专利名称：人芳香化酶基因真核表达质粒构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属医学分子生物学领域，具体涉及一种表达人芳香化酶基因的 PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1-GFP真核表达质粒的构建及应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在西方国家，其发病率占女性恶性肿瘤的 第一位。近年来，我国乳腺癌的发病率迅速上升，在许多大城市，其发病率已经成为女性恶 性肿瘤的第一位。并且呈现出乳腺癌发病年龄早，就诊时间晚的特点，这些患者正处于最佳 工作年龄状态(即从30岁开始增加，在40-49岁为年龄高峰)。因此，乳腺癌发病率的增加 无疑对社会及家庭产生巨大影响。内分泌治疗是乳腺癌主要全身治疗手段之一。三苯氧胺和第三代芳香化酶抑制剂 为乳腺癌内分泌治疗的主要药物，在不同程度上改善了不同分期患者的预后，但仍有50% 以上患者经过规范的术后辅助治疗后发生复发和转移，远期复发和死亡风险仍为目前乳腺 癌治疗面临的一大挑战。同时，内分泌治疗的长期应用带来了不容忽视的毒副反应。因此， 寻找一种有效的内分泌治疗敏感性检测手段更好地指导临床内分泌治疗的真正个体化，进 一步提高内分泌治疗疗效，改善患者预后，减少毒副反应，最终延长患者的总生存期，是目 前该领域研究的焦点。芳香化酶P450乃雄激素转化为雌激素的限速酶和关键酶，把雄烯二酮、睾酮分别 转化为雌酮、雌二醇。CYP19A1基因编码芳香化酶蛋白，目前的研究表明，该基因存在多种单 核苷酸多态性，能使其编码的芳香化酶蛋白结构和活性发生改变，可使芳香化酶活性降低、 失活、增高，间接地影响了雌激素水平，不仅与乳腺癌的易感性相关，而且与内分泌治疗的 疗效可能相关。Hirose等在日本绝经前妇女中发现CYP19A1编码蛋白第39位氨基酸由色氨酸 (Trp)变成精氨酸(Arg)的变异，并指出第一次足月产迟和肥胖的变异体携带者绝经前 发生乳腺癌的危险性明显增加(OR分别是7. 31和2. 77 ；95% CI分别是1. 88 28. 5和 1. 12 6. 87)。而Nativelle-Serpentini等认为，Arg39等位基因与乳腺癌低危险性相关。关于该基因单核苷酸多态性与乳腺癌内分泌治疗疗效之间的关系亦有相关报道。 Cynthia等的体外研究发现，来曲唑对经转染CYP1939K_264G变异体的C0S-1细胞芳香化酶蛋 白活性的抑制作用比野生型明显降低(P<0.05)。Colomer等在67例接受来曲唑治疗的 绝经后激素受体阳性晚期乳腺癌患者中的疗效与CYP19基因3’-UTR SNPs的相关性研究中 发现，CYP19基因rs4646G1673A AC或者AA基因型携带者的TTP比CC基因型携带者明显延长 (17. 2月比6. 4月；P = 0. 02)。Lopez-Guerrero等对86名接受新辅助内分泌治疗的绝经 后乳腺癌患者的研究中，发现rs4646多态性可能与内分泌治疗的疗效相关。我们的前期研究发现，在54例接受TAM术后辅助治疗的患者中，CYP19基因 rs4646CC基因型携带者的无瘤生存时间比AC基因型或A等位基因携带者明显延长(P =0.018，0.01)；在24例接受第三代AIs治疗的激素受体阳性晚期乳腺癌患者中，CC基因型 携带者至疾病进展时间比AC或AA基因型携带者也有延长趋势。综上，CYP19A1基因单核苷酸多态性可能与乳腺癌的易感性及内分泌治疗疗效相 关。然而，目前，该基因单核苷酸多态性的确切生物学功能尚未明了。因此，我们成功构建 了一种P⑶NA3. 1 (+)-CYP19Al-GFP真核表达质粒，用于进一步构建含有不同CYP19A1单核 苷酸多态性位点的真核表达质粒，研究CYP19A1基因单核苷酸多态性与乳腺癌易感性及内 分泌治疗敏感性之间的相关性。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达人CYP19A1基因的真核表达质粒，即是一种表达 人芳香化酶基因的P⑶NA3. 1 (+) -CYP19A1-GFP真核表达质粒，所述的真核表达质粒，全长 7. 6Kb，SEQ ID NO 1为人CYP19A1基因编码区核苷酸序列，SEQ ID NO 2为GFP编码区核 苷酸序列。