用于检测黄曲霉毒素B₁的生物传感器电极及其制备方法

专利名称：：用于检测黄曲霉毒素B₁的生物传感器电极及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物传感器领域，涉及一种用于检测黄曲霉毒素B,的生物传感器电极及其制备方法。技术背景黄曲霉毒素Bi(AFB。是目前已知的强致癌物之一，它们常污染动物饲料和人类的食品，1988年国际月中瘤研究机构(IntemationalAgencyforResearchonCancer,IARC)将黄曲霉毒素AFBl列为人类致癌物。用污染的饲料喂养禽畜会导致肉、乳及其制品的污染。人们如果食用被污染的食品，会导致急性中毒，引起肝脏坏死出血，慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同时，用被污染的词料饲养禽畜会使禽畜生产率降低，增重减侵，造成重大经济损失。各国对食品及饲料中的黄曲霉毒素均有严格的限量规定。目前，对食品及饲料中黄曲霉毒素BJ勺检测方法大致有TLC(薄层色谱法)、HPLC(高效液相色谱)、免疫化学(酶标仪法)法等几种(黄曲霉毒素B,检测方法的分析，食品与发酵工业2003年10期)，以及酶生物传感器。TLC法较为简单，不需要价格高昂的仪器设备，但样品的前处理繁琐，耗时，准确性差，且使用的大量有毒有机溶剂对实验人员危害大。HPLC法需要高昂的设备费用，技术水平要求高，样品处理仍是繁琐，实验结果的精度易受试剂差异的影响，不适合快速检测；免疫化学(酶标仪法，包括酶联免疫吸附法，放射免疫法，亲合层析法)(1)酶联免疫吸附法，特异性强、灵敏度高、成本低，适于批量检测，食品和饲料，但是，酶本身的不稳定性，复杂样品受干扰,检测准确度不高；(2)放射免疫法，放射免疫法与酶免疫法类似，但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰；(3)亲合层析法，近年发展较快的检测方法，但是价格昂贵，难以推广。已报道的酶生物传感器法，如中国专利ZL200410028018.9(本专利发明人申请的另一专利)，用黄曲霉毒素解毒酶通过共价固定在金电极表面制备传感器检测黄曲霉毒素Bp检测范围在lppm10ppb，检测灵敏度不够高。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测黄曲霉毒素Bi的生物传感器电极，该'电极能在pH^7，2(TC55"C的检测体系中检测AFB,，灵敏度更高，检测范围扩大到1.5ppm0.125ppb，检测速度快且操作简单方便。本发明所述的用于检测霉菌毒素的酶修饰电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体，溶胶凝胶薄膜和黄曲霉毒素解氧化酶，电子介体固定在基底层上，溶胶凝胶将黄曲霉毒素氧化酶包埋于电子介体修饰基底上，形成黄曲霉毒素氧化酶修饰的生物传感器电极。所述的电子介体可选用有机分子电子介体和高分子电子介体。有机分子电子介体主要有二茂铁^其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯；高分子介体主要包括变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合物。高分子介体化合物通常是由低分子介体化合物与高分子链所带的活性基团进行反应固载生成的。本发明优选的电子介体由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，其通过溶胶凝胶形成的网络状三维空间微环境将黄曲霉毒氧化S每包埋固定起来。活化后的多壁碳纳米管起了一个增敏的作用，即增强电极的灵敏性，同时，活化后的多壁碳纳米管具有较大量的羧基，也十分有利于对蛋白质的固定。所述的多壁碳纳米管优选是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管，也可以是其他强酸或强氧化剂活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管。所述的溶胶凝敏Sol-gd滩液的前驱体为TEOS(tetraethylorthosilicate，正硅酸乙酯)，前驱体还可选用低相对分子质量的硅酸甲酯(TMOS)，钛酸丁酯等金属或半金属醇盐前驱体。