一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其制备方法
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其制备方法。该药物运载控释系统具有三层核壳结构，内层为载药的介孔硅纳米粒子，中间层为叶酸修饰的叠氮化壳聚糖，外层为聚乙二醇。该药物运载控释系统的制备方法包括如下步骤：巯基功能化介孔硅纳米粒子的制备；双硫功能化；炔基修饰；去除模板；叶酸修饰的叠氮化壳聚糖的制备；壳聚糖包裹；PEG修饰等。与现有技术相比，其以壳聚糖作为“阀门”材料，价廉、易得、生物相容性好；PEG通过pH敏感的亚胺键接枝在CHI表面，使该药物运载控释系统可以在正常血液循环中“隐形”、在肿瘤部位脱除PEG裸露出靶向配体叶酸，从而“激活”该系统对癌细胞的主动靶向能力。
【专利说明】
一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其制备 方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释 系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在癌症治疗中，传统的药物疗法因缺乏靶向性，往往会导致药物利用率不高和毒 副作用严重。而且肿瘤组织和正常组织间存在一些差异，利用这些差异可以设计药物载体 来克服传统癌症的治疗的缺陷。
[0003] 在目前被广泛研究的药物载体中，介孔硅纳米粒子(MSN)的载体系统具备优异的 性能，MSN的诸多优点：良好的生物相容性、大的比表面积及孔隙体积可以装载大量药物、良 好的表面改性能力使其具有修饰各种功能基团的潜力。此外，制备MSN的手段丰富以及成 熟、方法简单，MSN的形状、尺寸、孔隙大小在一定范围内都可以较好的控制。这些特点赋予 了 MSN载体系统良好的应用前景:其百纳米级的尺寸满足"被动靶向"的需求;通过在其表面 修饰不同刺激响应性的"阀门"可以赋予其不同的药物控释能力，且可以实现"零提前释 放"。显然，功能化"阀门"的设计对于MSN载体而言至关重要。"阀门"赋予了载体控释能力， 而且通过对"阀门"的改性可以使载体获得诸如"荧光成像"、"主动靶向"等功能。
[0004] 许多不同类型的"阀门"已经被用于MSN载体中。常见的"阀门"包括各类超分子系 统、金属纳米粒子、脂质体、蛋白质、DNA和天然多糖等。从药物控释的角度出发，这些载体设 计精巧、性能出色。但是从实际应用的前景出发，"阀门"材料的选择应当从生物相容性、控 释效果、来源是否广泛、合成或改性的难度以及经济成本等方面综合考虑。由此，种类繁多、 廉价易得、生物相容性好的天然多糖是一个不错的选择。天然多糖来源非常丰富，较易从动 植物体内提取，并且很多已实现工业化生产;富含羟基、羧基、氨基等基团便于化学改性，在 生物材料领域应用非常广泛。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的为提供一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其制备 方法，该系统具有运载药物并控制药物在肿瘤组织处释放的能力，可做到药物在正常组织 处零释放，有效提高药物利用率并降低其毒副作用。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运 载控释系统，具有三层核壳结构，其特征在于，内层为载药的介孔硅纳米粒子，中间层为叶 酸修饰的叠氮化壳聚糖，外层为聚乙二醇。
[0007] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的优选方案。
[0008] 进一步，所述介孔娃纳米粒子与所述叶酸修饰的叠氮化壳聚糖通过双硫键连接， 所述叶酸修饰的叠氮化壳聚糖与所述聚乙二醇通过亚胺键连接。
[0009] 优选的，所述介孔娃纳米粒子为疏基功能化介孔娃纳米粒子，其粒径为80-120nm。
[0010] 优选的，所述壳聚糖的分子量在30000以下、3500以上。
[0011]优选的，所述聚乙二醇为醛基化聚乙二醇，其重均分子量为1900。
[0012] 本发明还提供一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方法，其包 括如下步骤：
[0013] SI.包含模板CTAB的巯基功能化介孔硅纳米粒子(CTAB0MSN-SH)的制备；
[0014] S2.双硫功能化介孔硅纳米粒子（Ctabomsn-SS-NH2)的制备：将步骤si制得的 CTABiMSN-SH加入溶剂中并充分分散，CTABiMSN-SH与溶剂的用量比为600mg: 120-150mL，继 续加入与(^六8關5^5!1等质量的8-(2-氨乙巯基）-2-巯基吡啶盐酸盐（5-(2-aminoethylthio)-2_thiopyridine hydrochloride)并充分揽摔，反应于室温下进行24h， 离心并用水和甲醇清洗数次，真空干燥，即得；
[0015] S3.炔基修饰的介孔硅纳米粒子(CTABiMSN-SS-alkyne)的制备:将步骤S2制得的 CTABiMSN-SS-NH2加入溶剂中并充分分散，CTABiMSN-SS-NH2与溶剂的用量比为450mg :80-120mL，加入适量溴丙炔并搅拌混合，CTABiMSN-SS-NH2与溴丙炔的用量比为450mg: 3-4mL， 反应于室温下进行24h，离心并用水和甲醇清洗数次，真空干燥，即得；
