专利名称：一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌的鉴定方法，具体的说是一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，可以直接应用于科学研究领域。
背景技术：
在分子克隆和以农杆菌为介导进行植物遗传转化研究中重组农杆菌的质粒提取和纯度鉴定是一项常规的实验操作，质粒是否转化成功对后续实验有着重要影响。目前，公知的常规的农杆菌质粒DNA提取方法主要包括碱裂解法，Mini质粒提取，煮沸法等。基于农杆菌细胞的特殊性，一般在提取时需要加入一定量的裂解酶，并在提取后需要用酚、氯仿等进行纯化处理这些方法操作过程较复杂繁琐，且所使用的药品多对操作人员有直接或间接的危害。
发明内容
本发明的目的是要提供一种操作过程简单方便、使用的药品少、降低对操作人员的伤害，操作时间短的重组农杆菌质粒快速鉴定方法。本发明的目的是这样实现的，该重组农杆菌质粒快速鉴定方法包括以下步骤
(1)、将质粒PCAMBIA1302转化进入发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株后；通过涂布培养的方法，在超净工作台中，将转化后的菌液涂布在携带kan抗性的固体LB培养基的培养皿上，将培养皿用封口膜封好，保证无菌条件，将培养皿放在26. 5 0C，黑暗条件下培养1-2天；
(2)、定时观察涂布培养后培养皿中的菌落生长情况，待转化后菌落生长到2-3mm时，挑取独立生长的菌落进行摇瓶培养；
(3)、取50ml的三角烧瓶，加入IOml的LB液体培养基和IOul的kan抗生素，用牙签挑取I个独立生长的菌落加入到三角瓶中，在恒温振荡摇床中，26. 5°C，160r/min，摇瓶培养过夜；
(4)、取出摇瓶，取用Iml菌液，用分光光度计在波长为600nm时测定菌液的OD值，当菌液的0D600为I. 0-1. 2时，进行重组质粒的提取和鉴定；
(5)、在超净工作台中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中；
(6)、在高速冷冻离心机中，4°C,12000r/min,离心2min ；
(7)、离心之后,将I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，将I. 5ml Eppendoff管倒扣在无菌滤纸上吸干I. 5ml Eppendoff管中的残留液体；
(8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 悬浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反复抽吸混匀，并用涡轮混合仪充分混匀；
(9)、向步骤(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反复抽吸混匀；(10)、将步骤(9)的I.5ml Eppendoff管在室温条件下,放置3min ；
(11)、将步骤(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min后取出；
(12)、将步骤(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷冻离心机中，4°C, 12000r/min,离心2min ；
(13)、将离心之后的上清液取出，存于0.2ml的Eppendoff管中；
(14)、利用琼脂糖凝胶电泳法对重组的发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒和未经过转化的原种发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行区分；
(15)、将步骤(14)中鉴定成功的重组发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行PCR检测，准确地鉴别阳性克隆。所述的材料包括
(1)、菌种发根农杆菌A4菌株、15834菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)、根癌农杆菌GV3101菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)；
(2)、质粒pCAMBIA1302(kan抗性)(购自澳大利亚pCAMBIA公司)。本发明克服了现有技术的不足，结合溶菌酶和煮沸法提取的优点，简化操作流程和严格反应环境条件，使农杆菌质粒DNA的提取量及纯度得到了大幅度提高，缩短操作时间，并且由于操作过程中避免使用酚、氯仿等对人体有害的试剂，使实验本身对操作者的危害得以降低。
具体实施例方式本发明方法所采用的材料包括
(1)、菌种发根农杆菌A4菌株、15834菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)、根癌农杆菌GV3101菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)；
(2)、质粒pCAMBIA1302(kan抗性)(购自澳大利亚pCAMBIA公司)。该重组农杆菌质粒快速鉴定方法包括以下步骤
(1)、将质粒PCAMBIA1302转化进入发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株后；通过涂布培养的方法，在超净工作台中，将转化后的菌液涂布在携带kan抗性的固体LB培养基的培养皿上，将培养皿用封口膜封好，保证无菌条件，将培养皿放在26. 5 0C，黑暗条件下培养1-2天；
(2)、定时观察涂布培养后培养皿中的菌落生长情况，待转化后菌落生长到2-3mm时，挑取独立生长的菌落进行摇瓶培养；
(3)、取50ml的三角烧瓶，加入IOml的LB液体培养基和IOul的kan抗生素，用牙签挑取I个独立生长的菌落加入到三角瓶中，在恒温振荡摇床中，26. 5°C，160r/min，摇瓶培养过夜；
(4)、取出摇瓶，取用Iml菌液，用分光光度计在波长为600nm时测定菌液的OD值，当菌液的0D600为I. 0-1. 2时，进行重组质粒的提取和鉴定；
(5)、在超净工作台中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中；