本发明的另一个目的是提供所述的P⑶NA3. 1⑴-CYP19A1-GFP真核表达 质粒的构建，通过以下步骤实现分段扩增CYP19A1基因片段通过T-A克隆连接到 pGEM-T Easy原核表达载体上，通过Not I酶切将CYP19A1基因连接到真核表达载 体 pcDNA3. 1 (+)上构建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1563bp)质粒；在 CYP19A1 终止密码子 处通过定点突变引入BamH I酶切位点，将CYP19A1 (304bp)与pcDNA3. 1 (+) -GFP质 粒相连接，构建pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp) -GFP质粒；通过Xhol I酶切连接构建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP 真核表达质粒(SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2)。本发明的再一个目的是在构建与乳腺癌易感性与内分泌治疗敏感性相关的含有 不同CYP19A1基因单核苷酸多态性位点的真核表达质粒中的应用。本发明构建了一种P⑶NA3. 1 (+)-GFP真核表达质粒，是一种能实时检测活细胞内 基因表达和蛋白亚细胞定位的新型报告基因，操作方便，性质稳定。该报告基因检测不需底 物，可用荧光显微镜或荧光激活的细胞分类系统(FASC)直接进行检测。在此基础上，本发 明人进行了 P⑶NA3. 1 (+)-CYP19Al-GFP真核表达质粒构建，完成了本发明。可用荧光显微 镜或荧光激活的细胞分类系统(FASC)直接检测哺乳动物细胞内CYP19A1基因表达和芳香 化酶蛋白定位，且在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶作用下均能持续稳定。本发明提供了 POTNA3. l(+)-CYP19Al-GFP真核表达质粒，所插入的CYP19A1基 因片段长达1547bp，包含编码区的全长核苷酸序列，共编码503个氨基酸。可以该质粒 作为模板，采用定点突变技术构建含有多个人CYP19A1单核苷酸多态性位点的真核表 达质粒，操作简便，避免了常规RT-PCR扩增长基因片段导致的碱基错配，降低了实验成 本，而且成功率较高。在此基础上，我们已成功构建了人P⑶NA3. 1⑴-CYP19ff39E-GFP、 PCDNA3. 1 (+)-CYP19E264c-GFP 以及 PCDNA3. 1 (+)-CYPl-9ff39E_E264c-GFP 真核表达质粒等，为深 入研究CYP19A1基因单核苷酸多态性与乳腺癌易感性及内分泌治疗敏感性之间的相关性 奠定了基础。本发明构建POTNA3. 1(+)_CYP19真核表达质粒时，由于目的基因片段较长，Taq酶 保真度不够，采用了分段克隆方法。此外，在构建提供的CYP19A1-GFP真核表达质粒时应 用了定点突变技术，突变了 CYP19A1终止密码子，并引入了一段BamHl酶切识别序列，通过BamHl酶切位点将CYP19A1基因与GFP基因巧妙连接。
图 1 为 pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)EcoR I 酶切鉴定示意 2 为 PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1 BamH I 酶切鉴定示意 3 为 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1547bp)-GFP Hindlll 和 Clal 酶切鉴定示意图。 图4为CYP19 cDNA合成反应条件。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。发明中所应用的PCDNA3. 1(+)质粒以及大肠杆菌DH5 a均购自Invitrogen公司。 CYP19A1基因序列可在基因数据库中检索到，序列号NM_031226。实施例1PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1真核表达质粒构建(l)RNA 提取所使用器材均经过RNase灭活处理。