结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法

专利名称：结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物类，具体地是涉及结核分枝杆菌检测液相芯片及其制备方法。

背景技术：
由结核分枝杆菌(TB)引起的结核病是现今世界上最普遍的人类传染病之一。全世界已有1/3人口约20亿人感染了结核分枝杆菌(MTB)。每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病。我国现有结核病人约600多万，每年还至少有113万新生结核病例发生，每年因结核病死亡人数高达25万，且75％的结核病例发生在15-50岁的青壮年当中，严重影响了我国国民经济和人口素质发展。准确及时诊断活动性肺结核，有效控制传染源，对我国的结核预防控制至关重要。早期诊断MTB感染的方法越来越显得重要。
结核病控制存在的最主要问题是结核病人或感染动物的发现率低。现有的结核病实验室诊断主要依靠细菌学检测、免疫学检测、质谱分析、PCR诊断、DNA指纹技术和基因芯片检测技术。对结核病人痰的细菌学检测是结核病诊断、治疗及评价治疗效果最可靠的标准。常规的细菌学检测方法有痰涂片法、培养法、药敏试验及根据其理化特性而建立的菌型鉴定法。涂片法是最基本的检测方法，具有简便、快速的特点，但敏感性差，平均检出率只有25％～35％，无法区分死菌、活菌。培养法周期太长，约4～8周，同时必须结合药敏试验和菌种鉴定试验才能进一步确诊，这样所需周期更长，不利于临床上结核病的诊断和治疗，加之试验过程中的影响因素很多，不易标准化，不能满足临床需要。Bactec快速培养仪检测系统虽然可缩短培养时间，但也需2-4周，而且需要特殊的仪器设备，费用昂贵，无法在基层推广应用；噬菌体检测技术虽然快速、简便，但特异性差，只能用于结核病人初筛；PCR分子生物学诊断技术快速、灵敏，是很有前途的诊断方法，但其相对成本较高，而且假阳性率较高，不能区分死菌与活菌；血清特异性抗体检测方法简便、实用，但目前所用抗原多为PPD、LAM、38kD、16kD等，这些抗原多数是分枝杆菌属所共有的，因此特异性不强。
抗原检测一直是确认或评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，在其它许多疾病如HBV、HCV、HIV、SYPHILIS诊断方面获得广泛应用。特异性抗原检测最重要的特征在于通过检测相关病原体的特异性抗原(标志物)实现。使用这一方法检测结核杆菌，必须寻找到结核杆菌特异性抗原(标志物)。
为了寻找结核杆菌特异性抗原(标志物)，过去，研究人员多从结核杆菌菌体蛋白中寻找，结果多数菌体抗原并非结核杆菌特有，而是分枝杆菌属菌共有。后来研究结核杆菌的生长，从结核杆菌培养滤液中发现了大量分泌抗原，其中一些抗原是菌体中所没有的，且为毒株结核杆菌所特有。理论上讲，由于分泌性抗原是由活的结核杆菌产生并释放到周围环境介质中，因此，检测上述多种结核杆菌的分泌性抗原能显著提高结核病诊断的阳性率，也可以通过检测分泌性抗原的存在与含量确定结核杆菌尤其是活菌存在及其生长情况。
人和动物结核杆菌在感染过程中，不同的生长环境、生长阶段，不同的感染方式，结核杆菌能启动表达不同的蛋白表达系统。研究发现，结核杆菌早期感染阶段会分泌一些小分子量抗原如ESAT-6、CFP-10等，生长阶段会释放或分泌Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT53、MPT63、MPT64、MPT70、Mtb81、Mtb48、38kD等蛋白。因此，仅依靠检测一两种结核杆菌分泌抗原很难达到诊断目的。
人型(标准菌株H37Rv)是人类结核病的主要病原菌，牛型结核杆菌(M.Bovis)可经饮用未消毒的带菌牛乳引起肠道结核感染。现在为防止结核病，普遍接种的卡介苗就是减毒的牛型分枝杆菌，因此与病原菌的抗原有着很高的同源性，这一问题就成了结核杆菌需要考虑的另一关键问题。自1998年标准菌株H37Rv基因组序列公布以来，大部分编码蛋白质的功能基因得以阐明，特别是运用双向电泳和质谱技术在蛋白组水平上分离和鉴定出了一些可区别人型和牛型以及BCG，极具辅助诊断潜力的特异性蛋白质抗原，为结核病特异性诊断奠定了基础。这些主要包括糖脂类抗原、Ag85复合物、16kDa蛋白、38kDa蛋白等。特别值得注意的是，自从1996年，Matsumoto等采用递减杂交法阐明BCG在体外处理中被删除的3个差异区域(RD区)以来，人们已经在各种BCG菌株中发现了有16个这样的区域。这些区域中所包含的一些抗原，如ESAT6、CFP10以及MPT64等，就极有可能排除BCG对结核皮肤实验以及ELISA的干扰。
结核分枝杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表达的数量、种类或时机可能随病人的个体免疫背景和病程而异，表现出不同的抗原抗体谱。检测时有的抗原不表达，未检测出相应的抗体；有的抗体含量高，有的则低。目前临床上对于结核分枝杆菌抗原的检测项目的开展的还基本处于空白期，因此，多种抗原联合检测，在保证特异性的基础上有助于提高灵敏度，并可用于结核分枝杆菌的自然感染或卡介苗接种后阳转者的区别。
本发明根据大量的文献资料确定了ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL这八种结核分枝杆菌特异性分泌抗原用于结核杆菌感染的检测。
(1)ESAT-6早期分泌性抗原靶6，ESAT-6是结核杆菌感染早期的分泌型蛋白。主要存在于致病性结核杆菌而不存在于非结核分枝杆菌。这个证据极大地推动了把ESAT-6作为诊断试剂的研究。所以，ESAT-6是区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的最佳候选抗原。有关的研究证明ESAT-6可用于鉴别卡介苗接种(BCG)和结核杆菌感染。
(2)CFP-10该抗原和ESAT-6-样都是从培养滤液中发现的，同样仅分布于各型结核杆菌中。这种分子和ESAT-6一样经常出现在结核病人中，但在BCG中没有该类分子，同样也不出现在接种BCG的健康人中。
(3)38kD蛋白38kD蛋白是1986年Young.D等人首次用单克隆抗体为基础经亲和层析纯化而成。Andersen等从结核杆菌中分离了该蛋白的基因，认为38kD蛋白只能在致病的分枝杆菌中检出，BCG中只能检出非常少的量，而其他分枝杆菌不能检出。Haslov等比较了5种结核杆菌抗原，发现38kDa蛋白的免疫学活性最强，是结核杆菌的主要免疫原。缺乏抗38KD抗体的血清很难与结核杆菌其它抗原发生反应。38kDa蛋白是一种脂蛋白和主要免疫原，其诱发豚鼠迟发性超敏反应(DTH)的效果优于其它单一抗原，用于结核病血清学检测敏感性和特异性较高。Espitia C等研究了38kD蛋白用于血清诊断的方法，发现该蛋白可与57％的病人血清反应，与对照组没有反应。张小刚等采用自制的重组结核分枝杆菌38kD蛋白作为ELISA抗原，其敏感性、特异性分别为67.2％和96.8％，与Espitia C等报告的灵敏度68％与特异性96％的结果相似。
