专利名称：抑制CYP3A4的shRNA表达质粒及构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制药物代谢酶CYP3A4表达的三种shRNA表达质粒及构建，以及三种shRNA表达质粒单独或混合使用时对CYP3A4基因和蛋白抑制作用，能够有效地降低CYP3A4的表达，用于新药研发中的成药性评价，以提高药物研发的成功率；用于临床使用药物的相互作用的预测，以减少或避免不良反应。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。RNAi技术是利用RNAi原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法①化学合成法.级siRNA表达载体；@ dsRNA表达载体。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶 III启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人Hl启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III启动子下游。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究，这是因为带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。RNAi作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术，具有明显的优点，它比反义核酸技术优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景。药物代谢性质是药物开发过程中，化合物成药性的重要指标。而药物代谢酶在药物的代谢转化过程中扮演了重要的角色。其中细胞色素P450 (CYP450)酶参与的氧化代谢是药物消除的主要途径。CYP3A4是人体含量最丰富的P450酶，参与市场上50%以上的药物代谢。在药物的代谢性相互作用中，由酶的抑制引起的相互作用约占全部相互作用的70%。 针对CYP3A4的化学抑制剂的研究已十分广泛，但由于化学抑制剂特异性差，因此有关抑制剂选择性的全面信息有待进一步探讨。与化学抑制剂相比，RNAi技术则能够实现基因表达的高效率阻断，特异性更强，从而避免对其他药物代谢酶或转运体的影响。目前针对CYP3A4 的RNA干扰多采用针对某一位点的shRNA表达质粒，而采用作用于多靶点的shRNA表达质粒混合物尚无报道
发明内容
本发明的目的是提供抑制CYP3A4的shRNA表达质粒，通过以下方法构建
(I)在Genebank中查找CYP3A4的序列(匪.017460)，根据干扰片段设计原则(http:// www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)，具体原则如下从转录本(mRNA)的 AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，以GC含量在45%— 55%左右的siRNA作为潜在的siRNA靶位点。并依据CYP3A4的序列，利用设计软件，并通过Blast软件排除与基因组其他基因(人、小鼠、大鼠等)具有同源性的序列，获得三个符合要求的shRNA模板序列，作用位点分别为773、923和1191。(1) 773位点的shRNA模板正义链序列为
5’-GATCCAGTCGCCTCGAAGATACACTTCAAGAGAGTGTATCTTCGAGGCGACTTTA-3，
773位点的shRNA模板反义链序列为
5’-AGCTTAAAGTCGCCTCGAAGATACACTCTCTTGAAGTGTATCTTCGAGGCGACTG-3’
其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接；序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’ -AGTCGCCTCGAAGATACAC-3’ 和 5’ -GTGTATCTTCGAGGCGACT-3’ 分别为 773 靶点的正义和反义序列。用无菌水将化学合成的773正义和反义shRNA模板粉末分别稀释至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降温的条件下退火成双链shRNA模板，然后克隆至经BamHI和HindIII双酶切的pSilencer4. I CMV neo载体上，转化DH5 α感受态细胞，氨苄抗生素筛选阳性克隆， 选取若干长出的菌落至LB培养基中过夜培养，用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒(结果参见图2，其中773 1-6: shRNA表达质粒773克隆1-6)，选取773 2号进行测序鉴定，结果正确后于_80°C保存。773 2号命名为SI。(2 ) 923位点的shRNA模板正义链序列为
