用于调节血管发生和周细胞包裹的基于alk1拮抗剂的方法和组合物的制作方法

用于调节血管发生和周细胞包裹的基于alk1拮抗剂的方法和组合物的制作方法【专利摘要】本发明涉及用于调节血管发生和周细胞包裹的基于ALK1拮抗剂的方法和组合物。在一些方面，本公开内容涉及以下见解，即包含激活蛋白样激酶I(ALK1)多肽细胞外区域之配体结合部分的多肽可用于抑制体内(特别是在患有血管发生相关疾病的哺乳动物中)血管发生。此外，本公开内容证实ALK1的抑制剂可用于提高血管化组织(包括肿瘤和视网膜)的周细胞包裹。本公开内容还鉴定了ALK1的配体，并证实这些配体具有促血管发生活性，同时描述了抑制受体?配体相互作用的抗体。【专利说明】用于调节血管发生和周细胞包裹的基于ALK1拮抗剂的方法和组合物[00011本申请是申请号为2011012000352580的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2009/002699的中国国家阶段申请。[0002]相关申请[0003]根据美国35USC§119法案，本申请要求2008年5月2日提交的美国临时申请61/050，168以及2009年1月12日提交的临时申请61/144,131之申请日的权益，两者内容均通过引用并入本文中。
技术领域：
[0004]本发明涉及用于调节血管发生和周细胞包裹的基于ALKl拮抗剂的方法和组合物。【
背景技术：
】[0005]血管发生是形成新血管的过程，其对于许多正常和异常的生理状态来说是很关键的。在正常的生理状况下，人和动物在特定的和局限的情况下经历血管发生。例如，通常在创伤愈合、胚胎发育以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成中观察到血管发生。[0006]许多疾病中存在不期望的或调节不当的血管发生，其中异常的内皮生长可导致或参与病理过程。例如，血管发生参与许多肿瘤的生长。失调的血管发生涉及到病理过程中，例如类风湿性关节炎、视网膜病、血管瘤和银肩病。已将存在失控之血管发生的各种病理疾病状态归类为血管发生相关疾病。[0007]认为受控和失控的血管发生均以类似方式的进行。毛细血管主要由内皮细胞和周细胞(pericyte)组成，其周围是基膜(basementmembrane)。血管发生开始于由内皮细胞和白细胞释放的酶对基膜的侵蚀。随后，沿血管腔排列的内皮细胞从基膜穿出。血管发生因子诱导内皮细胞穿过被侵蚀的基膜迀移。迀移细胞形成从母血管伸出的"芽"，内皮细胞在此处进行有丝分裂和增殖。内皮细胞芽彼此融合从而形成毛细血管袢，产生新血管。[0008]已证实抑制血管发生的物质可有效治疗多种疾病。阿瓦斯丁(Avastin)?(贝伐单抗(bevacizumab))---种结合血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体--已被证实有效治疗多种癌症。麦可净(Macugen)?---种结合VEGF的适配体(aptamer)--已被证实有效治疗新生血管性(湿性)年龄相关黄斑变性。SDF/CXCR4信号传导途径的拮抗剂抑制肿瘤新血管生成，并有效抗御小鼠模型中的癌症(Guleng等，CancerRes.2005年7月1日；65(13):5864-71)。异香豆素2-(8-羟基-6-甲氧基-1-氧代-1H-2-苯并吡喃-3-基)丙酸(NM-3)作为口服生物可利用的血管发生抑制剂已完成I期临床评估。匪-3在体外直接杀伤内皮细胞和肿瘤细胞，并有效治疗小鼠中的多种人类肿瘤异种移植物（Agata等，CancerChemotherPharmacol·2005年12月；56(6):610-4)。沙利度胺（thalidomide)和相关化合物已显示出治疗癌症的有益作用，并且尽管其分子作用机制尚不清楚，但是对血管发生的抑制似乎是抗肿瘤作用的重要组成部分(参见例如Dredge等，MicrovaseRes.2005年1月；69(1-2):56-63)^^-(1拮抗剂在治疗类风湿性关节炎上的成功部分是因为对炎症关节组织的抗血管发生作用(Feldmann等，AnnuRevImmunol.2001;19:163-96)。普遍预期抗血管发生疗法对其它炎性疾病(特别是银肩病)具有有益疗效。尽管许多抗血管发生剂对血管发生具有作用（不论受影响组织为何），然而另一些血管发生剂可能倾向于具有组织特异性作用。[0009]周细胞是组成血管的细胞类型之一，与其一起组成血管的还有内皮细胞和平滑肌细胞。中枢神经系统中周细胞与内皮细胞的比值最高，并且认为周细胞在血脑屏障中起重要作用。糖尿病性视网膜病以视网膜微血管的周细胞缺失为标志，而且认为这种周细胞缺失对疾病进展起重要的病理生理作用。[0010]期望拥有用于抑制血管发生和用于提高血管化组织中周细胞包裹的另一些组合物和方法。这些包括可普遍地或者在某些组织中和/或疾病状态下抑制血管不利生长的方法和组合物。【
