用于在线虫中测试的化合物-载体系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及增加线虫吸收化合物的方法，主要但不是唯一的专注于线虫秀丽隐杆 线虫（C.elegans)。特别地，本发明涉及聚合物的和/或脂质的递送系统的设计，所述递送 系统表达特异性分子标记（tag)，所述标记的特点有利于蠕虫摄食复杂的"化合物-载体系 统"。
【背景技术】
[0002] 秀丽隐杆线虫（C. elegans)是天然存在于土壤环境中的独立生存的线虫。它在约 3天中，经过4个幼虫阶段（LI至L4)，从胚胎快速生长为约Imm长直径80μπι的成体。成 体为99. 5%的雌雄同体，并伴有由发育缺陷所引起的偶然的雄性个体。每个自体受精的雌 雄同体一次可生产300只幼虫。成熟的个体包含恒定数量的体细胞（在成年的雌雄同体中 959个，在成年的雄性中1031个），所述体细胞概括了最主要的组织类型，包括表皮、肌肉、 神经元、肠和有性繁殖系统。值得注意的是，秀丽隐杆线虫基因组全序列分析表明60-80% 的线虫基因有人类相对物，而且在人类和秀丽隐杆线虫之间大多数的主要生化途径是保守 的。特别地，线虫中涉及生物异型生物质解毒作用（xenobiotic detoxification)和氧化应 激反应的途径与哺乳动物系统的途径非常相似（Voorhies 2002 ;Lindblom和Dodd 2006)。 也报导了懦虫线粒体的结构和生物能量学（bioenergetics)与人类相对物之间的高度保 守性（Tsang 和 Lemire 2003) 〇
[0003] 在实验室条件下秀丽隐杆线虫可以在含有细菌，通常为大肠杆菌（E. coli)的固 体或液体介质上容易地生长。它的遗传易处理性允许大型突变株文库的建立（大多数株可 在秀丽隐杆线虫遗传中心，明尼苏达获得）。通过RNA干扰（RNA interference)的选择性 基因敲除也可以通过注射、饲喂或浸泡容易地进行。此外，蠕虫透明度对于直接或通过荧光 标记物观察活的蠕虫是明显的优势。
[0004] 总的来说，秀丽隐杆线虫的身体特性使其成为生物学研究中有吸引力的生物 体，而且线虫从20世纪60年代起已作为模型生物体被引入。特别地，它极大地促进了 我们对于神经活动（neuroactivity)、衰老、凋亡、胚胎发育和甚至一些人类疾病的机理 的理解（Brenner 1974 ;Kuwabara 和 0' Neil 2001 ;Gershon 和 Gershon 2002 ;Putcha 和 Johnson 2004 ;Sengupta和Samuel 2009)。到20世纪90年代，秀丽隐杆线虫在药物发现 和毒理学方面进一步受到关注，并成为哺乳动物毒性评估的有前景的模型。当评估杀虫剂 (Cole, Anderson 等人 2004)、金属（Roh, Lee 等人 2006)、线粒体干扰物（lshiguro, Yasuda 等人 2001 ;Braungart, Gerlach 等人 2004)或 EGFR 激酶抑制剂（Dengg 和 van Meel 2004) 对秀丽隐杆线虫生存的影响时，其显示了蠕虫中的EC50值与啮齿动物中的LD50值高度相 关。
[0005] 为了研究异型生物质对秀丽隐杆线虫中的影响，待测试的化合物通常溶解于线虫 生长基质中或倒在用作食物的细菌上。然而，近期Burns等人测试了商业可获得的类药分 子在懦虫中的生物积累（bioaccumulation)，并证明来自Spectrum文库的超过1000个分子 中的10%以下容易积累（Burns, Wallace等人2010)。线虫对大部分异型生物质的抵抗可以 根据秀丽隐杆线虫的进食行为来解释，该行为倾向于限制溶液的摄食。由于其生活在土壤 中，线虫发展出多种对抗有害物质潜在进入的保护系统。线虫被厚的表皮包围，该表皮阻挡 了大部分分子的额外经口进入。此外，它像过滤给食器（filter-feeder) -样发挥作用：当 食物被吸收时，液体被吐出而颗粒被保留、粉碎并进入肠（Avery和Shtonda 2003)。因此， 大部分对秀丽隐杆线虫起作用的测试分子可能导致在蠕虫中没有响应，只因为它们几乎没 有被吸收，因而在线虫内不能积累到有效浓度。
[0006] 为了克服这些生理屏障，一般的实验策略依赖于以高浓度的物质孵育秀丽隐杆线 虫。然而，这种方法有主要缺点。其需要大量化合物，这些化合物因技术上或经济上的原因 可能无法获得。此外，使用这样的浓度可能会诱导归因于秀丽隐杆线虫解毒效应器的压垮 或非特异性相互作用的非期望的作用。