当选用其他不同的电子介体时，可选用适合该电子介体的不同的联结方法。例如，选用二茂铁衍生物作为电子介体时，先利用双异硫氰酸酯与酶分子进行交替共聚制成酶膜，然后再将带有羧基的二茂铁衍生物通过与酶分子上的氨基反应键合到酶分子上去。本发明的另一个目的在于提供一种用于检测黄曲霉毒素B,的生物传感器电极的制备方法。本发明所述的一种用于检测黄曲霉毒素Bt的生物传感器电极的制备方法，包括以下步骤A、将多壁碳纳米管进行羧基化的活化处理后，加入到含0.05%~0.15%表面活性剂的纯水中混匀，即得羧基化多壁碳纳米管溶液；B、制备黄曲霉毒素氧化酶；c、在酸性环境下,正硅酸乙酯作为前驱体，被催化水解成为的羟基化的产物和相应的醇，即得到A溶液.D、以羧基化多壁碳纳米管溶液对工作电极进行修饰成膜，黄曲霉毒素氧化酶的酶液与上述A溶液混合，用还原剂调混合液pH至7.2，混匀后，滴加于电极表面，溶胶凝胶縮聚陈化成膜后，即得黄曲霉毒素氧化酶修饰的生物传感器电极。所述的步骤C中，还可以在滴加于电极表面的IEOS溶胶凝胶溶液中加入适量的防裂剂，如Triton-100、聚乙二烯等。优选的制备方法包括以下步骤-A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流812小时，离心，弃上清，干燥后为羧基化多壁碳纳米管；称取羧基化多壁碳纳米管溶于含有0.05°/^.15%表面活性剂的纯水中，搅拌均匀后，配成0.01~1.0mg/ml的羧基化多壁碳纳米管溶液；B、黄曲霉毒素氧化酶的制备(l)^w///^7'e//ato^scew真菌培养4周后收集菌体，加入提取缓冲液(每1000ml含pH6.0，PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTT0.1mM，NaCl50mM，其余为二次蒸馏水，pH6.0)，于高速组织捣碎机中捣碎，离心，去除菌体碎片，留取上清，向上清中加入固体硫酸铵,使之形成40%的硫酸铵饱和度，静置，离心，弃沉淀；在上清中，缓慢加入固体硫酸铵，使其形成75%硫酸铵饱和度，静置，离心，弃上清，保存沉淀。将沉淀以1:4(重量体积)溶于pH6.5，0.02MPBS中，混匀后作为下一步色谱分离的上样样品。(2)用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)(苯基琼脂糖,疏水层析介质6FastFlow型号)进行进一部的纯化取上述上样样品，以0.5ml/min的流速上样。以平衡缓冲液(pH5.5，0.02MPBS，含30%饱和度硫酸铵)进行洗脱，然后再依次换用含10%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH6.3，0.02MPBS)，以及含0%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH7.0，0.02MPBS)，分别洗脱，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后得黄曲霉毒素氧化酶。(3)酶活测定按表1所示加好各种试剂后，3(TC水浴反应30分钟，其中灭活对照组的操作是酶液在140。C沸水浴中灭活10分钟后，再加入与反应组相同的反应体系中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述各组均作3个平行管，反应完成后，各管加入lml预冷色谱甲醇，12000rpm/分钟，离心10分钟，取上清在435nm的波长下进行荧光扫描。酶活力单位的定义每分钟使底物AFB!的荧光值(435nm)下降一个单位值所需要的酶量定义为一个酶活单位。C、正硅酸乙酯为前驱体在酸性条件下让其催化水解，并在该水解体系中加入防裂剂，使防裂剂体积分数为2.5°/W7.5%(如Triton-lOO、聚乙二烯等)，混匀，超声均匀。D、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备以铂电极为基底层，打磨至抛光，并依次在丙酮，强碱溶液，强酸溶液以及蒸馏水中超声波清洗，将步骤A所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再将步骤B中制备的酶液与步骤C制备的A溶液，以l:ll(体税体积)的比例混匀，并用低浓度碱性溶液调节混合液的pH值至7.2,然后滴加于电极表面，_4"放置24小时以上，陈化；直至溶胶凝胶薄膜縮聚陈化完全,即得黄曲霉毒素氧化酶修饰的生物传感器电极。