[0016] S4.去除模板CTAB的介孔硅纳米粒子(MSN-SS-alkyne)的制备:将步骤S3制得的 CTABiMSN-SS-al kyne加入甲醇与浓盐酸的混合溶液中，CTABiMSN-SS-a I kyne与混合溶液的 用量比为500mg:80-100mL，混合溶液由浓盐酸和甲醇按体积比为1:15-20混合而成，回流 48h，然后用水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥，即得；
[0017] S5.叶酸修饰的叠氮化壳聚糖(N3-CHI-FA)的制备:将N3CH2COOH和CHI溶解在适量 水中，N3CH2COOH、CHI和水的用量比为180mg: 1400-1500mg: IOOmU加入适量EDC · HCl后室温 下搅拌活化24h，再加入适量FA室温避光下剧烈搅拌24h，其中EDC · HCUFA与N3CH2COOH的质 量之比为480:200:180，反应结束后抽滤不溶物质并将滤液用分子量3500的透析袋透析，冷 冻干燥，即得；
[0018] S6.壳聚糖包裹的载药介孔硅纳米粒子的制备(D0X麵SN-SS-CHI-FA):将步骤S4制 得的MSN-SS-aIkyne加入甲醇与水的混合液中并充分分散，甲醇与水的体积比为1:4-5， MSN-SS-alkyne与混合液的用量比为200mg:20-25mL，加入适量盐酸阿霉素(D0X · HC1)，室 温下剧烈搅拌24h，然后加入叶酸修饰的叠氮化壳聚糖、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠，叶酸 修饰的叠氮化壳聚糖和五水硫酸铜的质量均与MSN-SS-alkyne质量相等，DOX · HCl与MSN-SS-alkyne质量比为1:4,抗坏血酸钠与MSN-SS-alkyne的质量比为1.7:1，反应在氮气保护 和室温下反应3天，离心并用水和甲醇清洗数次，真空干燥，即得；
[0019] S7.具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统(DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG)的制 备:将S5制备的DOX麵SN-SS-CHI-FA与等质量的醛基化聚乙二醇加入pH=7.4的PBS溶液中 并充分分散，DOXiMSN-SS-alkyne与PBS溶液的用量比为200mg:50mL，室温下搅拌反应24h， 然后用水多次超声洗涤，冷冻干燥后，即得。
[0020] 整个制备过程的反应路线如下所示：
[0021]
[0022] 进一步，步骤SI的CTABiMSN-SH为包含模板CTAB的MCM-41型巯基功能化介孔硅纳 米粒子。
[0023]具体的，步骤S2与S3中的所述溶剂为甲醇或乙醇，步骤S4中使用的浓盐酸的质量 分数为37 %。
[0024]优选的，步骤S7中使用的醛基化聚乙二醇的制备方法如下：将重均分子量为1900 的带有端氨基的聚乙二醇溶解在干燥的二氯甲烷中，继续加入适量对醛基苯甲酸、二环己 基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，其中带有端氨基的聚乙二醇、对醛基苯甲酸、二环己基碳二 亚胺、4-二甲氨基吡啶与二氯甲烷的用量比为5.0g :3.0g:4.2g:0.32g:150mL，室温下反应 24h，过滤，滤液旋蒸得白色粉末，白色粉末加水溶解后用二氯甲烷多次萃取，萃取时有机层 加无水硫酸钠除水，最后用冷乙醚沉淀，即得。
[0025] 与现有技术相比，本发明提供的具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统及其 制备方法的优点为：
[0026] 1)、采用百纳米尺寸的MSN作为抗癌药物的纳米存储器，赋予载体"被动祀向"的能 力，同时也利用其具有良好生物相容性、大的比表面积及孔隙体积可以装载大量药物的特 点。
[0027] 2)、选用壳聚糖（CHI)作为"阀门"材料，以分子链覆盖的方式包覆在MSN的表面， CHI来源丰富，是地球上产量第二大的天然高分子材料，作为唯一的碱性天然多糖，CHI富含 的氨基不仅可以用于改性，也能因其所带正电荷帮助载体粘附并穿透细胞膜进入癌细胞， 同时对比其他合成聚阳离子，CHI的生物相容性更加优秀。
[0028] 3)、以氧化-还原敏感的双硫键连接MSN及CHI以实现癌细胞内释药，载体进入癌细 胞后，在细胞内还原环境（因GSH作用）下双硫键断开，包覆在载体表面的CHI脱落，从而释放 药物;在进入肿瘤细胞前，体内的氧化环境能保证双硫键的稳定，保证药物不会被提前释 放。
[0029] 4)、叶酸(FA)是一种广泛分布的水溶性维生素。叶酸分子结构简单，分子中含有羧 基活性高特别容易发生酰胺反应。因此，大多数情况下通过酰胺反应将叶酸分子引入药物 载体使其产生靶向性。从而像发射"导弹"精准地将药物载体靶向到肿瘤细胞。在某些肿瘤 细胞的表面含有过度表达的叶酸受体。本发明的"阀门"材料壳聚糖(CHI)的表面接枝有叶 酸(FA)，其可与肿瘤细胞的叶酸受体特异性结合，从而使本发明提供的药物载运控释系统 更容易与肿瘤细胞的亲和，增加了"肿瘤引发靶向"能力。
