专利名称：一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杨树下胚轴特异表达启动子 ProffOXllb及其应用。
背景技术：
扦插作为林木无性繁殖的重要手段，不仅简单易行、效高价廉，而且能保持母株的优良性状、提早开花结实。20世纪70年代以来，随着无性系林业的兴起，林木扦插技术日益成熟，广泛应用。在林业生长实践中，通常所说的扦插，一般指硬枝扦插或嫩枝扦插，其关键是不定根的形成首先是薄壁细胞或维管束细胞脱分化形成特定细胞群，即分生点-根原始体，而后分生细胞逐渐向活跃状态转变并且开始分裂，新产生的细胞群逐渐形成锥状体并分化成木质部和韧皮部，继而与插穗的输导组织结合在一起，渐渐地根原基穿过皮层和表皮向外突出形成不定根(Haissig 1974a)。有些树种不定根原始体在发育早期未离体时就已经产生，即潜伏根原始体。扦插前它一直处于休眠状态，直至插穗离体后在适宜的环境条件下继续发育成根原基产生不定根。但也有一些树种是在扦插后才分化出根原始体，称为诱发根原始体。林木扦插生根按其形成的时间、部位和机制可分为皮部生根型、愈伤生根型和混合生根型三大类。皮部生根型植物在插穗离体前或经过贮藏，激素处理后，插穗皮层、形成层等组织就有根原始体形成，扦插后，只是根原始体的继续生长发育。愈伤组织生根型是在插穗扦插后从下切口愈伤组织内的再生维管形成层处，或在切口处的原维管形成层产生愈伤组织的同时，也产生不定根原始体，进而形成不定根。混合生根类型是指既有皮部生根， 又有愈伤组织生根；其过程是扦插后，先是皮部生根来吸收水分和养分以维持生命，待下切口愈伤组织生根后，皮部产生的不定根有的很快衰亡，有的退居次要，而由愈伤组织产生的不定根发育成植株的主要根系。林木扦插生根是一个非常复杂的生物学过程，国内外学者对其机理进行了大量研究，但这些工作都局限于解剖学和生理学领域，对扦插生根分子机理的认识和了解比较缺乏。一方面在于林木分子遗传学起步较晚；再者，由于林木自身的一些生物学特性，在林木中精确定位与克隆未知基因一度被视为遗传学研究领域的难点。杨树全基因组测序完成， 克隆和验证杨树生长发育相关基因成为可能。WOX基因家族在根尖干细胞维持、不定根根原基启动等过程中起着非常重要的作用。在杨树中克隆和鉴定不定根特异表达启动子，不仅可丰富植物根系分子生物学的理论基础，而且在植物无性繁殖和离体器官再生方面具有重要的应用价值。植物基因工程中常用的启动子有3类组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组织特异性启动子是指在这类启动子调控下，基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。在杨树中尚未有克隆和鉴定不定根特异表达启动子的相关报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb。本发明的另一目的是提供一种杨树下胚轴特异表达启动子 ProffOXllb 的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb，其氨基酸序列如SEQ NOl所示。含有杨树下胚轴特异表达启动子ftOWOXllb的载体。所述载体在ftOWOXllb启动子的3’端组装GUS报告基因。所述载体组装Bial基因表达盒，作为转基因植物的筛选标记，可以用除草剂进行转基因植株的筛选。所述载体组装LB和RB序列，促使组装于其间的 ProffOXllb启动子表达框架和筛选标记基因Bial整合至植物受体细胞染色体中。含有杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb的宿主细胞。杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb在调控基因在植物体下胚轴特异表达中的应用。本发明以南林 895 杨(Populus χ euramericana cv. ‘Nanlin895，)DNA 为材料，采用锚定PCR、反向PCR、TAIL-PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得到杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb序列。采用通路克隆技术构建植物启动子表达载体 pBG⑶S-ProWOXllb，该启动子序列后接⑶S报告基因，在启动子ftx)W0Xllb的驱动下，报告基因⑶S可在植物下胚轴特异表达。有益效果本发明通过农杆菌介导将ftx)W0Xllb启动子转入拟南芥，转ftx)W0Xllb 启动子载体的T2代拟南芥植株GUS染色结果显示，GUS基因在下胚轴特异表达。因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因在下胚轴特异表达，改良优良品种选育进程。
图1是植物表达载体pBGGUS的结构示意图；图2是野生型植株⑶S染色图；图3是转基因植株⑶S染色图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的主要试剂盒和药品为Plant Genomic DNA Kit(TIA NGEN)， LR Clonase II enzyme Mix (Invitrogen),pCR 8/Gff/T0P0 vect or (Invitrogen),TaKaRa LA Taq(TaKaRa)，TaKaRa Taq(TaKaRa)，pMD_19T(TaKaRa)，H. Q. &Q. Gel Extraction kit II(安徽优晶生物工程有限公司)，末端转移酶(TaKaRa)，Bgl II (NEB)，BamH I (NEB)，T4DNA Ligase (Fer mentas)。所有引物合成及测序工作均由hvitrogen (上海)完成。其他未作出说明的均为常规要求。实施例1提取南林895杨DNA