更为优选的制备方法包括以下步骤A、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流810小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次；将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管；称取上述lmg羧基化多壁碳纳米管溶于10ml的加入0.05°/".15%表面活性剂的纯水中，搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黄曲霉毒素氧化酶的制备:(1)^7^7/^^//^^^^"真菌培养4周后收集菌体，按w:f12:1的比例加入提取缓冲液(每1000ml含pH6.0的PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTTO.lmM，NaC150mM，余量为二次蒸馏水，该提取缓冲液的最终pH为6.0)，于高速组织捣碎机中捣碎，匀浆液中按照1:2的体积比加入上述提取缓冲液混合，4°C，4000g，离心10分钟，去除菌体碎片，留取上清，在上清中加入固体硫酸铵，使之形成40%的硫酸铵饱和度，置《C中过夜。4°C，10000g，20分钟离心，弃沉淀；在上清中，缓慢加入固体硫酸铵，使其形成75%硫酸铵饱和度，置4。C中过夜。4°C，10000g,20分钟离心，弃上清，保存沉淀。用pH6.0,0.02mol/LPBS将75。/。硫酸铵沉淀物稀释成40%硫酸铵沉淀液，8000g离心10分钟后留取上清液，沉淀加入固体硫酸铵使之成70%硫酸铵饱和度，置4。C中过夜，8000g离心后留取沉淀物，取适量上述沉淀物，以1:4(重量体积)溶于pH6.5，0.02MPBS中，4°C，充分混匀，成为下一步纯化的上样样品。(2)用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)(为瑞典Pharmacia公司产品，苯基琼脂糖疏水层析介质6FastFlow型号)进行进一步纯化用平衡缓冲液(pH5.5，0.02MPBS，含30%饱和度硫酸铵)以2ml/min的流速洗PhenylSepharose6FastFlow(highsub)柱，至洗脱液检测基线稳定。取步骤(1)所得上样样品适量，以0.5ml/min的流速上样。当样品接近完全进入柱床时，以2ml/min的流速用平衡缓冲液(pH5.5，0.02MPBS，含30%饱和度硫酸铵)，进行洗脱，基线回复平稳时，依次换用含10%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH6.3，0.02MPBS)以及含0%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH7.0，0.02MPBS)，分别洗脱至基线回复平稳。收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后得黄曲霉毒素氧化酶。(3)酶活测定按表2所示加好各种试剂后，3(TC水浴反应30分钟，其中灭活对照组的操作是酶液在140。C沸水浴中灭活10分钟后，再加入与反应组相同的反应体系中。表2质控组空白组灭活对照组酶液组6.5pH，0.1mol/LPBS100909090酶液(W)'1010100.01mg/mlAFB,222上述各组均作3个平行管，反应完成后，各管加入lml预冷色谱甲醇，12000rpm/分钟，离心10分钟，取上清在435nm的波长下进行荧光扫描。酶活力单位的定义每分钟使底物AFB,的荧光值(435nm)下降一个单位值所需要的酶量定义为一个酶活单位。C、以正硅酸乙酯为前驱体，使用0.2M的盐酸催化前驱体水解，并在该7拙军体系中加入防裂剂，使防裂剂体积分数为5%,混匀后，超声1小时，室温静置12小时,备用oD、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备将铂电极在由4体积98%H2S04与1体积30%H202组成的溶液中浸泡30min，依次用丙酮、无水乙醇、二次蒸馏水超声波清洗5min，然后用粒径0.05pmAl2O3磨垫抛光。