5’-GATCCACCACGAGCAGTGTTCTCTTTCAAGAGAAGAGAACACTGCTCGTGGTTTA-3’
923位点的shRNA模板反义链序列为
5’-AGCTTAAACCACGAGCAGTGTTCTCTTCTCTTGAAAGAGAACACTGCTCGTGGTG-3’
其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接；序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’ -ACCACGAGCAGTGTTCTCT-3’ 和 5’ -AGAGAACACTGCTCGTGGT-3’ 分别为 923 靶点的正义和反义序列。用无菌水将化学合成的923正义和反义shRNA模板粉末分别稀释至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降温的条件下退火成双链shRNA模板，然后克隆至经BamHI和HindIII双酶切的pSilencer4. I CMV neo载体上，转化DH5 α感受态细胞，氨苄抗生素筛选阳性克隆， 选取若干长出的菌落至LB培养基中过夜培养，用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒(结果参见图2，其中923 1-6: shRNA表达质粒923克隆1-6)，选取923 2号进行测序鉴定，结果正确后于_80°C保存。923 2号命名为S2。(3) 1191位点的shRNA模板正义链序列为
5’-GATCCGCTATGCTCTTCACCGTGATTCAAGAGATCACGGTGAAGAGCATAGCTTA-3’
1191位点的shRNA模板反义链序列为
5’-AGCTTAAGCTATGCTCTTCACCGTGATCTCTTGAATCACGGTGAAGAGCATAGCG-3’其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接；序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’-GCTATGCTCTTCACCGTGA-3’ 和 5’-TCACGGTGAAGAGCATAGC-3’ 分别为 1191 靶点的正义和反义序列。用无菌水将化学合成的1191正义和反义shRNA模板粉末分别稀释至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降温的条件下退火成双链shRNA模板，然后克隆至经BamHI和HindIII双酶切的pSilencer4. I CMV neo载体上，转化DH5 α感受态细胞，氨苄抗生素筛选阳性克隆， 选取若干长出的菌落至LB培养基中过夜培养，用质粒提取试剂盒(天根)提取质粒(结果参见图2，其中1191 1-6: shRNA表达质粒1191克隆1-6)，选取1191 I号进行测序鉴定，结果正确后于_80°C保存。1191 I号命名为S3。本发明的另一个目的是提供所述的抑制CYP3A4的三种shRNA质粒单独或等比例混合物在制备CYP3A4的特异性抑制剂中的应用，在新药研发和药物合理应用研究中，用于 CYP3A4底物和诱导剂的筛选和确证。本发明构建的三种新的分别作用于CYP3A4不同位点的shRNA表达质粒，单独或等比例混合能够有效地抑制CYP3A4的表达，与单独作用相比，这三种shRNA表达质粒的等比例混合物作用更强，且对与CYP3A4同源性非常高的CYP3A5的表达无影响。因此，该shRNA 表达质粒混合体系可以作为CYP3A4的特异性抑制剂，用于新药研发和药物合理应用研究中，CYP3A4底物和诱导剂的筛选和确证。在CYP3A4底物确证中的应用。在利福平诱导的HepG2细胞(中国科学院细胞库， TCHu 72)中，本发明的shRNA质粒的等比例混合物能够逆转GA(15:1)对H印G2细胞的毒性作用。综上说明，在新药研发中(1)本发明构建的三种shRNA表达质粒的有效作用形式为等比例混合物，该混合物能够特异性地抑制CYP3A4基因和蛋白的表达，可以作为CYP3A4的专属性抑制剂使用；(2)本发明中的shRNA质粒的等比例混合物能够降低CYP3A4的活性， 在CYP3A4底物和诱导剂的筛选和确证中有重要用途；(3)本发明中的shRNA质粒的等比例混合物可以用于筛选和确证经过CYP3A4代谢增加活性或增加毒性的药物；(4)本发明中的 shRNA质粒的等比例混合物可以用于CYP3A4参与的信号通路的研究。本发明在完成shRNA表达质粒的构建后，通过三种不同的细胞模型，检测shRNA 表达质粒对CYP3A4基因和蛋白表达的抑制作用。