具体操作如下取液氮中储存的胎盘组织至研钵研碎，置粉末于无菌EP管中，加lmlTRIzol，震 荡混勻，室温静置15'，加0.2ml氯仿震荡混勻，室温静置10分钟，4°C 12000rpmX15' 离心，将上清移至另一无菌EP管中，若中间分层蛋白较多，加入0. 5ml水饱和酚和 0. lml氯仿震荡混勻，4 °C 12000rpm离心30 〃，小心吸取上清，加0. 5ml异丙醇，混勻， 4°C 12000rpmX10'离心 RNA 沉淀，加 75% 乙醇 1ml，吹勻，4°C lOOOOrpmX 5min 离心，倒去 上液，重复两次，管口敞开，室温干燥RNA，加灭菌DEPC水20 ill。(2) RNA 检测按标准方法测定稀释后样品在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定所提 取的RNA浓度和纯度。①浓度测定A260为1的溶液含有RNA 40 u g/ml。样品RNA浓度(y g/ml)计算公式为A26(1X 稀释倍数X40iig/ml。②纯度检测RNA溶液的A26Q/A28Q比值在2. 0左右。(2) pGEM-T Easy-CYP19 (1563bp)质粒构建PCR 引物根据 Genebank 中 CYP19mRNA 序列(NM_031226)设计，上游引物 1 :5，-GA CTCTAAATTGCCCCCTCTGA-3，(SEQ ID NO 3)，下游引物 2 5，-TGACACTATTGGCAAGGATGGA-3，(S EQ ID NO 4)。以胎盘组织总RNA为模板，采用RT-PCR扩增1631bp大小CYP19基因片段， 0. 7%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，T-A克隆连接到pGEM-T Easy载体上，连接产物转化大肠 杆菌DH5 a，筛选重组质粒，酶切鉴定，经测序发现第51bp、第219bp、第1393bp、第1420bp 处产生错配，考虑PCR产物太长，Taq酶保真度不够，重新设计引物分段扩增，下游引物3 (自 917bp 起)5‘ -TCTTGTCAGGTCACCACGTTTC-3‘ (SEQ ID NO 5)；上游引物 4(自 1232bp 起) 5，-TGGAAGGATGCACAGACTCG-3，(SEQ ID NO 6)；下游引物 5 (自 1563bp 起):5，-TGACCAG CCTTCTCTAGTGTTCC-3，(SEQ ID NO :7)。引物3与引物1配对，引物4与引物5配对，分别扩增917bp、332bp大小目的基因片段。按上法分别构建pGEM-TEasy-CYP19 (917bp/332bp) 质粒，经测序验证。用Xhol I内切酶和Sal I内切酶酶切pGEM-T Easy_CYP19 (1631bp) 质粒和pGEM-T Easy-CYP19 (332bp)质粒，回收4229bp、359bp基因片段连接，构建pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)质粒，经EcoR I内切酶酶切鉴定。用BamH I和Sal I酶切pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)质粒和 pGEM-T Easy_CYP19 (917bp)质粒，回收 945bp 和 3633bp 基因 片段连接，经EcoR I内切酶酶切鉴定(见图1)。(3) PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1 真核表达质粒构建Not I 酶切 pGEM-T Easy_CYP19 (1563bp)质粒和 pcDNA3. 1 (+)质粒，切胶回收 1597bp、5428bp条带连接，BamH I酶切鉴定(见图2)，测序验证。实施例2pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp BamH I) -GFP 质粒构建设计下游引物6 :5，-GGATCCGTGTTCCAGACACCTGT-3，(SEQ ID NO :8)。与上游引物 4 配对，扩增 304bp(BamH I)片段，同上法构建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bpBamH I)质粒。