最后用二次蒸馏7K超声波清洗5min。接着将电极浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作电位范围一500mV_+1500mV，用循环伏安法进行扫描直至电极信号稳定为止，将步骤A所得的羧基化多壁碳纳米管溶液适量滴加在电极表面，烘干成膜；再将步骤B中制备的酶液与步骤C制备的A溶液以1:11(体积体积)的比例混匀，用6.5%的氨水调节混合液的pH值至7.2,然后滴加于电极表面，-4t:放置24小时以上；直至溶胶凝胶縮聚陈化成透明薄膜，即得黄曲霉毒素氧化酶修饰的生物传感器电极。所述的步骤C中，每TEOS液中加入5|il的防裂剂Triton-lOO，混匀，超声，静置，然后滴加于电极表面。基于碳纳米管的在酶生物传感器上的潜在应用，本发明以硝化氧化方式活化处理多壁碳纳米管，以MWNT-COOH作为酶反应电子介体，以TEOS为前驱体的溶胶凝胶固态薄膜将黄曲霉毒氧化酶包埋固定起来，从而制备成固相酶生物传感器电极。本发明所述的生物传感器电极，主要是利用所含的黄曲霉毒素氧化酶来检测黄曲霉毒素Bi，其原理是AFBt在黄曲霉毒素氧化酶催化下发生氧化反应，在反应过程中产生可以被检坝啲电信号。因此，本发明所述的生物传感器电极，对于黄曲霉毒素Bi的检测是高特异性的，而且其检测的灵敏度非常高。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.利用本发明的生物传感器电极，仅需要对样品进行简单的预处理，可用于在线检测，响应时间较决，灵敏度高单个样品或批量检测均可以方便地使用；2.本发明生物传感器电极能在pH4~7，2(TC55'C的检测体系中检测AFBp灵敏度更高，检测范围扩大到1.5ppm0.125ppb;3.本发明的生物传感器电极使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，无须培训即可推广应用。图1为黄曲霉毒素氧化酶通过溶胶凝胶法固化在MWNT铂电极上的示意图；图2为不同浓度AFBi的循环伏安图(Scanrate:100mv/s);图3为不同浓度AFBt的微分脉冲图；图4为不同浓度AFB!与峰电流的关系图；其中，A为不同浓度的AFB!溶液，B为空白PBS。具体实施方式实施例1用于检测黄曲霉毒素B,的生物传感器电极本发明所述的用于检测黄曲霉毒素B,的生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体，溶胶;疑胶薄膜和黄曲霉毒素氧化酶，电子介体固定在基底层上，溶胶凝胶将黄曲霉毒素氧化酶包埋于电子介体修饰基底上成膜，形成用于检测黄曲霉毒素Bt的酶修饰电极。本实施例中，所采用的电子介体是由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成，具体是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管，其通过溶胶凝胶法包埋固定黄曲霉毒素氧化酶。实施例2用于检测黄曲霉毒素Bi的生物传感器电极的制备(一)、材料的准备(1)工作电极选用铂电极，购自天津兰力科技公司。(2)多壁碳纳米管(MWNT):购自深圳纳米港。(3)TEOS(tetraethylorthosilicate，正硅酸乙酯)购自Sigma公司。(二)、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管(MWNT)用王水回流810小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀。将沉淀置于烘箱中烘干，即得羧基化多壁碳纳米管。称取上述lmg羧基化的MWNT溶于10ml含0.05°/".15%表面活性剂的纯水中，搅拌均匀后，配成0.1mg/ml的溶液。(三)、黄曲霉毒素氧化酶的制备^7^7/^^/^/^^^"真菌培养4周后收集菌体，取适量菌体按1:2(重量体积)的比例加入提取缓冲液(每1000ml含pH6.0，PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTTO.lmM，NaC150mM，余为二次蒸馏水，pH6.0)，于高速组织捣碎机中捣碎，离心，去除菌体碎片，留取上清，再加入固体硫酸铵,使之形成40%的硫酸铵饱和度，静置，离心，弃沉淀；在上清中，缓慢加入固体硫酸铵，使其形成75%硫酸铵饱和度，静置，离心，弃上清，保存沉淀。