(4)16kD蛋白16kDa蛋白也被称为MPT63或者TBP16。核酸杂交技术、免疫印记技术和抗体阻断技术表明，16kDa蛋白质存在于结核菌复合群中，在其他分枝杆菌不存在该抗原的基因，因而也不表达该抗原。16kD用于诊断的灵敏度为63％，特异性为93.1％。
(5)脂阿拉伯甘露糖(LAM)LAM是分枝杆菌所特有的细胞壁成分，具有特异性。研究表明LAM具有较强的免疫原性，可刺激机体产生相应的抗体。用于结核病的血清学诊断，其敏感性在50％～75％，特异性在50％～75％。有关LAM抗原的应用报道很多，Antunes等用美国生产的结明试剂盒(MycoDot TM)检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0％，特异性为92.4％，认为检测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。
(6)Ag85B抗原85复合体(Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约为30～32kDa。分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。结核分枝杆菌Ag85中至少包括三种蛋白成分——Ag85A、Ag85B和Ag85C，其中有免疫作用的主要为Ag85A和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。它还能和人纤连蛋白(FN)相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。Ag85可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的Ag85抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍，可通过检测血循环中Ag85抗体，对活动性结核加以诊断。Kashyap等用间接ELISA法检测89％疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在Ag85抗体，认为检测Ag85抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。Ag85B分子量为30kD，是结核杆菌的主要分泌蛋白，约占分泌蛋白总量的22％-30％。在对结核病的诊断上，Ag85B较Ag85A和Ag85C更有价值。
(7)MPT64又称MPB64，是一种24kD的结核分枝杆菌分泌蛋白，仅存在与结核分枝杆菌复合群中。Harboe等首先在牛型和人型结核杆菌的培养滤液中，检测到MPT64，但在BCG中没有此抗原。随后用PCR杂交研究表明，编码MPT64的基因在某些BCG亚株中缺失。
(8)结核菌糖脂抗原(TBGL)结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。近年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。Maekura等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为56.8％，对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为51.2％。将TBGL与核酸扩增方法(NAA)联合用于检测，检出率比两者单独使用时进一步提高。Tiwari等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的TBGL抗原特异的与结核病患者血清中的TBGL抗体结合，形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达94％和98.3％。该方法快速(4min)、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗(BCG)免疫接种者与健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。
传统的抗原检测方法主要有放射免疫法，酶联免疫法及电化学发光免疫法等。然而这些方法每次测试只能获得一种抗原的浓度。同时，传统的免疫检测方法受灵敏度限制，因此对于一些低浓度的分泌抗原存在检测结果不准确等缺陷。


发明内容
针对目前结核杆菌的检测及抗结核疗效评估的方法的敏感性和特异性不高以及一次反应只能检测一种抗原的缺陷，本发明需要解决的技术问题是提供一种结核分枝杆菌检测液相芯片，该液相芯片对血清中ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL八种结核分枝杆菌特异性分泌抗原同步并行检测。
解决上述技术问题的技术方案如下 一种结核分枝杆菌检测液相芯片，主要包括有 1)包被微球含有分别包被了ESAT-6捕获抗体的微球、包被了CFP-10捕获抗体的微球、包被了38kD蛋白捕获抗体的微球、16kD蛋白捕获抗体的微球，包被了LAM捕获抗体的微球、包被了Ag85B捕获抗体的微球，包被了MPT-64捕获抗体的微球、和包被TBGL捕获抗体的微球中三种或三种以上，上述微球分别具有不同颜色编码； 2)生物素标记检测抗体分别用生物素标记的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的检测抗体中的对应于包被微球的三种或三种以上； 3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE)。