[0030] 5 )、将苯甲醛封端的带有端氨基的聚乙二醇(mPEG)通过pH敏感的亚胺键接枝在 CHI表面，赋予载体"肿瘤引发靶向"的能力，通过亚胺键连接PEG的保护可以保证胶束载体 在正常的血液循环中"隐形"，以拥有足够的循环时间在肿瘤部位通过"被动靶向"富集，当 载体到达肿瘤组织时，低的pH使亚胺键断裂，PEG保护层脱落裸露出叶酸，配体的靶向FA能 力被"激活"。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明提供的具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的药物装置及控 释过程的示意图；
[0032] 图2为巯基功能化的介孔纳米粒子(MSN-SH)的TEM图；
[0033]图3为实施例1制备的具有肿瘤引发发靶向能力的药物运载控释系统（DOX^SN-SS-CHI-FA-PEG)的 TEM 图；
[0034] 图4为实施例1制备的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在pH=6.5条件下的Zeta电位随浸 泡时间变化关系图；
[0035] 图5为实施例1制备的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同浓度GSH还原条件下DOX药物 的释放情况。
[0036] 图6为实施例1制备的D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)、不同DOX浓度 条件下与人类宫颈癌(HeLa)细胞共培养后HeLa细胞的存活率。
[0037] 图7为实施例1制备的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)条件下与HeLa 细胞共培养后D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG进入细胞的情况。测试结果经流式细胞仪获得，以相 对荧光强度(MFI)为标准计。
【具体实施方式】
[0038] 以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解 释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0039] 本发明提供一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，具有三层核壳结 构，内层为载药的介孔硅纳米粒子，中间层为叶酸修饰的壳聚糖，外层为聚乙二醇。其中，所 述介孔娃纳米粒子(MSN)与所述叶酸修饰的壳聚糖通过双硫键连接，双硫键的一端与介孔 硅纳米粒子(MSN)连接，另一端与小分子连接，小分子再通过化学键与叶酸修饰的壳聚糖连 接，所述叶酸修饰的壳聚糖与所述聚乙二醇通过亚胺键连接，具体结构及载药和控释过程 如图1所示。
[0040] 本发明所用到的方法中未作特殊说明，则均为常规方法，如无特殊规定，均为市售 产品。
[0041 ]以下实施例中使用的包含模板CT AB的巯基功能化介孔硅纳米粒子(CTAB0MSN-SH)，可使用市售产品，也可按照现有技术自行制备:先将NaOH(0.28g)与CTAB(I.Og)溶解在 480mL二次水中并升温至80°C，然后将TE0S(5mL)缓慢逐滴滴加至体系中，20分钟后继续向 体系中滴加MPTMS(0.97mL)，再继续搅拌2h，产生白色沉淀物，反应结束后将产物离心出来 并用去离子水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥后便得到包含模板CTAB的介孔硅纳米颗粒 (CTAB0MSN-SH)，所述CTAB0MSN-SH的TEM如图 2所示。
[0042]以下实施例中使用的醛基化聚乙二醇（mTOG-CHO)，可通过下述方法自行制备： 5. Og mPEG(Mw = 1900Da，2.6mmo 1)溶解在150mL干燥后的二氯甲烷中。加入3. Og对醛基苯甲 酸，4.2g DCC和0.32g的DMAP在室温下反应24h。反应结束后过滤，滤液的溶剂旋蒸获得的白 色粉末溶在50mL去离子水中。再用二氯甲烷萃取6次（100毫升X6)，有机层加入无水Na2SO4 干燥，最后通过200mL的冷乙醚沉淀得到白色固体mPEG-CHO。
[0043] 以下通过本发明提供的方法制备具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统。
[0044] 实施例1
[0045] 取600mg上述制备出的CTABiMSN-SH分散于135mL甲醇中，超声使其分散均匀。然后 加入600mg s-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐并剧烈搅拌，反应于室温下进行24h。离心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后得到包含模板CTAB的双硫 功能化介孔硅纳米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0046] 取450mg上述制备出的CTABiMSN-SS-NH2分散于IOOmL甲醇中，超声使其分散均匀。 然后加入3mL溴丙炔，反应于室温下进行24h。离心（10,000r/minX IOmin)并用二次水和甲 醇清洗数次，真空干燥后得到含有CTAB的炔基修饰的双硫功能化介孔硅纳米颗粒(CTAB0 MSN-SS-alkyne)〇