(I)在CHL (中国科学院细胞库，GNHa 2) -CYP3A4瞬转细胞模型中，shRNA表达质粒单独作用时抑制效果较弱，而三种质粒的等比例混合物对CYP3A4的抑制率达到60%，该应用说明三种质粒的等比例混合物能够对CYP3A4 的基因表达产生更为有效的抑制，从而确定了 shRNA表达质粒的有效作用形式，因此后续的应用均采用混合物形式的shRNA表达质粒；(2)在HEK293 (中国科学院细胞库，GNHu D-CYP3A4瞬转细胞模型中，shRNA表达质粒等比例混合物对CYP3A4基因的抑制率为55%， 同时对CYP3A4蛋白的表达也有明显的抑制作用，该应用进一步验证了三种shRNA质粒的等比例混合物对CYP3A4表达有显著的抑制作用；(3)在利福平诱导的HepG2细胞(中国科学院细胞库，TCHu 72)中，shRNA表达质粒等比例混合物对CYP3A4基因和蛋白的抑制率均为 50%左右，并对与其同源性较高的CYP3A5基因无影响，该应用在外源性导入CYP3A4结果的基础上，进一步检测三种shRNA质粒的等比例混合物对内源性CYP3A4基因和蛋白表达的影响，证实该shRNA质粒的等比例混合物明显降低内源性CYP3A4的表达，并对其他与CYP3A4同源性高的基因无抑制作用。本发明提供的CYP3A4 shRNA表达质粒与已报道的干扰质粒比较，具有(I)本发明构建的shRNA表达质粒与miRNA质粒相比，能够作用于CYP3A4的编码区序列，直接降解 CYP3A4的mRNA，效果更显著，而miRNA质粒作用于非编码区，对CYP3A4 mRNA的降解作用较弱；(2)本发明采用shRNA表达质粒混合物进行抑制实验，该混合物针对CYP3A4不同的位点，抑制效果较单一质粒更强；(3)本发明的shRNA混合表达质粒与化学抑制剂相比，具有良好的专属性，对其它药物代谢酶或转运体无抑制作用，从而排除非特异性抑制干扰，可以作为CYP3A4的特异性抑制剂来使用。
图I质粒PGL3/CYP3A4的PCR鉴定电泳图。图2 shRNA表达质粒电泳图。图3双萤光素酶报告基因实验检测各组shRNA表达质粒对CHL-CYP3A4瞬转细胞的CYP3A4基因表达的影响(means ± SD, n=3)。图4 双萤光素酶报告基因实验检测shRNA表达质粒等比例混合物对 HEK293-CYP3A4 瞬转细胞 CYP3A4 基因表达的影响(means 土 SD, n=3)。 图5免疫荧光化学实验检测shRNA表达质粒等比例混合物对HEK293-CYP3A4瞬转细胞CYP3A4蛋白表达的影响。图6利福平诱导HepG2细胞高表达CYP3A4的条件(means 土 SD, n=3)。图7 RT-PCR实验检测shRNA表达质粒等比例混合物对利福平诱导的H印G2细胞 CYP3A4基因表达的影响。图8 Western blotting实验检测shRNA表达质粒等比例混合物对利福平诱导的 H印G2细胞CYP3A4蛋白表达的影响。图9 Western blotting实验检测shRNA表达质粒等比例混合物对利福平诱导的 H印G2细胞CYP3A5蛋白表达的影响。图10 MTT实验检测转染shRNA表达质粒等比例混合物后，GA (15:1)对利福平诱导的HepG2细胞的存活性变化。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。通过下列实施例对本发明的技术特征做详细的描述，但不限制本发明。实施例I pGL3/CYP3A4重组质粒的构建
设计含XbaI和FseI酶切位点的PCR引物，从原重组载体(PGEMT-CYP3A4)上扩增 CYP3A4⑶S基因，连接至载体pGL3 promoter中，经转化、挑菌、摇菌、提取质粒后进行PCR 鉴定(结果参见图1，其中I:克隆I质粒PCR产物，2:克隆2质粒PCR产物，3:克隆3质粒PCR产物，PCR产物大小为1512bp)，取I号进行测序鉴定，结果正确，鉴定正确后_80°C 保存以备后续实验使用。实施例2 shRNA表达质粒的构建
I.CYP3A4干扰靶位点序列的筛选及shRNA模板的设计在Genebank中查找CYP3A4的序列，根据干扰片段设计原则(http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)和 CYP3A4 的序列，利用设计软件，并通过Blast 软件排除与基因组其他基因具有同源性的序列，获得三个符合要求的shRNA模板序列，针对 CYP3A4的位点分别为773,923和1191。
权利要求