(6)、在高速冷冻离心机中，4°C,12000r/min,离心2min ；
(7)、离心之后,将I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，将I. 5ml Eppendoff管倒扣在无菌滤纸上吸干I. 5ml Eppendoff管中的残留液体；
(8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 悬浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反复抽吸混匀，并用涡轮混合仪充分混匀；
(9)、向步骤(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反复抽吸混匀；
(10)、将步骤(9)的1.5mlEppendoff管在室温条件下,放置3min ；
(11)、将步骤(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min后取出；
(12)、将步骤(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷冻离心机中，4°C, 12000r/min,离心2min ；
(13)、将离心之后的上清液取出，存于0.2ml的Eppendoff管中；
(14)、利用琼脂糖凝胶电泳法对重组的发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒和未经过转化的原种发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行区分；
(15)、将步骤(14)中鉴定成功的重组发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行PCR检测，准确地鉴别阳性克隆。
权利要求
1.一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，其特征在于该重组农杆菌质粒快速鉴定方法包括以下步骤 (1)、将质粒PCAMBIA1302转化进入发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株后；通过涂布培养的方法，在超净工作台中，将转化后的菌液涂布在携带kan抗性的固体LB培养基的培养皿上，将培养皿用封口膜封好，保证无菌条件，将培养皿放在.26. 5 0C，黑暗条件下培养1-2天； (2)、定时观察涂布培养后培养皿中的菌落生长情况，待转化后菌落生长到2-3mm时，挑取独立生长的菌落进行摇瓶培养； (3)、取50ml的三角烧瓶，加入IOml的LB液体培养基和IOul的kan抗生素，用牙签挑取I个独立生长的菌落加入到三角瓶中，在恒温振荡摇床中，26. 5°C，160r/min，摇瓶培养过夜； (4)、取出摇瓶，取用Iml菌液，用分光光度计在波长为600nm时测定菌液的OD值，当菌液的0D600为I. 0-1. 2时，进行重组质粒的提取和鉴定； (5)、在超净工作台中，用移液器取I.5ml菌液加入I. 5ml Eppendoff管中； (6)、在高速冷冻离心机中，4°C,12000r/min,离心2min ； (7)、离心之后,将I.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液，将I. 5ml Eppendoff管倒扣在无菌滤纸上吸干I. 5ml Eppendoff管中的残留液体； (8)、向1.5ml Eppendoff 管加入 IOul 悬浮液(葡萄糖 50mmol/L ;Tris-Hcl (PH8. 0)25mmol/L; RNaSeA 0. 2mg/ml)用移液器反复抽吸混匀，并用涡轮混合仪充分混匀； (9)、向步骤(8)的I.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶(5mg/ml),用移液器反复抽吸混匀； (10)、将步骤(9)的I.5ml Eppendoff管在室温条件下,放置3min ； (11)、将步骤(10)的1.5mlEppendoff管放入沸水中2min后取出； (12)、将步骤(11)的I.5ml Eppendoff管在高速冷冻离心机中，4°C, 12000r/min,离心.2min ； (13)、将离心之后的上清液取出，存于0.2ml的Eppendoff管中； (14)、利用琼脂糖凝胶电泳法对重组的发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒和未经过转化的原种发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行区分； (15)、将步骤(14)中鉴定成功的重组发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行PCR检测，准确地鉴别阳性克隆。
2.根据权利要求I所述的一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，其特征在于所述的材料包括 (1)、菌种发根农杆菌A4菌株、15834菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)、根癌农杆菌GV3101菌株(吉林师范大学遗传生理研究所实验室保存)； (2)、质粒pCAMBIA1302(kan抗性)(购自澳大利亚pCAMBIA公司)。
全文摘要
本发明涉及一种农杆菌的鉴定方法，具体的说是一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，可以直接应用于科学研究领域。该鉴定方法包括以下步骤将质粒通过热激法或电击转化法转入农杆菌，经过携带抗生素的固体培养基的涂布培养得到单菌落，挑取单菌落，摇瓶培养，至OD600=1.0-1.2之间，离心，收集菌体，加悬浮液，混匀，加溶菌酶，煮沸1-3min,离心，琼脂糖凝胶电泳法对重组质粒和空载进行区分，PCR检测，鉴别阳性克隆。
文档编号C12Q1/68GK102732604SQ20111009463
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者勾畅, 周晓馥, 未晓巍 申请人:吉林师范大学