将上述沉淀以l:4(重量体积)溶于pH6.5，0.02MPBS中，混匀，成为下一色谱分离的上样样品。用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)进行进一部的纯化。取上述适量上样样品，以0.5ml/min的流速上样。以平衡缓冲液(pH5.5，，0.02MPBS，含30%饱和度硫酸铵)进行洗脱，然后再依次换用含10%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH:6.3，0.02MPBS),以及含0%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液(pH7.0，0.02MPBS)，分别洗脱，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后得黄曲霉毒素氧化酶。(四)、TEOS的溶膨疑胶溶液的制备在2ml洁净的EP管中，依次加入405^1纯水，10pl0.2MHCl，混匀后，加入60jxlTEOS，25(ilTriton-100。振荡均匀，室温静置23小时，备用。(五)、多壁碳纳米管修饰酶电极的制备以铂电极为基底层，将铂电极在Piranha(由4体积98%H2S04与1体积30%H202组成)溶液中浸泡30min，依次用丙酮、无水乙醇、二次蒸馏水超声波清洗5min，然后用粒径0.05pmAl2O3磨垫抛光，最后二次蒸馏水超声波清洗5min，干燥钼表面。接着将电极浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作电位范围一500mV—+1500mV，用循环伏安法进行扫描直至电极信息稳定为止，将步骤(二)所得的0.1mg/mL的MWNT溶液滴加lOpl在电极表面，4080。C烘干成膜；将5^1上述步骤(三)所得的酶液与55pl上述步骤(四)所得溶胶凝胶溶液混匀后，用6.5%的氨水调pH值至7.2后，取该混合液1(^1滴加于上述MWNT(多壁碳纳米管)修饰的电极表面。放入4。C冰箱内保存,放置24h以上，直至溶胶凝胶縮聚陈化成透明薄膜，即得用于检测黄曲霉毒素B1的生物传感器电极，如图1所示。本实施例中，选用黄曲霉毒素B1作为底物。本实施例为优选方案，在TEOS的溶胶凝胶溶液中加入5%的Triton-lOO做为防裂剂，此步骤中即使不加入防裂剂也可制备出有功能的酶修饰电极。实施例3用于检测黄曲霉毒素B1的生物传感器电极的实验分析将本发明所述的黄曲霉毒素氧化酶修饰的铂电极作为工作电极，与通用的对电极和任选的参比电极一起组成一个电极系统。本实施例中，选用Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝电极为对电极组成三电极系统，磷酸盐缓冲液为电解液。(一)样品的处理固态样品腦g样品以粉碎机粉碎，用甲醇:水45:55的体积比充分溶解震荡，以等体积的氯仿提取3次，通过含有无水硫酸钠的漏斗，65'C下吹氮气挥干。液态样品100ml样品以0.5:1(体积:体积)的氯仿提取3次，通过含有无水硫酸钠的漏斗，65'C下吹氮气挥干。(二)MWNT修饰黄曲霉毒素氧化酶电极对黄曲霉毒素B,的电化学响应电位范围一400mV+1250mV，在10ml的含0.1MNa2S04的0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)中，用BAS-IOOElectrochemicalanalyzer进行循环伏安(CV)研究和示差脉冲伏安(DPV)研究，计时电流法，扫描速率100mV/s。分别检测MWNT修饰溶胶凝胶法固化ADTZ修饰电极对黄曲霉毒素B,的响应情况。一、循环伏安法检测采用BAS—100电化学分析仪三电极系统(参比电极Ag/AgCl电极，对电极:Pt丝电极，工作电极修饰AU电极)，选择循环伏安扫描模式，设置电化学参数如下工作电位范围一400mv+1250mv扫描速率100mv/s;灵敏度lO^lA/V;静息时间2s设置好参数后，分别用不同的修饰工作电极对10ml0.2M，pH6.60PBS(含lg/1kcl)的底液以及相同底液体系中加入不同浓度的AFB!的乙醇溶液或上述样品进行循环伏安扫描检测。