1.抑制CYP3A4的shRNA表达质粒，通过以下方法构建(1)在Genebank中查找CYP3A4的序列匪.017460，根据干扰片段设计原则从转录本 mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，以GC含量在45%-55%左右的siRNA作为潜在的siRNA靶位点，并依据CYP3A4的序列，利用设计软件， 并通过Blast软件排除与基因组其他基因具有同源性的序列，获得三个符合要求的shRNA 模板序列，作用位点分别为773、923和1191 ；(2)用无菌水将化学合成的773正义和反义shRNA模板粉末分别稀释至50μ Μ，在95°C 至25°C逐步降温的条件下退火成双链shRNA模板，然后克隆至经BamHI和HindIII双酶切的pSilencer4. I CMV neo载体上，转化DH5 α感受态细胞，氨苄抗生素筛选阳性克隆，选取若干长出的菌落至LB培养基中过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，其中773 1-6: shRNA表达质粒773克隆1-6)，选取773 2号进行测序鉴定，结果正确后于_80°C保存，773 2号命名为SI ；其中用923正义和反义shRNA模板粉末和1191正义和反义shRNA模板粉末代替773 正义和反义shRNA模板粉末，923 1-6: shRNA表达质粒923克隆1_6，923 2号命名为S2， 1191 1-6: shRNA表达质粒1191克隆1-6，1191 I号命名为S3 ;773位点的shRNA模板正义链序列为5’-GATCCAGTCGCCTCGAAGATACACTTCAAGAGAGTGTATCTTCGAGGCGACTTTA-3，反义链序列为5’-AGCTTAAAGTCGCCTCGAAGATACACTCTCTTGAAGTGTATCTTCGAGGCGACTG-3’其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接;序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’ -AGTCGCCTCGAAGATACAC-3’ 和 5’ -GTGTATCTTCGAGGCGACT-3’ 分别为 773 靶点的正义和反义序列；923位点的shRNA模板正义链序列为5’-GATCCACCACGAGCAGTGTTCTCTTTCAAGAGAAGAGAACACTGCTCGTGGTTTA-3’反义链序列为5’-AGCTTAAACCACGAGCAGTGTTCTCTTCTCTTGAAAGAGAACACTGCTCGTGGTG-3’其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接;序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’ -ACCACGAGCAGTGTTCTCT-3’ 和 5’ -AGAGAACACTGCTCGTGGT-3’ 分别为 923 靶点的正义和反义序列；1191位点的shRNA模板正义链序列为5’-GATCCGCTATGCTCTTCACCGTGATTCAAGAGATCACGGTGAAGAGCATAGCTTA-3’反义链序列为5’-AGCTTAAGCTATGCTCTTCACCGTGATCTCTTGAATCACGGTGAAGAGCATAGCG-3’其中序列两端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分别为BamHI和HindiII酶切位点， 用于与pSilencer4. I CMV neo载体连接;序列中间的5’ -TTCAAGAGA-3’为loop序列； 5’-GCTATGCTCTTCACCGTGA-3’ 和 5’-TCACGGTGAAGAGCATAGC-3’ 分别为 1191 靶点的正义和反义序列。
2.根据权利要求I所述的抑制CYP3A4的shRNA质粒在制备CYP3A4的特异性抑制剂中的应用，其特征在于，用于CYP3A4底物和诱导剂的筛选和确证。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的三种抑制CYP3A4的shRNA质粒单独或等比例混合使用。
全文摘要
本发明提供抑制CYP3A4的shRNA表达质粒，根据干扰片段设计原则和CYP3A4的序列，通过Blast软件排除与基因组其他基因具有同源性的序列，获得三个符合要求的shRNA模板序列，将合成的上述shRNA模板分别克隆，通过氨苄抗性筛选和测序，成功获得三种shRNA表达质粒。在不同的细胞模型中，shRNA单独或混合表达质粒均能够较好地抑制CYP3A4mRNA表达(55％)和蛋白表达(50％)，且无脱靶效应，具有良好的专属性。因此，本发明提供的三种shRNA表达质粒可以作为CYP3A4的特异性抑制剂，用于CYP3A4底物和诱导剂的筛选和确证。
文档编号C12N15/66GK102586325SQ20121001717
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者余露山, 周慧, 徐思云, 曾苏, 王鹭, 胡海红, 蒋惠娣 申请人:浙江大学