发明内容】[0011]-方面，本公开内容提供对激活蛋白样激酶I(activin-likekinaseI，ALK1)介导之调节系统的表征，以及该系统在体内血管化组织的血管发生和调节周细胞包裹中的作用。在某些方面，本公开内容提供了ALK-I配体的拮抗剂以及这些拮抗剂作为抗血管发生剂或者提高周细胞包裹的用途。另外，本公开内容提供了ALK-I自身的拮抗剂，以及这样的拮抗剂作为抗血管发生剂的用途。如本文所述，ALKl是⑶F5配体群(包括⑶F6和⑶F7)的受体，也是BMP9配体群(包括BMP10)的受体。本公开内容证实了由ALKl和上述配体介导的信号传导参与体内血管发生，以及抑制该调节系统具有强效的抗血管发生作用。此外，本公开内容证实了抑制ALKl调节系统导致血管化组织中提高的周细胞包裹。因此，在某些方面，本公开内容提供了用于抑制血管发生的ALKl调节系统的拮抗剂，包括所述受体或者一种或多种配体的拮抗剂。在某些方面，本公开内容提供了ALKl配体的拮抗剂，其用于治疗癌症(特别是多发性骨髓瘤、黑素瘤、肺癌、胰腺癌(特别是胰腺内分泌组织肿瘤）、乳腺癌(例如，原发性乳腺癌或转移性乳腺癌;雌激素受体阳性(ER+)或雌激素受体阴性(ER-)))、类风湿性关节炎、眼部病理性血管发生相关疾病以及与血管化组织中周细胞缺失相关的疾病(如糖尿病性视网膜病）。[0012]在某些方面，本公开内容提供了用于抑制血管发生的包含ALKl细胞外结构域之配体结合部分的多肽（"ALK1ECD多肽"）。不希望受任何特定作用机制的约束，预期这样的多肽通过结合ALKl配体并抑制这些配体与ALKl以及其它受体相互作用的能力而起作用。在一些实施方案中，ALKlECD多肽包含与人ALKl序列（SEQIDNO:1)之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少为70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列。ALKlECD多肽可作为小的单体蛋白或以二聚化形式(例如，表达为融合蛋白）来使用，特别是用于局部施用到组织(例如眼）中。还可将ALKlE⑶与另一多肽部分融合以提供改进的性质(例如提高的半衰期或者更易于生产或纯化）。与免疫球蛋白的Fc部分融合或者与聚氧乙烯部分（例如，聚乙二醇）连接可对全身施用（静脉内、动脉内和腹膜内施用）时提高ALKlE⑶多肽的血清半衰期特别有用。如本文所证明地，全身性施用ALKl-Fc多肽在眼中具有强效的抗血管发生作用，还在类风湿性关节炎和多种肿瘤的小鼠模型中提供了积极作用。在一些实施方案中，ALKl-Fc融合蛋白包含具有与SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少为70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列的多肽，其中使用或不使用间插接头将所述多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于1><1〇1的&结合0^5、0^7和81039，并且以大于1\1〇1勺&结合丁6邱-1。可以选择适于生物体的Fc部分。任选地，Fc部分是人IgGl的Fc部分。在一个优选的实施方案中，所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:1的22-118位氨基酸。任选地，所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。任选地，所述ALKl-Fc融合蛋白是在哺乳动物细胞系(特别是中国仓鼠卵巢（CHO)细胞系）中由SEQIDN0:4之核酸的表达所产生的蛋白质。ALKl-ECD多肽可配制为基本上不含热原的药物制备物。该药物制备物可制备用于全身递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送(例如，递送至眼）。[0013]在一些方面，本公开内容确认了开发治疗用的相对均一的ALKl-Fc融合蛋白制剂的困难。如本文所述，ALKl-Fc融合蛋白倾向于聚集成更高级的多聚体。本公开内容提供了这些困难的解决方法，并因此提供了包含ALKl-Fc融合蛋白的药物制剂，其中该制剂中至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%由二聚体ALKl-Fc融合蛋白组成。因此，在一些方面中，本公开内容提供了包含如下ALKI-Fc融合蛋白的药物制剂，所述ALKI-Fc融合蛋白包含氨基酸序列与SEQIDNO:1的22-118位氨基酸序列具有至少97%同一性的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，且其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd与GDF5、GDF7和BMP9结合，以大于IX10-6的Kd与TGF0-1结合，而且其中至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的ALKl-Fc融合蛋白以二聚体形式存在。所述ALKl-Fc融合蛋白的Fc部分可以为人IgGl的Fc部分。所述ALKl-Fc融合蛋白可包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。所述ALKl-Fc融合蛋白可通过在哺乳动物细胞系(特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系）中表达SEQIDN0:4之核酸而产生。