[0047] 为了去除模板CTAB，取0 · 5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有4 · 5mL浓盐 酸的甲醇(SOmL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥后得到MSN-SS-alkyne〇
[0048] 叶酸修饰的叠氮化壳聚糖(N3-CHI-FA)的制备，先将180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去离子水中，加入0.48gEDC·HCl后室温下搅拌活化24h，再加入200mgFA室 温避光下剧烈搅拌24h，反应结束后抽滤不溶物质并将滤液用分子量3500的透析袋透析，冷 冻干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0049] 取200mg上述制备出的MSN-SS-alkyne分散于5mL甲醇与20mL去离子水的混合溶液 中，超声分散均匀后，加入50mg盐酸阿霉素(D0X · HC1)，并将反应混合物在室温下剧烈搅拌 24h。然后加入200mg上述制备出的N3-CHI-FA、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗坏血酸钠，反 应在氮气氛围保护下与室温反应3天。经过离心并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后得 到壳聚糖包裹的载药介孔硅纳米粒子(D0X0MSN-SS-CHI-FA)
[0050]取200mg上述制备的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超声分散在50mL pH = 7.4的PBS中，室温下搅拌24h。然后用二次水超声多次洗涤，冷冻干燥后得到具有肿瘤引发 靶向能力的药物运载控释系统(DOXiMSN-SS-CHI -FA-PEG )，制备出的DOXiMSN-SS-CHI -FA-PEG的TEM图像如图3所示。
[0051 ] 实施例2
[0052] 取600mg上述制备出的CTABiMSN-SH分散于120mL甲醇中，超声使其分散均匀。然后 加入600mgs-(2-氨乙巯基）-2-巯基吡啶盐酸盐并剧烈搅拌，反应于室温下进行24h。离心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后得到包含模板CTAB的双硫 功能化介孔硅纳米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0053] 取450mg上述制备出的CTABiMSN-SS-NH2分散于80mL甲醇中，超声使其分散均匀。 然后加入3mL溴丙炔，反应于室温下进行24h。离心（10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇 清洗数次，真空干燥后得到含有表面活性剂的炔基修饰的双硫功能化介孔硅纳米颗粒 (CTABiMSN-SS-alkyne)。
[0054] 为了去除模板CTAB，取0 · 5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有4 · 5mL浓盐 酸的甲醇（67.5mL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥后得到MSN- SS-alkyne〇
[0055] 叶酸修饰的叠氮化壳聚糖(N3-CHI-FA)的制备，先将180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去离子水中，加入0.48gEDC·HCl后室温下搅拌活化24h，再加入200mgFA室 温避光下剧烈搅拌24h，反应结束后抽滤不溶物质并将滤液用分子量3500的透析袋透析，冷 冻干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0056] 取200mg上述制备出的MSN-SS-alkyne分散于4.2mL甲醇与21mL去离子水的混合溶 液中，超声分散均匀后，加入50mg盐酸阿霉素(D0X · HC1)，并将反应混合物在室温下剧烈搅 拌24h。然后加入200mg上述制备出的FA-CHI-N3、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗坏血酸钠， 反应在氮气氛围保护下与室温反应3天。经过离心并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后 得到壳聚糖包裹的载药介孔硅纳米粒子(D0X0MSN-SS-CHI-FA)
[0057] 取200mg上述制备的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超声分散在50mL pH = 7.4的PBS溶液中，室温下搅拌24h。然后用二次水超声多次洗涤，冷冻干燥后得到具有肿瘤 引发靶向能力的药物运载控释系统(D0X0MSN-SS-CHI-FA-PEG).