用 BamH I 酶切 pcDNA3. 1 (+) -Easy-CYP19 (304bp BamH I)和 pcDNA3. 1 (+) -GFP 质粒，0. 7%琼 脂糖凝胶电泳，回收385bp和6154bp条带连接，经EcoR I、Xhol I酶切鉴定，测序验证。实施例3pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1547bp) -GFP 真核表达质粒构建用Xhol I 酶切 pcDNA3. 1 ( + )-CYP19 (304bp BamH I) -GFP 禾口 pcDNA3. l(+)-CYP19(1563bp)质粒，0. 7 % 琼脂糖凝胶电泳，回收 1045bp、6677bp 条带，连 接，构建？00嫩3.1(+)-〇丫卩19(1547匕口)-6卩？质粒(5￡0 ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2)，经Hindlll 和Clal酶切鉴定(见图3)，测序验证。实施例1、2、3中涉及的具体实验操作条件如下
1. CYP19cDNA 合成
①RT体系与条件
总RNA5u 1
10uM01igo(dT) 186. 25u 1
灭菌DEPC水3. 75u 1
15u 1
混勻，70°C水浴5'，拿出迅速置冰上，依次加入
5*Buffer5u 1
25mMdNTPs2u 1
40U/ylRnase0. 625 u 1
200U/u 1M-MLV1 u 1
灭菌DEPC水1. 375 u 1
10 u 1
混勻，42 °C水浴60'，迅速拿出置冰上待用。
②PCR体系
10XPCR Buffer5u 1
25mM Mgcl25u 1
25mM dNTPs0. 4u 1
10 li M Primer up1. 5 li 110 li M Primer down 1. 5 li 1cDNA5 u 15U/iUTaq 酶0. 5 u 1ddH2030. 1 u 1_50 U 1③反应条件参见图42. 0.7%琼脂糖凝胶电泳0. 35g琼脂糖加1XTAE溶液50ml，微波助溶，冷却至60°C，加EB2. 5iU混勻，铺 胶，待胶凝固，PCR产物50 u 1加加样缓冲液5. 5 u 1，混勻，加样，以10 y 11Kb plus作DNA 分子量标准，电压为80伏电泳。3.切胶回收紫外透射光下观察，切胶回收，放入1.5ml离心管(预先称重)内称重，并计算 胶净重，加3倍胶(重)体积QG(QIAGEN)，50°C水浴，每3分钟颠倒混勻至全溶，加至柱 子中，13000rpmXl'离心，倒去液体，加0. 5ml QG过柱，13000rpmX 1 ‘离心，弃液体，加 0. 75mlPE至柱子中，室温静置5' ； 13000rpmXl'离心，弃液体，13000rpmX 1 ‘离心，将柱 子放入1.5ml离心管中，开盖10'，待酒精挥发殆尽；柱子中加入30 yl ddH20(70°C水浴预 热)，室温静置5' ；13000X1'离心，取7 ill回收产物作连接，余-20°C保存。▲▲ 1M 氯化钙溶液(100ml)11. 2克无水氯化钙加80ml 18M Q H20充分溶解，定容至100ml，高压灭菌，待冷却， 4°C冰箱备用(用时稀释10倍)。▲感受态细菌制备从近期接种培养后4°C保存的大肠杆菌(DH5 a )菌板上挑取单个菌落，接种于7ml 无抗生素LB培养液中，37°C 300rpm摇菌过夜。取50 yl转接至5ml无抗生素LB培养液 中，37°C 300rpm培养2hr，0D600约为0. 2-0. 5。拿出至冰上，使其冷却至0°C，取lml 1M氯 化钙溶液用ddH20稀释至10ml，冰浴。取1. 5毫升菌液至无菌离心管中，4°C 5000rpmX5' 离心。倒去培养液，倒置至培养液痕量流尽，加lml冰预冷的0. 1M氯化钙溶液重悬细菌沉 淀。4°C 5000rpmX10'离心，倒去培养液，倒置至培养液痕量流尽，加lml预冷的0. 1M氯 化钙溶液重悬细菌，冰浴30'。4°C 5000rpm X5'离心，倒去培养液，倒置至培养液痕量流 尽，加入50iil0. 1M氯化钙溶液重悬细菌，即为感受态。▲转化反应及平板筛选将10 ill连接产物加入上述感受态细菌中，冰浴30'，42°C水浴1'热休克后，快 速放入冰浴2'。