这种药物制剂可配制成适于向眼部施用(特别是通过注射来实现）。所公开的药物制剂可用于本文表述的多种治疗目的，包括抑制血管发生、治疗肿瘤、治疗类风湿性关节炎、治疗与血管发生相关的眼部疾病以及治疗与血管化组织中周细胞包裹缺失相关的疾病(例如糖尿病性视网膜病）。所述ALKl-Fc药物制剂可与抑制血管发生的另一药剂(例如VEGF拮抗剂(如阿瓦斯丁、索拉非尼(sorafenib)和VEGF受体诱捕剂））联用。[0014]本公开内容证实ALKl信号传导途径的拮抗剂提高血管化组织中的周细胞包裹。因此，本公开内容提供了促进哺乳动物血管化组织中周细胞包裹提高的方法。这样的拮抗剂可为本文所述的任何拮抗剂(包括ALKlE⑶蛋白（例如，ALKl-Fc)、DAN蛋白）和靶向ALKl及其任何配体(包括BMP9、BMP10、GDF5、⑶F6和⑶F7)的抗体。在一些方面中，本公开内容提供了在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高的方法，该方法包括向哺乳动物施用有效量的ALKlECD蛋白。所述ALKlECD蛋白可以是ALKl-Fc融合蛋白，并且所述ALKl-Fc融合蛋白可包含氨基酸序列与SEQIDNO:1的22-118位氨基酸序列具有至少90%同一性的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中ALKl-Fc融合蛋白以大于IXI(T6的Kd与TGF0-1结合。所述ALKIECD蛋白可与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的一种或多种ALKl配体结合。所述ALKlE⑶多肽可包含与SEQIDNO:1的34-95位氨基酸对应的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。所述ALKlECD可包含由如下核酸编码的氨基酸序列，所述核酸在严格的杂交条件下与SEQIDN0:2之100-285位核苷酸杂交或者与编码相同氨基酸序列的SEQIDN0:2之100-285位核苷酸的变体杂交。所述ALKl-Fc融合蛋白可具有SEQIDNO:3的序列。所述ALKlECD融合蛋白可通过静脉内递送或局部递送至眼部。在一些方面中，本公开内容提供了在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高的方法，该方法包括向哺乳动物施用有效量的如下抗体，所述抗体与由SEQIDNO:1之22-118位氨基酸组成的ALKl多肽结合并抑制选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10的至少一种ALK1配体的结合。所述抗体可以以小于5XI(T8M、小于IXHT9M或小于IX的Kd与ALKl多肽结合。所述抗体可抑制ALKl与ALKl配体的结合，其中所述ALKl配体选自BMP9和BMPlO。所述抗体可通过静脉内或眼内递送。WO2007/040912中所述的抗体可用于此方法中。所述ALKl信号传导拮抗剂可与另一抑制血管发生的药剂(如VEGF拮抗剂)一起施用。待治疗的哺乳动物可患有糖尿病性视网膜病或以视网膜血管中周细胞包裹缺失为特征的其它视网膜疾病或选自以下的肿瘤:黑素瘤、肺肿瘤、多发性骨髓瘤、胰腺肿瘤（如胰腺内分泌组织肿瘤)和乳腺癌（例如，原发性乳腺癌或转移性乳腺癌;雌激素受体阳性(ER+)或雌激素受体阴性(ER-))。[0015]在一些方面中，本公开内容提供了用于抑制哺乳动物中血管发生的方法，其通过施用本文一般性或具体描述的任何ALKlECD多肽来实现。在一个实施方案中，方法包括向哺乳动物施用有效量的ALKl-Fc融合蛋白，其中所述ALKlFc融合蛋白包含具有与SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少为90%的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXIO-6的Kd结合TGFI3-1。任选地，所述ALKl-Fc融合蛋白结合选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的一种或多种ALKl配体。任选地，所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDNO:3的序列。所述ALKlE⑶多肽可以局部递送(例如，递送至眼）或全身递送(例如，静脉内、动脉内或皮下）。在一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于抑制哺乳动物眼中血管发生的方法，其通过在远离眼的位置向哺乳动物施用ALKl-Fc蛋白来实现，例如通过全身施用。[0016]在一些方面中，本公开内容提供了与ALKl(特别是位于细胞外结构域(SEQIDNO:1的22-118位氨基酸）中的表位)结合并抑制八1^1与选自60?5、60?6、60?7、81039和810310的至少一种ALKl配体结合的抗体。基于这些配体对ALKl的亲和力，抗体可以以小于5XHT8M(任选地5XHT8~IXI(Tlti)的Kd结合。