液相芯片技术也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，微球用聚苯乙烯材料制成，直径5.6um，表面有活性羧基可供化学偶连用，抗原、抗体等生物大分子可通过氨基与微球表面的羧基通过化学反应共价结合(即包被过程)。在微球制造过程中加入红外和远红外两种荧光染料，根据两种染料混合比例的不同将微球进行编码，可区分出上百种不同编码的微球。使用时，先将ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的捕获抗体分别包被于不同颜色编码的微球上，同时分别用生物素标记ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的检测抗体。将包被好的八种微球混合，悬浮于液相，再加入标本，在悬液中微球上标记的捕获抗体与标本中相应的检测物的某一个表位异性地结合，之后加入生物素标记的检测抗体与标本中相应检测物的另一表位特异性结合，反应完全后加入荧光物质-藻红蛋白标记的链亲和素，由于链亲和素藻红蛋白(SA-PE)可以与生物素高度特异性结合，因此反应体系中最后形成“微球-捕获抗体+待检测物+生物素标记的检测抗体+SA-PE”的六种复合物，以微球为载体，通过Luminex系列液相芯片分析仪器检测，读取微球的色彩编号及SA-PE的荧光值。微球色彩编号可辨别检测项目，SA-PE荧光值与各检测物浓度呈正相关，通过测定ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL标准品在不同浓度下的荧光值，可以获得各个检测指标标准品浓度-荧光值标准曲线以及标准曲线方程。将待测血清样本检测所得荧光值代入标准曲线方程即可分别求得待测样本中的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的量。
由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。
本发明另一需要解决的技术问题是提供上述结核分枝杆菌检测液相芯片的制备方法。一种制备结核分枝杆菌检测液相芯片的方法，主要包括以下步骤 (1)相应的捕获抗体包被微球 -将50μL微球活化后，≥8000g，离心； -吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于≥8000g，离心1-2min；重复该步骤； -吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s； -往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL； -用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr； -偶联了抗体后的微球以≥8000g的速度，离心1-2min； -吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s； -室温避光振荡30min；再于≥8000g，离心1-2min； -吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；微球≥8000g，离心1-2min；重复该步骤一次； -吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中； -每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为40个/μl； (2)每种检测抗体的生物素标记 -依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积； -配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液； -按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液； -加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHCO3溶液； -加入pH7.4的PBS补至目标体积； -包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm； -将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin； -使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。
所述活化微球的步骤如下 -用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球； -取50μL微球离心1-2min； -去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，≥8000g离心1-2min； -吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s； -加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀； -加入10μL50 mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀； -室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。
本发明方法结合液相芯片平台高通量、准确灵敏的特性与双抗体夹心法高灵敏度的特性，同步检测8种结核杆菌特异性分泌抗原，能提高结核病感染阳性检出的敏感性，为结核杆菌感染实验室诊断及抗结核疗效评估提供有利依据。
本发明所公开的多项结核分枝杆菌抗原并行检测液相芯片则可一次反应同时完成多种结核分枝杆菌特异性抗原的定量检测，填补目前临床定量检测结核分枝杆菌特异性抗原开展不足的缺陷，从而为对早期结核病的准确诊断提供一种准确可靠的手段。本发明所提供的多项结核分枝杆菌抗原并行检测液相芯片还具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。
另外，本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量试验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。



图1是检测ESAT-6的标准曲线示意图； 图2是检测CFP-10的标准曲线示意图； 图3是检测38kD蛋白的标准曲线示意图； 图4是检测16kD蛋白的标准曲线示意图； 图5是检测LAM的标准曲线示意图； 图6是检测Ag85B的标准曲线示意图； 图7是检测MPT-64的标准曲线示意图； 图8是检测TBGL的标准曲线示意图。

具体实施例方式 实施例1结核分枝杆菌快速检测液相芯片的制备及抗原的检测 本发明所述的捕获抗体为分别能对应与ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL特异性结合的单克隆抗体；所述的检测抗体为分别能与ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。本实施例所用的“ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL″重组蛋白购自英国SCiPAC公司，“ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL″的捕获抗体与检测抗体购自美国abcam公司。