可采用常规方法提取南林895杨DNA，也可以采用TIANGEN公司的植物基因组DNA 提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)来提取南林895杨DNA，操作步骤稍有改进吸取ImL缓冲液GPl于2mL离心管中，65°C预热；同时，取南林895杨组培苗叶片 IOOmg于液氮中充分研磨；分装65°C预热GPl缓冲液；将研磨精细的样品粉末迅速转移到预热的ImLGPl缓冲液中(加样前在预热的ImL缓冲液GPl中加入10 μ L β -巯基乙醇)， 剧烈颠倒混勻后65°C水浴20min ；加入ImL氯仿，充分混勻，12000rmp离心5min后转移上层水相至新的离心管中；重复该步骤一次；向装有上层水相的离心管中加入ImL缓冲液GP2， 充分混勻；将混合液转入吸附柱CB3中，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白液⑶，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液PW，12000rmp离心30seC，弃滤液；将吸附柱CB3转入新的离心管，12000rmp离心2min，去除残余的漂洗液， 室温静置气干吸附柱CB3 ；将吸附柱CB3转入新的离心管中，向吸附膜的中部加入50 μ L灭菌Milli-Q水，室温静置anin，12000离心30sec ；将滤液重新转入吸附柱CB3中，室温静置 2min, 12000离心2min，滤液即为基因组DNA。实施例2克隆ftOWOXlla启动子以南林895杨DNA (实施例1制备)为材料，采用锚定PCR、反向PCR、TAIL_PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得到ftx)W0Xllb启动子序列，如SEQ NOl所示。主要过程如下(1)锚定 PCR单引物PCR扩增以2μ g南林895杨基因组总DNA为模板，采用锚定PCR单引物进行单引物扩增，锚定PCR单引物序列为5’ACACCACCGCTATCGTATGCCCGT 3’。反应体系如下 IOXEx PCR Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 4. 0 μ L ；25mM Mg2+ 4. 0 μ L ； Ex Taq DNA Polymerase (5U/μ L) 0· 25 μ L ；锚定 PCR单引物(10 μ Μ) 2 μ L ；模板(895 杨 DNA 1 μ g/ μ L) 2 μ L ；加无菌 ddH20 补足 50 μ L。反应程序预变性 94°C，7min -MV，30s, 62°C， 30s，72°C，1. 5min, 25个循环，常规方法回收产物。加尾反应在单引物PCR扩增的回收产物中加入6μ L加尾缓冲液(5X)，lyL 10mmol/L dCTP后，再加无菌双蒸水至^yL ；反应混合物先在94°C保温2min，立即置于冰上，加入1 μ L末端转移酶后在37°C保温15min，再在75°C保温IOmin以灭活末端转移酶。巢式PCR 采用锚定引物 AAP :5，GGCCACGCGTCGACTAGTAGTACGGGGGGGGG3，和巢式基因特异性引物5’ GCTTTGGAGTCCACCTTGACCTC 3’对加尾产物的扩增。反应体系如下 IOXEx PCR Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 4. 0 μ L ； 25mM Mg2+4. 0μ L ； Ex Taq DNA Polymerase (5U/μ L) 0· 25 μ L ；锚定引物 ΑΑΡ (10 μ Μ) 2 μ L ；巢式基因特异性弓丨物(10 μ Μ) 2 μ L ；加尾产物1 μ L ；加无菌ddH20补足50 μ Lo反应程序预变性940C，5min ； 940C，30s, 55°C，30s, 72°C，2min, 35 个循环；72°C，IOmin0使用安徽优晶生物工程有限公司DNA凝胶回收试剂盒(H. Q. &Q. Gel Extract ion kit II)回收纯化PCR产物。具体操作称量回收凝胶重量，近似折算其体积；加入等体积的 NJ缓冲液，60°C温浴7min至凝胶完全融化；将融化后的DNA-琼脂糖溶液转入Mu-Pu DNA回收纯化柱中，室温12000rmp离心lmin，弃滤液；向纯化柱中加入700 μ L工作浓度的SPW(即等体积无水乙醇稀释)洗涤缓冲液，静置2-3min，室温13000rmp离心lmin，弃滤液；重复此步骤一次；室温13000rmp离心Imin以干燥纯化柱；将纯化柱转移至新的1. 5mL离心管中， 加入30-50 μ L灭菌Milli-Q水，静置Imin后13000rmp离心lmin，滤液即为纯化的PCR产物；取2μ L纯化产物，琼脂糖凝胶电泳检测，判断回收片段是否含有杂带，避免非特异PCR 产物影响后续实验。纯化片段与克隆载体的连接反应采用TaKaRa公司的pMD19-T simple V etor 克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进，具体为反应体系(5yL) 2. 2μ L 纯化回收的 PCR 产物，0. 3μ L pMD_19Simple Vector, 2. 5μ L Solution I。反应条件16°C 30min ；4°C过夜。