测试效果以100mv/s的扫描速率，在一400mv+1250mv工作电位范围内用循环伏安法对不同浓度的AFB,溶液进行测定，如图2和图3所示，峰电流随AFB,浓度的增加而增加。二、微分脉冲伏安纟去检测选择微分脉冲伏安扫描模式，设置电化学参数如下脉冲振幅50mv;采集数据电位区间一400mv4l250mv;采样宽度20ms;扫描速度100mV/S;静息时间10s测试效果:以溶胶凝胶法固定化黄曲霉毒素氧化酶修饰电极对不同浓度的AFB,溶液进行微分脉冲伏安扫描，所测结果如图3所示，表明该电极对AFBi敏感，不同的浓度下产生不同大小的脉冲信号(信号大小与浓度有正比例关系)。即黄曲霉毒素B!的含量可以通过脉冲信号表示出来。如图3所示，以溶胶凝胶法固定化的黄曲霉毒素氧化酶修饰电极在+30mv位置用微分脉冲伏安法对AFB!进行定量分析，得到在5.00xlO—55.00xlO"VL浓度范围内，峰电流随着AFBi浓度的增加而上升，AFBi的线性检测范围为5.00x10-55.00x1(TVl，线性方程为Ip=7.609+6.613c，R2=0.96941，P<0.05。图4表明本发明的生物传感器电极对AF响应灵敏，产生的峰电流大小与AFB1的含量成正比例关系，即可以通过峰电流表示样品中黄曲霉毒素的含量。如图4所示，在AFB!浓度范围5ug/L25ug/L,电极检观啲信号(电流强度)变化更为灵敏。电极的分析特性，对AFBi的检测线性范围有两个幾性范围1:5pg/L25jiig/L,其线性回归方程为Ip=24.03879+7.14296*C，相关系数R2=0.9792PO.0001。线线性范围2:30ng/L70pg/L,其线性回归方程为Ip=185.35+1.44143*C,相关系数R2=0.9865PO.0001。权利要求1、一种用于检测黄曲霉毒素B1的生物传感器电极，包括基底层及在基底层上形成的反应层，其特征在于所述的反应层由电子介体、溶胶凝胶和黄曲霉毒素氧化酶组成，电子介体固定在基底层上，溶胶凝胶将黄曲霉毒素氧化酶包埋于电子介体修饰的基底层上成膜。2.根据权利要求1所述的生物传感器电极，其特征在于所述的电子介体由在酸氧化环境下活化的多壁碳纳米管构成；所述的溶胶凝胶的前驱体为正硅酸乙酯，在溶胶凝胶中正硅酸乙酯的质量百分比为10%15%。3.根据权利要求2所述的生物传感器电极，其特征在于所述的多壁碳纳米管是以硝化氧化方式活化处理所得的羧基化多壁碳纳米管。4.权利要求1^3之一所述生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下(1)、将多壁碳纳米管进行羧基化的活化处理后，加入到含有0.05°/^0.15%质量表面活性剂的纯水中混匀，即得羧基化多壁碳纳米管溶液；(2)、制备黄曲霉毒素氧化酶；(3)、在酸性环境下,正硅酸乙酯作为前驱体,被催化水解成为的羟基化的产物和相应的醇，即得到A溶液；(4)、以羧基化多壁碳纳米管溶液对工作电极进行修饰成膜，黄曲霉毒素氧化酶的酶液与上述A溶液混合，用还原剂调混合液pH至7.2，混匀后，滴加于电极表面，溶胶凝胶縮聚陈化成膜后，得用于检测黄曲霉毒素Bi的生物传感器电极。5.权利要求1^3之一所述生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流812小时，离心，弃上清，干燥后为羧基化多壁碳纳米管；将羧基化多壁碳纳米管溶于含有0.05°/』.15%质量表面活性剂的纯水中，超声波搅拌均匀后，配成0.011.0mg/ml的羧基化多壁碳纳米管溶液；(2)、黄曲霉毒素氧化酶的制备收集Armillariellatabescen真菌菌体，加入提取缓冲液，破碎，离心，取上清，用硫酸铵沉淀法获取沉淀物，以PBS混匀后上样于PhenylSepharose6FastFlow，进一步纯化，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后即得黄曲霉毒素氧化酶；(3)、以正硅酸乙酯为前驱体,在酸性条件下让其催化水解，并在该水解体系中加入防裂剂，使防裂剂体积分数为2.5%7.5%，混匀，即得到A溶液；(4)、电极的制备以铂电极为基底层，打磨至抛光，并依次在丙酮，强碱溶液，强酸溶液以及蒸馏水中超声波清洗，将步骤(1)所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再将步骤(2)制备的酶液与步骤(3)制备的A溶液，以l:ll体积比混匀，并用碱性溶液调节混合液的pH值至7.2，然后滴加于电极表面，-4"放置24小时以上，陈化；直至溶胶凝胶薄膜縮聚陈化完全，得用于检测黄曲霉毒素Bt的生物传感器电极。