[0058] 实施例3
[0059] 取600mg上述制备出的CTABiMSN-SH分散于150mL甲醇中，超声使其分散均匀。然后 加入600mgs-(2-氨乙巯基）-2-巯基吡啶盐酸盐并剧烈搅拌，反应于室温下进行24h。离心 (10000r/min X IOmin)并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后得到包含模板CTAB的双硫 功能化介孔硅纳米粒子(Ctabomsn-SS-NH 2 )。
[0060] 取450mg上述制备出的CTABiMSN-SS-NH2分散于120mL甲醇中，超声使其分散均匀。 然后加4mL溴丙炔，反应于室温下进行24h。离心（10000r/minX IOmin)并用二次水和甲醇清 洗数次，真空干燥后得到含有表面活性剂的炔基修饰的双硫功能化介孔硅纳米颗粒(CTAB0 MSN-SS-alkyne)〇
[0061 ] 为了去除模板CTAB，取0.5g上述得到的CTABiMSN-SS-alkyne在包含有5mL浓盐酸 的甲醇（95mL)中回流48h，然后用二次水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥后得到MSN-SS-alkyne。
[0062] 叶酸修饰的叠氮化壳聚糖(N3-CHI-FA)的制备，先将180mg N3CH2COOH和1.43g CHI 溶解在100mL去离子水中，加入0.48gEDC·HCl后室温下搅拌活化24h，再加入200mgFA室 温避光下剧烈搅拌24h，反应结束后抽滤不溶物质并将滤液用分子量3500的透析袋透析，冷 冻干燥，即得N 3-CHI-FA。
[0063] 取200mg上述制备出的MSN-SS-alkyne分散于4mL甲醇与16.5mL去离子水的混合溶 液中，超声分散均匀后，加入50mg盐酸阿霉素(D0X · HC1)，并将反应混合物在室温下剧烈搅 拌24h。然后加入200mg上述制备出的FA-CHI-N3、200mg CuS〇4 · 5H20以及340mg抗坏血酸钠， 反应在氮气氛围保护下与室温反应3天。经过离心并用二次水和甲醇清洗数次，真空干燥后 得到壳聚糖包裹的载药介孔硅纳米粒子(DOXOMSN-SS-CHI-FA)
[0064] 取200mg上述制备的mPEG-CHO和200mg DOXiMSN-SS-CHI-FA超声分散在50mL pH = 7.4的PBS中，室温下搅拌24h。然后用二次水超声多次洗涤，冷冻干燥后得到具有肿瘤引发 靶向能力的药物运载控释系统(DOXOMSN-SS-CHI-FA-PEG)。
[0065] 测试例
[0066] 以实施例1制备出的终产物DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG为检测对象，37°C在pH = 6.5 的PBS溶液中检测zeta电位数据，以观察PEG从DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG表面脱离受pH的控 制情况，测试结果如图4所示。图4表明，在pH = 6.5的条件下，随着时间增长，本发明制备的 DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG纳米颗粒的zeta电位明显增加，在30min内升至+15. ImV并保持增 长，在24h内上升到+26 · 8mV，与DOXiMSN-SS-CHI-FA (+27 · 5mV)接近，这表明PEG和CHI间的亚 胺键在弱酸性(pH=6.5)环境下慢慢断裂，PEG慢慢脱离纳米粒子从而裸露出CHI-FA。
[0067] 以实施例1制备出的终产物DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG为检测对象，在含有还原性多 肽GSH的pH=7.4的PBS溶液中检测双硫键断裂，DOX药物释放的情况用紫外光谱进行监测， 试验结果如图5所示。图5表明，在roS = 7.4和不同浓度的GSH溶液中DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG的DOX释放量不同：在没有GSH时，DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子的孔道被CHI通过稳 定的双硫键封堵，因此，120h内DOX释放量小于8 % ;而当GSH的浓度为1mmo 1时，120h内DOX的 释放量超过39% ;当GSH的浓度增加至IOmmol时，药物释放速率大大加快，在24h内DOX释放 量约37%，120h内DOX释放的累积释放约为81 %。药物释放速率随GSH的浓度增加而增加。 GSH在细胞内的浓度比在细胞外高100-1000倍，因此DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子在进 入细胞之前不会释放DOX而在进入细胞后释放药物D0X。