大肠杆菌转化将新鲜制备或-70°C冻存的大肠杆菌T0P10感受态细胞在冰上融化；取5 μ L纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100 μ L感受态细胞中，并轻轻混勻，冰浴30min左右；42°C水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min ；加入800yL LB液体培养基， 370C，IOOrmp摇菌Ih ；4000rmp离心3min，吸掉上层800 μ L培养基，混勻剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37°C倒置培养过夜。阳性克隆筛选及测序分析从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中， 37°C，250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测，反应体系如表3所示，反应程序为反应程序为-MV，3min ；94°C，30s, 60°C，30s, 72°C，lmin, 28 个循环；72°C，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定， 得锚定PCR序列片段，序列如SEQ N02所示。(2)反向 PCR采用限制性内切酶对南林895杨DNA进行消化采用Bgl II，BamH I对1 μ g南林895杨DNA进行双酶切完全消化，反应体系如下Bgl II 1. 0 μ L，IOXH buffer 2. 0 μ L, DNA l.OyL,加无菌ddH20补足20 μ L。反应程序37°C，lh。所得产物纯化回收再经第二步酶切，反应体系如下BamH I l.OyL, 10XK buf fer 2. 0μ L,DNA 1. 0 μ L，加无菌 ddH20 补足20yL。反应程序30°C，lh。酶切消化后的产物进行纯化后，溶解在无菌水中。环化反应采用T4DNA Ligase进行线性DNA片段的自我环化连接反应，得环化连接反应产物。反应体系如下线性 DNA 10-50 μ g ； 10XT4DNA Ligas e buffer 5μ L ； T4DNA 1^8386(5"4 014 1^加无菌(1(1!120补足5(^1^反应程序22°C温育lh，再在65°C保温 IOmin 灭火 T4DNA Ligase。巢式PCR扩增获得启动子序列采用巢式引物进行反向PCR扩增启动子片段。以 SEQ N02的序列为参考，设计巢式引物。巢式引引物为F1 3‘CCCAAAATAACATTCCTTCCGGTTC 5', Rl 3' TTTGACTGGACTTCGGTGCTTGA5', F2 3' CAAAATAACATTCCTTCCGGTTCAC 5', R2 3，GGACTTCGGTGCTTGAATTTACAAC 5，。反应体系如表 2 所示。反应程序94°C，3min ；94°C, 30sec,60°C，30sec, 72°C，2min, 35cycles ；72°C，7min。对 PCR产物依次进行回收纯化、连接 T载体、转化大肠杆菌、挑选克隆测序，方法与锚定PCR过程相同。最终得反向PCR序列片段，序列如SEQ N03所示。表2巢式PCR扩增获得启动子序列的反应体系
权利要求
1.一种杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有权利要求1所述的杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体在ftx)W0Xllb启动子的3’端组装GUS报告基因。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体组装Bial基因表达盒，作为转基因植物的筛选标记，可以用除草剂进行转基因植株的筛选。
5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体组装LB和RB序列，促使组装于其间的ftx)W0Xllb启动子表达框架和筛选标记基因Bial整合至植物受体细胞染色体中。
6.含有权利要求1所述的杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb的宿主细胞。
7.权利要求1所述的杨树下胚轴特异表达启动子ftx)W0Xllb在调控基因在植物体下胚轴特异表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b及其应用。启动子ProWOX11b的核苷酸序列如SEQNO1所示。本发明以南林895杨DNA为材料，采用锚定PCR、反向PCR、TAIL-PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得到杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b序列。采用通路克隆技术构建植物启动子表达载体pBGGUS-ProWOX11b，该启动子序列后接GUS报告基因，在启动子ProWOX11b的驱动下，报告基因GUS可在植物下胚轴特异表达。因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因在下胚轴特异表达，改良优良品种选育进程。
文档编号C12N15/113GK102559681SQ20121001756
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 谢雯凡, 陈英, 黄敏仁 申请人:南京林业大学