6、根据权利要求5所述的生物传感器电极的制备方法，其特征在于，所述的防裂剂为Triton-100或聚乙二烯。7、权利要求1^3之一所述生物传感器电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、羧基化多壁碳纳米管溶液的制备将多壁碳纳米管用王水回流812小时，10000g离心15分钟，弃上清，用双蒸水清洗沉淀，10000g离心15分钟，洗涤沉淀，重复此步骤两次；将沉淀置于烘箱中烘干，为羧基化多壁碳纳米管；称取上述lmg羧基化多壁碳纳米管溶于10ml的加入表面活性齐啲双蒸水中，混匀，配成0.1mg/ml的溶液；(2)、黄曲霉毒素氧化酶的制备收集^7^7/0^//"^&^^2培养4周后的真菌菌体，按重量、体积比为12:1的比例加入提取缓冲液中，于高速组织捣碎机中捣碎，匀浆液中按照1:2的体积比，加入上述提取缓冲液混合，4°C，4000g，离心10分钟，取上清，依次用硫酸铵浓度为40%和75%的硫酸铵沉淀法获取沉淀物，将所得沉淀以l:4体积比溶于pH6.5，0.02MPBS中，4°C，充分混匀后上样于PhenylSepharose6FastFlow，进行纯化，依次用含10%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液和含0%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液分别洗脱，收集色谱过程中的酶活性峰组分，浓縮后即得黄曲霉毒素氧化酶；(3)、以正硅酸乙酯为前驱体,使用0.2M的盐酸催化前驱体水解，并在该水解体系中加入防裂剂，使防裂剂体积分数为5%，混匀后，室温静置12小时，备用；(4)、电极的制备将铂电极在由4体积98%H2S04与1体积30%11202组成的溶液中浸泡30min，依次用丙酮、无水乙醇、二次蒸馏水超声波清洗5min，然后用粒径0.05pmAl2O3磨垫抛光，最后用二次蒸馏水超声波清洗5min，接着将电极浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作电位范围一500mV—+1500mV，用循环伏安法进行扫描直至电极信号稳定为止，将步骤(1)所得的羧基化多壁碳纳米管溶液滴加在电极表面，烘干成膜；再将步骤(2)制备的酶液与步骤(3)制备的A溶液以1:11体积比混匀，用6.5n/。质量氮水调节混合液的pH值至7.2，然后滴加于电极表面，-4。C放置24小时以上；直至溶胶凝胶縮聚陈化成透明薄膜，得用于检测黄曲霉毒素Bi的生物传感器电极。8、根据权利要求7所述的生物传感器电极的制备方法，其特征在于，步骤(l)中所述的提取缓冲液为每1000ml溶液中含有0.05MpH6.0的PBS，0.5mM的EDTA，O.lmM的DTT，50mM的NaCl，余量为二次蒸水，且该提取缓冲液的pH为6.0。9、根据权禾腰求7所述的生物传繊电极的审恪方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的含10%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液为0.02M的PBS,其pH为6.3;所述的含0%饱和度硫酸铵洗脱缓冲液为0.02M的PBS，其pH为。10、权利要求1-3中任意一项的生物传感器电极在制备检测黄曲霉毒素B,的生物传感器中的应用。全文摘要本发明公开一种用于检测黄曲霉毒素B₁的生物传感器电极及其制备方法，所述生物传感器电极，包括基底层与在基底层上形成的反应层，所述的反应层包含电子介体、溶胶凝胶薄膜和黄曲霉毒素氧化酶，电子介体固定在基底层上，溶胶凝胶将黄曲霉毒素氧化酶包埋于电子介体修饰的基底上成膜，即得黄曲霉毒素氧化酶修饰电极。本发明的生物传感器电极响应快、信号灵敏度可达到1.5ppm～0.125ppb、特异性高、使用方便、可定量检测，使用寿命长，稳定性好。文档编号G01N27/327GK101216450SQ20081002582公开日2008年7月9日申请日期2008年1月16日优先权日2008年1月16日发明者刘大岭,姚冬生,李世川,谢春芳申请人:暨南大学