加入500 ill无抗生素LB培养液，37°C水浴30'，加入20% IPTG 7 yl和 2% Xgal 40 iil，涂平板，放置37°C培养箱，待干后倒置，37°C培养过夜。5.质粒提取▲常用试剂裂解液溶液I (100ml)葡萄糖50mMTris-Cl(pH 8. 0)25mMEDTA (pH 8. 0)lOmM用80ml 18MQH20 溶解 0.99085g 葡萄糖，加入 2.5ml lMTris-Cl (pH8. 0)及 2ml 0. 5MEDTA(pH 8. 0)，定溶至100ml，高压蒸汽灭菌，冷却，4°C保存。溶液II (50ml) 0. 2M NaOH(从10M储存液中现用稀释)1% (m/v) SDS现用配置，用40mll8MQH20溶解0. 5gSDS和lml 10M NaOH，定容至50ml，室温下使用。溶液III (50ml): 5M 醋酸钾 30ml冰醋酸5.75mlddH2014.25ml用30ml ddH20溶解14. 721g醋酸钾，加入冰醋酸5. 75ml，定容至50ml，4°C保存▲
扩大培养用无菌牙签挑取单个菌落(白色)于7ml含100 y g/ml氨苄青霉素的LB培养液 中，37°C 300rpm摇菌培养过夜。▲质粒提取将过夜培养菌液转入7ml离心管中，4°C 5000rpmX5'离心沉淀细菌。弃培 养液，加入200 yl冰预冷的溶液I，充分振荡悬浮细菌，加入400 yl新配制的溶液II，
8轻轻倾斜混勻，冰浴5'。加入300 ill冰预冷的溶液III，轻轻倾斜混勻，冰浴5'。 4°C 12000rpmX10'离心，小心吸取上清至1. 5ml无菌离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇，混 勻，室温放置20'。4°C 12000rpmX10'离心，小心倒去液体，75%乙醇洗涤一次。室温干 燥，加入适量TER溶液(含2 ii g/ml RNA酶)，37°C水浴30 ‘，取2 yl质粒酶切，余-20°C保存。
PCDNA3
6.质粒酶切 酶切体系及条件
质粒DNA 内切酶 Buffer ddH20
2u 1 1 u 1 2u 1 15u 1
20 u 1
37°C 酶切 2hr
实施例 4PCDNA3. 1 (+)-CYP19W39K-GFP、PCDNA3. 1 (+)-CYP19K264c-GFP 以及 1 (+) -CYPl-9W39K_K264e-GFP 真核表达质粒构建 以P⑶NA3. 1 (+) -CYP19-GFP质粒为模板，利用突变位点两侧的Hindlll和Clal位 点，在酶切位点和突变位点处分别设计PCR引物，运用PCR拼接酶切连接的方法进行突变， 具体操作由上海英骏公司完成。
10) 11)
14)
15)
1.PCR引物设计
CYP19ff39E 引物
CYP-HindIII 5' -TTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCT-3‘ (SEQ ID NO 9) CYP-WR-R 5 ‘ -GAGGATGTGCCCTCATAATTCCGCACCAAGAGAAAAAGGC-3 ‘ (SEQ IDN0
CYP-WR-F 5 ‘ -CACTGGCCTTTTTCTCTTGGTGCGGAATTATGAGGGCACA-3 ‘ (SEQ IDN0
CYP-Clal 5' -GGGTAGCCATCGATTACATCATC-3‘ (SEQ ID NO 12)
CYP19
E264C
引物
CYP-HindIII 5' -TTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCT-3‘ (SEQ ID NO 13) CYP-RC-R 5 ‘ -TCTCTTCTGTGGAAATCCTGCATCTTTTTTCTGCTATCAG-3
CYP-RC-F 5 ‘ -GTTCTGATAGCAGAAAAAAGATGCAGGATTTCCACAGAAG-3
(SEQ ID NO 16)
(SEQ IDNO (SEQ IDNO
