ;所述引发剂的摩尔量为所述功能单体摩尔量的0. 2^0. 3% ;所述有机溶剂的体积为所述黄曲霉毒素BI模板分子摩尔量的10倍，其中所述有机溶剂的体积以晕升为单位，所述黄曲霉毒素BI模板分子摩尔量以毫摩尔为单位。
2 根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于所述功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯酰胺中的一种，优选甲基丙烯酸。
3.根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于所述有机溶剂为氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的体积比为1:7。
4.根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸、3，5_ 二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种，优选乙二醇二甲基丙烯酸。
5.根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于所述引发剂为偶氮二异丁腈。
6.根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于所述电极基片的材质为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一种，其形状为片材或卷材；所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆的绝缘层的材质为聚氯乙烯。
7 根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于将步骤A 所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面时，滴加的溶液体积为8 15ul，所形成的分子印迹膜为圆形，其直径为5 6mm,厚度为8(Tl00um。
8.根据权利要求I所述的检测黄曲霉毒素BI的印迹膜传感电极，其特征在于步骤A中所述超声波震荡时间为5 20分钟；所述通入氮气除氧时间为5 15分钟；步骤B中所述紫外光照射下进行聚合反应时间为5 15分钟。
全文摘要
一种检测黄曲霉毒素B1的印迹膜传感电极，制备步骤为(1)取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极；(2)对应工作电极和对电极分别印制工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；(3)在工作电极连线以及对电极连线表面涂一层绝缘层；在工作电极以及对电极的表面涂一层黄曲霉毒素B1印迹膜，其制备方法为取黄曲霉毒素B1模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，混匀后加入交联剂和引发剂，超声波震荡混匀，通入氮气除氧密封；将所得溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，紫外光照射后用氯仿-乙酸混合溶液反复洗脱。本发明实现了微型化和集成化，具有较好的准确性和稳定性，用于现场快速检测具有很高的经济效益。
文档编号G01N27/327GK102621209SQ20121010460
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者周智慧, 王捷, 赵晓联, 邹琳 申请人:无锡市金坤生物工程有限公司