[0068] 以实施例1制备的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG为检测对象测试其对肿瘤细胞的治疗 效果，控制DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG在不同测试标液中的加入量以最终区分出不同的DOX浓 度(假定DOX完全释放）。图6为DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG在不同pH(7.4和6.5)、不同DOX浓度 条件下与HeLa细胞共培养后HeLa细胞的存活率。HeLa细胞的存活率随DOX的浓度增加而降 低。作为对照标准，当PH = 6.5时，当DOX的浓度为8mg/L时，仅仅只有约9.8 %的HeLa细胞的 存活。将适量实施例1制备的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子与HeLa细胞在pH=7.4时共 培养48h后，DOX浓度为1.25mg/L时HeLa细胞的存活率高达约86 %，继续培养至DOX浓度升至 较大（约为8mg/L)时，HeLa细胞的存活率也有约37%。另外，将与上述用量相同的DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子与HeLa细胞在pH = 6.5条件下培养，当DOX浓度达到约为8mg/L时， HeLa细胞的存活率低于10%。这说明了药物载体粒子控释系统可以在正常血液(pH在7.35-7.45之间）循环中"隐形"、在肿瘤部位(弱酸性性和还原环境)脱除PEG裸露出叶酸，从而"激 活"其主动靶向能力，帮助DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG进入肿瘤细胞并最终抑制和杀死肿瘤细 胞。以实施例1制备的终产物DOX麵SN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子为检测对象，利用流式细胞 仪定量分析HeLa细胞对DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG纳米粒子的摄取行为，如图7所示，在pH = 6.5时HeLa细胞摄取的纳米粒子的量明显高于pH=7.4时，其平均荧光强度(MFI)是pH=7.4 时的4.2倍。这些结果证明在pH=6.5时载体粒子脱除保护层PEG从而裸露出靶向叶酸，FA使 载体纳米粒子顺利进入细胞。这也验证了本发明所提出的肿瘤引发靶向能力。
[0069]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，其特征在于，具有三层核壳结构， 内层为载药的介孔硅纳米粒子，中间层为叶酸修饰的叠氮化壳聚糖，外层为聚乙二醇。2. 根据权利要求1所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，其特征在 于，所述介孔娃纳米粒子与所述叶酸修饰的叠氮化壳聚糖通过双硫键连接，所述叶酸修饰 的叠氮化壳聚糖与所述聚乙二醇通过亚胺键连接。3. 根据权利要求1所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，其特征在 于，所述介孔娃纳米粒子为疏基功能化介孔娃纳米粒子，其粒径为80_120nm。4. 根据权利要求1所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，其特征在 于，所述叶酸修饰的叠氮化壳聚糖的分子量在30000以下、3500以上。5. 根据权利要求1所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统，其特征在 于，所述聚乙二醇为醛基化聚乙二醇，其重均分子量为1900。6. -种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤：51. 包含模板CTAB的巯基功能化介孔硅纳米粒子CTAB麵SN-SH的制备；52. 