[0007] 促进异型生物质被蠕虫吸收且不增加物质浓度的一个策略是增加线虫渗透性，例 如通过触发构成型咽部抽动（constitutive pharyngeal pumping)。咽部抽动是线虫吸 收液体然后将其吐出所通过的过程。通过位于咽的肌肉进行咽部抽动，所述肌肉的收缩 由一组咽神经元控制。由于抽动主要在食物存在下发生，诱导构成型咽部抽动可以有利 于分子吸收。可以通过产生表现抽动调节缺陷的突变或转基因线虫来实现（参见专利WO 00/63425 了解更多信息）。
[0008] 然而，基于扰乱蠕虫摄食行为的策略可能会出现显著的缺点，尤其是在药物发现 和毒理学的情况下。经典地，药效或毒性的评估部分依赖于行为改变的分析，包括食物吸收 中的变化。修改线虫的能力以摄食和积累一种物质可能因此导致该分子的作用机制的曲 解。
[0009] Shibamura等人开发了另一种方法以促进亲水抗氧化剂的吸收。他们指出，包 封于脂质体中的分子比通过传统方法施用的药物更加有效地增加了秀丽隐杆线虫的寿命 (Shibamura, Ikeda 等人 2〇〇9) 〇
[0010] 因此，没有报导在基于线虫的测试中使用的方法，所述方法独立地从物质的分子 结构和物理化学性质入手，触发蠕虫对任何分子的吸收。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及用于经口施用至线虫的化合物载体系统的设计和用途，其避免了高浓 度的使用并增加蠕虫的摄食。
[0012] 秀丽隐杆线虫是本发明优选的线虫，因为其是生物学中的传统模式生物体。然而， 本文描述的系统也可以在其他线虫物种中使用，特别强调隐杆线虫属中与秀丽隐杆线虫密 切相关的成员。在本文中考虑野生型以及突变体或转基因线虫。
[0013] 从多年前至今，秀丽隐杆线虫被引入作为生物学研究的有前途的模型生物体，其 允许破解一系列广泛的生物学过程包括衰老、凋亡和发育之下的机理的显著进步。然而，线 虫有一些限制可能阻碍其用于药物开发的目的。一个主要缺点可能涉及其对大多数化合物 的高不渗透性。
[0014] 如本文所用，术语"测试"是指设计用来评估任何分子在蠕虫中的影响的任何过 程。例如，其涵盖基于表型改变的评价的测试，包括但不限于生存、生育、生长、运动或摄食 行为，也涵盖在细胞和分子水平上对干扰的分析，包括但不限于酶活性的改变、基因或蛋白 质的表达和调节、细胞死亡的诱导、炎症和氧化应激、呼吸链功能的改变、能量状态和DNA 修复系统。
[0015] 在本发明的上下文中，术语"化合物"（或感兴趣的化合物）、"物质"和"异型生物 质"被不加区别地使用，指的是非蠕虫正常产生的外源分子，但是可以在其环境中或在天然 或实验条件中发现。例如，化合物可以涉及化学物质，例如具有已知药理活性的小的有机分 子。此外，所述化合物可以指肽或核酸分子、食糖（sugar)或糖（saccharide)(也包含多 糖）、脂质、有机或无机化合物、天然物质、污染物、溶解的或蒸气气体、药物（包含来自制药 工业的命中物（hits)和先导物（leads))、在化妆品组合物中使用的物质、食品、水、饮料、 来自污水处理厂的洗脱液（eluents)、存在于可注射组合物中的潜在致热源物质、透析水、 存在于涂料中的物质等。
[0016] 为了理解为什么大多数化合物不被线虫吸收，需要考虑到其摄食行为。秀丽隐杆 线虫是以土壤细菌为食的蠕虫，具有区分一系列广泛的食物来源中的有益和有害细菌的能 力（Shtonda和Avery 2006 ;Abada, Sung等人2009)。它发展了有效的化学感应系统，这 允许它探测细菌分泌的化学物质，然后通过梯度优选地指向高品质的食物。这些诱导物 (attractant)/排斥物（repellant)线索是不同来源的，例如cAMP、生物素、碱金属离子、苯 甲醛、十二烷基硫酸钠、庚醇（Riddle, Blumenthal等人1997)。一旦线虫足够接近它的食物 源，它通过咽部抽动吸收食物：咽肌收缩引导细菌颗粒进入肠，而将液体吐出。
[0017] 因此，本文中描述了载体系统的制备，所述载体系统在其表面表达对秀丽隐杆线 虫具有引诱作用的特异性分子实体。