本实施例中，所述各种溶液的配方如下 1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml) 2.PBS配方 3.PBS-TBN配方(即PBS中含0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Na3N，pH7.4) 1.结核分枝杆菌检测液相芯片试剂盒，包括有 1)8-plex包被微球含有分别包被了ESAT-6捕获抗体的20号微球，包被了CFP-10捕获抗体的24号微球的偶联体，包被了38kD蛋白捕获抗体的32号微球，包被了16kD蛋白捕获抗体的34号微球，包被了LAM捕获抗体的38号微球，包被了Ag85B捕获抗体的51号微球，包被了MPT-64捕获抗体的53号微球，和包被了TBGL捕获抗体的72号微球。
2)8-plex生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的检测抗体； 3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10ug/ml)；还按照现有技术配套有 4)分析缓冲液； 5)8-plex标准品； 6)质控液I； 7)质控液II； 8)血清基质液； 9)封口膜； 10)滤板。
2.制备上述液相芯片试剂盒，包括有如下步骤 (1)按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同 -用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20s； -取50μL微球(美国Luminex公司)于1.5ml的离心管中，8,000g以上速度离心2min； -去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，8000g(或以上)速度离心2min； -吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s； -加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀； -加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀； -室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀； -活化后的微球，≥8000g，离心2min； -吸弃上清，将微球重悬于250μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；微球≥8000g，离心1-2min；重复该步骤一次； -吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s； -往悬浮的微球中加入1μg抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至500μL； -用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡2hr； -偶联抗体后的微球以≥8000g的速度，离心1-2min； -吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s； -室温避光振荡30min； -微球≥8000g，离心1-2min； -吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；微球≥8000g，离心1-2min；重复该步骤一次； -吸弃上清，将微球重悬于600μL PBS-TBN溶液中； -包被好的微球通过luminex仪器计数； -包被好的微球置于2-8℃避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择等比例混合。
(2)按上述试剂盒的组成，每种检测抗体的生物素标记 -依据蛋白浓度计算反应体系，填写表格； -依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积(V)； -配置NHS-Biotin反应液； -按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液； -加入1/10目标体积的NaHCO3(pH8.9)溶液； -加入PBS(pH7.4)补至目标体积； -包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm； -将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin； -测定蛋白浓度。
3.用于检测，包括如下步骤 1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。
2)标准品的稀释每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度(同下表中的预期浓度) 注意每个浓度标准品稀释完后均必须用涡旋混合仪彻底混匀后才可用于下一浓度的稀释。混匀过程避免产生泡沫。
3)设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。
4)按照设置好的96孔板布局，每孔加25μl分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。
5)分别取出上述制备的针对结核分枝杆菌特异性分泌抗原检测的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，超声处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为40个/μl。往每孔中加入的八种捕获抗体偶联微球的混合悬液25μl。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。
6)用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。
7)孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述八种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到10ug/ml，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。