CYP-Clal 5' -GGGTAGCCATCGATTACATCATC-3‘ 2. PCR扩增及拼接1)以 PCDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP 为模板，分别以 CYP-Hindlll/CYP-WR-R，CYP-ffR-F/ CYP-Clal, CYP-HindIII/CYP-RC-R, CYP-RC-F/CYP-Clal 引物进行扩增 循环体系如下 2)回收PCR产物。3)PCR 拼接以 CYP-HindlII/CYP-ffR-R 扩增产物和 CYP-WR-F/CYP-Clal 扩增产物为模板， 用CYP-HindlII和CYP-Cla引物进行PCR拼接；以CYP-HindIII/CYP-RC-R扩增产物和 CYP-RC-F/CYP-Clal扩增产物为模板，用CYP-Hindlll和CYP-Cla引物进行PCR拼接。PCR 体系 循环体系如下 4)回收PCR拼接产物。3. PCR产物与酶切质粒连接并克隆PCR拼接产物与PCDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP同时用Hindlll和Clal酶切，并回收连接。2)将酶切PCR产物与载体进行连接，室温2小时以上。连接体系 3)取5 ill连接反应液转化100 u 1 DH5a感受态细胞。3.从平板挑取单克隆培养，并提取质粒。4.测序验证突变。测序引物正向T7 :TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGCYP-S :ATGAGAGCATGCGGTACCAG反向TB-S CGAGTCTGTGCATCCTTCCABGH TAGAAGGCACAGTCGAGG5.以突变好的 WR 质粒为模板,用 CYP-HindIII/CYP-RC-R，CYP-RC-F/CYP-Clal 引 物扩增，并拼接。方法及过程同上。6.测序验证WR-RC双突变质粒。本发明涉及的序列。
权利要求
一种表达人芳香化酶基因的PCDNA3.1(+) CYP19A1 GFP真核表达质粒，全长7.6Kb，其特征在于，具有SEQ ID NO1的人CYP19A1基因编码区核苷酸序列和SEQ ID NO2的GFP编码区核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的真核表达质粒，其特征在于，通过以下步骤构建分段扩增 CYP19A1基因片段通过T-A克隆连接到pGEM-T Easy原核表达载体上，通过Not I酶切将 CYP19A1基因连接到真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上构建1563bp的pcDNA3. 1 (+) -CYP19质 粒；在CYP19A1终止密码子处通过定点突变引入BamH I酶切位点，将CYP19A1 (304bp)与 pcDNA3. 1 (+) -GFP 质粒相连接，构建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp) -GFP 质粒，通过 Xhol I 酶 切连接构建pcDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP真核表达质粒。
3.根据权利要求1所述的真核表达质粒在构建与乳腺癌易感性与内分泌治疗敏感性 相关的含有不同CYP19A1基因单核苷酸多态性位点的真核表达质粒中的应用。
全文摘要
本发明提供一种表达人CYP19A1基因的真核表达质粒，全长7.6Kb，具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列。通过分段扩增CYP19A1基因片段通过T-A克隆连接到pGEM-T Easy原核表达载体上，所插入的CYP19A1基因片段长达1547bp，包含编码区的全长核苷酸序列，共编码503个氨基酸。是一种能实时检测活细胞内基因表达和蛋白亚细胞定位的新型报告基因，操作方便，在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶作用下均能持续稳定。可在构建与乳腺癌易感性与内分泌治疗敏感性相关的含有不同CYP19A1基因单核苷酸多态性位点的真核表达质粒中的应用。
文档编号C12N15/85GK101921806SQ201010114639
公开日2010年12月22日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者王晓稼, 邵喜英, 陈占红 申请人:浙江省肿瘤医院