双硫功能化介孔硅纳米粒子CTAB麵SN-SS-NH2的制备:将步骤S1制得的CTAB麵SN-SH 加入溶剂中并充分分散，CTABOMSN-SH与溶剂的用量比为600mg: 120-150mL，继续加入与 CTAB麵SN-SH等质量的s-(2-氨乙巯基)-2-巯基吡啶盐酸盐并充分搅拌，反应于室温下进行 24h，离心并用水和甲醇清洗数次，真空干燥，即得； S3 .炔基修饰的介孔硅纳米粒子CTABiMSN-SS-alkyne的制备：将步骤S2制得的CTABO MSN-SS-NH2加入溶剂中并充分分散，CTABiMSN-SS-NH2与溶剂的用量比为450mg: 80-120mL， 加入适量溴丙炔并搅拌混合，CTAB@MSN-SS-NH2与溴丙炔的用量比为450mg: 3-4mL，反应于 室温下进行24h，离心并用水和甲醇清洗数次，真空干燥，即得；54. 去除模板CTAB的介孔硅纳米粒子MSN-SS-alkyne的制备：将步骤S3制得的CTABO MSN-SS-alkyne加入甲醇与浓盐酸的混合溶液中，CTABiMSN-SS-alkyne与混合溶液的用量 比为500mg:80-100mL，混合溶液由浓盐酸和甲醇按体积比为1:15-20混合而成，回流48h,然 后用水和甲醇超声多次洗涤，冷冻干燥，即得；55. 叶酸修饰的叠氮化壳聚糖N3-CHI-FA的制备：将N3CH2COOH和CHI溶解在适量水中， N3CH2COOH、CHI和水的用量比为180mg:1400-1500mg:100mL，加入适量EDC · HC1后室温下搅 拌活化24h，再加入适量FA室温避光下剧烈搅拌24h，其中EDC · HC1、FA与N3CH2COOH的质量之 比为480: 200:180，反应结束后抽滤不溶物质并将滤液用截留分子量3500的透析袋透析，冷 冻干燥，即得；56. 壳聚糖包裹的载药介孔硅纳米粒子的制备DOXOMSN-SS-CHI-FA:将步骤S4制得的 MSN-SS-a 1 kyne加入甲醇与水的混合液中并充分分散，甲醇与水的体积比为1:4-5，MSN-SS-alkyne与混合液的用量比为200mg: 20-25mL，加入适量盐酸阿霉素，室温下剧烈搅拌24h，然 后加入N3-CHI-FA、五水硫酸铜以及抗坏血酸钠，N3-CHI-FA和五水硫酸铜的质量均与MSN-SS-alkyne质量相等，盐酸阿霉素与MSN-SS-alkyne质量比为1:4,抗坏血酸钠与MSN-SS-alkyne 的质量比为 1.7:1，反应在氮气保护和室温下反应 3 天，离心并用水和甲醇清洗数次， 真空干燥，即得；57. 具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统DOXiMSN-SS-CHI-FA-PEG的制备:将S5 制备的DOX麵SN-SS-CHI-FA与等质量的醛基化聚乙二醇加入pH=7.4的PBS溶液中并充分分 散，DOXiMSN-SS-CHI-FA与PBS溶液的用量比为200mg: 50mL，室温下搅拌反应24h，然后用水 多次超声洗涤，冷冻干燥后，即得。7. 根据权利要求6所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方 法，其特征在于，步骤S1的CTAB麵SN-SH为包含模板CTAB的MCM-41型巯基功能化介孔硅纳米 粒子。8. 根据权利要求6所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方 法，其特征在于，步骤S2与S3中的所述溶剂为甲醇或乙醇。9. 根据权利要求6所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方 法，其特征在于，步骤S4中使用的浓盐酸的质量分数为37%。10. 根据权利要求6所述的一种具有肿瘤引发靶向能力的药物运载控释系统的制备方 法，其特征在于，步骤S7中使用的醛基化聚乙二醇的制备方法如下:将重均分子量为1900的 带有端氨基的聚乙二醇溶解在干燥的二氯甲烷中，继续加入适量对醛基苯甲酸、二环己基 碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，其中带有端氨基的聚乙二醇、对醛基苯甲酸、二环己基碳二亚 胺、4-二甲氨基吡啶与二氯甲烷的用量比为5.(^ :3.(^:4.28:0.328:15〇1^，室温下反应 24h，过滤，滤液旋蒸得白色粉末，白色粉末加水溶解后用二氯甲烷多次萃取，萃取时有机层 加无水硫酸钠除水，最后用冷乙醚沉淀，即得。
【文档编号】A61K31/704GK105963702SQ201610269944
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】李草, 张敏, 江兵兵, 叶海峰, 郭莉, 陈学琴
【申请人】湖北大学