[0018] 因此，本发明涉及用于诱导线虫摄取感兴趣的化合物的载体系统，其包含能捕 获（entrap)所述化合物的囊泡，其中所述囊泡的表面上存在对所述线虫有化学吸引力的 (chemo-attractive)标记物质。在优选的实施方案中，所述载体系统含有在其表面包含所 述有化学吸引力的标记物质的所述囊泡，并且包含捕获于所述囊泡中的所述感兴趣的化合 物。因此，在这个实施方案中，所述载体系统不包含表面上存在所述标记物质的空囊泡。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述标记物质共价连接于所述囊泡的表面。
[0020] JP03112924、US20070092558、Kojima(Biomed Microdevices，2012, 14:1027-1032)描述了表面用物质修饰的脂质体，但没有提示其作为 载体用于喂给线虫感兴趣的测试物质。
[0021] 被线虫吸收的载体系统
[0022] 如下文使用的，术语"标记"（或标记物质）是指有利于载体被线虫吸收的分子实 体。优选地，所述标记对线虫是有化学吸引力的。
[0023] 如本文中所预期的，"有化学吸引力的试剂"是化学试剂，其通过趋化性 (chemotaxis)诱导线虫向其最高浓度的方向移动。确定标记物质对秀丽隐杆线虫的化学吸 引力所需的趋化性试验是本领域公知的且描述于现有技术中，例如Jansen等人所描述的 (EMBO Journal, Vol. 21Νο· 5ρρ· 986-994, 2002)，其也引用了涉及这个试验的其他文献。因 此，已通过任何趋化性试验单独地证明对蠕虫是有化学吸引力的任何物质，可以被用作标 记用来实施本发明。
[0024] 对水溶性化合物的趋化性可以通过以下方法评估：简而言之，一部分四象限陪替 氏平皿（four-quadrant Petri plates)的相反象限用缓冲的琼脂填充，所述琼脂包含推定 的（putative)溶解的诱导物或没有诱导物。相邻象限由一薄层熔化的琼脂连接。良好喂 养的、年轻的成年线虫群体用缓冲液洗涤，并将100-200只蠕虫放置于四个象限的交点。在 一段时间后确定蠕虫在四个象限的分布。可以在每个时间点计算趋化性指数[Cl = (A-C)/ A+C ;其中A是1和3象限的蠕虫数量，C是2和4象限的蠕虫数量]。
[0025] 在本发明的上下文中，术语"捕获"，如在"捕获的化合物"中，用于指被包封、吸收 或分散于囊泡中的化合物，或嵌入于囊泡的层中的化合物。
[0026] 术语"囊泡"和"载体"是指具有储存物质的能力的分子或超分子系统。这些结 构包含但不限于胶束（micelles)、脂质体、聚合物囊泡、微和纳米颗粒。它们也包含菌蜕 (bacterial ghosts)和病毒载体，所述菌銳和病毒载体分别存在于革兰氏阴性菌的无细胞 质细胞被膜和病毒中。
[0027] 到目前为止，化合物载体已被证明在化妆品、诊断和治疗领域，特别是成像和癌症 治疗中是有帮助的，用于口服或经皮递送一系列广泛的分子，包括但不限于异型生物质、肽 或蛋白质、以及核苷酸序列，特别是DNA和SiRNA。它们显示特别是通过允许控制释放和位 置特异性递送而大幅提高药物生物利用度和降低不良反应（Barratt 2003)。
[0028] 在本发明的上下文中，表述"超分子系统"涉及通过非共价或共价键或通过两者结 合在一起的分子复合物。这些分子包括但不限于脂质、蛋白质、低聚糖以及合成或天然聚合 物，并且可以组装为各种形状，例如球状、圆柱状或棒状。它们的尺寸范围为纳米至微米。
[0029] 术语"胶束"是指胶态分散体（colloidal dispersion)，所述胶态分散体包含形成 闭合单层的两亲分子聚集体。在水性溶剂中，分子的亲水头部指向周围的溶剂，而疏水尾部 被隔离在胶束的中心。
[0030] 如下文所使用的，术语"脂质体"是指微米范围的人造囊泡，所述囊泡的膜由包裹 水性核心的脂质双分子层或系列脂质双分子层组成。双分子层也可以包含具有脂质部分的 大分子，例如脂聚糖（Iipoglycans)或脂蛋白，以及非脂质的亲脂性或两亲分子，包括但不 限于蛋白质、糖蛋白、聚合物或低聚糖。脂质体可以包封电离的或未电离的、极性或非极性 的、有光学特性如荧光的、疏水性和亲水性化合物，以及肽序列和核苷酸质粒。
[0031] 术语"脂质"应理解为包含：天然存在的脂质类的所有类别，即，脂肪酸、甘油脂、甾 醇衍生物、甘油磷脂和鞘脂，等等。
[0032] "聚合物囊泡"，或"基于聚合物的脂质体"是指合成的囊泡，所述囊泡的膜由两亲 性嵌段共聚物组成。术语"共聚物"是指从几种不同的单体种类衍生的聚合物，