8)孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。
9)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。
4.实验结果分析 (请参见表1-4，图1至图8) 本发明所公开的结核分枝杆菌快速检测液相芯片只需25μL的血清样本，并且在3个小时之内一次反应同时完成八种结核分枝杆菌特异性分泌抗原的定量检测。通过多种抗原的联合检测，在保证特异性的基础上提高乐检测的灵敏度，并可用于结核分枝杆菌的自然感染或卡介苗接种后阳转者的区别。同时，与放射免疫，化学发光检测及酶联免疫吸附等方法相比，液相芯片平台检测线性范围更宽，灵敏度更高，重复性更好。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。
通过标准曲线的分析，可以看到本发明所提供的结核分枝杆菌快速检测液相芯片对结核分枝杆菌特异性分泌抗原的检测具有很宽的检测线性范围及很高的检测灵敏度和特异性。八种结核分枝杆菌特异性分泌抗原检测的标准曲线的线性在97.7pg/ml～100ng/ml的浓度范围内R2均≥0.99，最低检测限可达97.7pg/ml。同时，各个标准点的实测浓度与预期浓度的相对误差不超过8％。因此，本发明提供的结核分枝杆菌快速检测液相芯片能对结核分枝杆菌感染后人的血清、脑脊液、痰液中极微量的结核杆菌特异性分泌抗原进行检测，并且能一次性检测八种目前已被大量文献证实在结核分枝杆菌感染的不同病程中特异表达的分泌性抗原，从而提高结核分枝杆菌检测的准确率和检测的效率。
表1 表2 表3 表4
权利要求
1.一种结核分枝杆菌检测液相芯片，其特征是，主要包括有
1)包被微球含有分别包被了ESAT-6捕获抗体的微球、包被了CFP-10捕获抗体的微球、包被了38kD蛋白捕获抗体的微球、16kD蛋白捕获抗体的微球，包被了LAM捕获抗体的微球、包被了Ag85B捕获抗体的微球，包被了MPT-64捕获抗体的微球、包被TBGL捕获抗体的微球中三种或三种以上，上述微球分别具有不同颜色编码；
2)生物素标记检测抗体分别用生物素标记的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的检测抗体中的对应于包被微球的三种或三种以上；和
3)链亲和素藻红蛋白。
2.一种制备权利要求1所述结核分枝杆菌检测液相芯片的方法，主要包括以下步骤
(1)相应的捕获抗体包被微球
-将50μL微球活化后，≥8000g，离心；
-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于≥8000g，离心1-2min；重复该步骤；
-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；
-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL；
-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；
-偶联了抗体后的微球以≥8000g的速度，离心1-2min；
-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s；
-室温避光振荡30min；再于≥8000g，离心1-2min；
-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；微球≥8000g，离心1-2min；重复该步骤一次；
-吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；
-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为40个/μl；
(2)每种检测抗体的生物素标记
-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；
-配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；
-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；
-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHCO3溶液；
-加入pH7.4的PBS补至目标体积；
-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm；
-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；
-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到10ug/ml。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所述活化微球的步骤如下
-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；
-取50μL微球离心1-2min；
-去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，≥8000g离心1-2min；
-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s；
-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；
-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；
-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌快速检测液相芯片，主要包括有包被微球；分别用生物素标记的检测抗体；和链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的检测结核分枝杆菌分泌特异性抗原的液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，各项结核分枝杆菌分泌特异性分泌抗原标志物可自由组合，使用方便。同时，由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。
文档编号G01N33/569GK101216491SQ20081002568
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月8日 优先权日2008年1月8日
发明者许嘉森, 林一群, 杨惠夷 申请人:广州益善生物技术有限公司