预期亲和力在该范围内的抗体抑制⑶F5、6和7中一种或多种的信号传导，而对BMP9和10的信号传导具有较小影响。这样的抗体优选地抑制由选自GDF5、⑶F6和⑶F7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。不希望受特定机制的约束，预期这样的抗体会通过直接抑制ALKl活性来起作用，这应当与ALKl-Fc融合蛋白的活性相对，后者预期抑制ALK1配体的活性。预期抗ALK1抗体不干扰GDF5、⑶F6、⑶F7、BMP9或BMP10经由替代性受体系统（例如BMPRla、BMPRlb和BMRII复合物）进行信号传导的能力。然而，预期抗ALKl抗体会干扰ALKl的低亲和力配体(例如TGF-β，一般认为，尽管结合相当弱但其仍经由ALK-I诱发重要的信号传导事件)经由ALKl进行信号传导的能力，尽管ALKlE⑶可能不结合或抑制这样的低亲和力配体。抗体可以以小于IXHT1t3M的Kd结合ALKl多肽。预期亲和力在该范围内的抗体抑制BMP9或10的信号传导。这样的抗体优选地抑制BMP9和BMP10与ALK1的结合。值得注意地，基于本文公开的数据，与ALKl结合相对较弱的抗体可抑制TGFP结合ALKl，而不能抑制更紧密的结合配体例如⑶F5或BMP9。本文所述的抗体优选为重组抗体，意为从利用分子生物学技术构建的核酸表达而来的抗体，例如人源化抗体或者从单链抗体开发而来的完全人抗体。Fv、Fab和单链抗体也包括在术语"重组抗体"的范畴内。抗体也可以是多克隆抗体或非重组型单克隆抗体(包括人或小鼠的形式，以及从转基因小鼠获得的人抗体）。抗体和ALKl-ECD多肽可配制为基本上不含热原的药物制备物。所述药物制备物可制备用于全身递送（例如，静脉内、动脉内或皮下递送）或局部递送（例如，递送至眼）。卵2007/040912中所述的抗体可用于本文所述的各方法中。[0017]在一些方面中，本公开内容提供了用于抑制哺乳动物中血管发生的方法，其通过向哺乳动物施用本文一般性或具体描述的的与ALKl多肽结合的有效量抗体来实现。可用于该目的的抗体可结合ALKl的细胞外结构域(例如，结合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成的多肽)或ALKl的另一部分。所述抗体可结合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成的多肽并抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10中至少一种ALK1配体的结合。所述抗体可以以小于5X10-8Μ(任选地5XHT8~IXI(Tlti)的Kd结合ALKl多肽。所述抗体可抑制由选自⑶F5、⑶F6和⑶F7中至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。相对于ΒΜΡ9或10的信号传导而言选择性抑制⑶F5、GDF6或⑶F7所介导之信号传导的抗体可用作⑶F5、6或7所定位的组织(主要是骨或关节）中所发生的血管发生的选择性抑制剂。所述抗体可以以小于IXHT1t3M的Kd结合ALK1多肽。所述抗体可抑制ALK1与ALKl配体的结合，其中所述ALKl配体选自BMP9和BMP10。所述抗ALKl抗体可局部递送(例如，递送至眼）或全身递送(例如，静脉内、动脉内或皮下）。在一个具体的实施方案中，本公开内容提供了通过施用抗ALKl抗体来抑制哺乳动物眼中血管发生的方法。在另一具体实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患多发性骨髓瘤的患者的方法。在一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于抑制如下疾病中血管发生的方法，所述疾病与多种促血管发生因子(例如，VEGF、PDGF和/或FGF)导致的病理性血管发生有关。[0018]在一些方面中，本公开内容提供了与本文公开之ALKl配体结合并抑制所述ALKl配体与ALKl结合的抗体。不希望受任何特定机制的约束，预期与ALKl配体结合的抗体具有实际上类似于ALKlECD多肽的作用，因为这两类物质都结合所述配体，而非结合所述受体本身。在一些实施方案中，所述抗体结合选自GDF5、GDF6和GDF7的配体。所述抗体可以以小于5XKT8M的Kd结合ALKl配体。可选择所述抗体用于抑制由ALKl配体刺激的血管发生。CAM测定是适于选择期望抗体的测定系统。这样的抗体优选为重组抗体，并可配制为基本不含热原的药物制备物。所述药物制备物可制备用于全身递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送(例如，递送至眼）。[0019]在一些方面，本公开内容提供了结合ALKl配体并抑制ALKl配体与ALKl结合的抗体，其中所述ALKl配体选自BMP9和BMP10。所述抗体可以以小于IX10-iqM的Kd结合ALKl配体。这样的抗体优选为重组抗体，并可配制为基本不含热原的药物制备物。所述药物制备物可制备用于全身递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送(例如，递送至眼）。[0020]在一些方面中，本公开内容提供了抑制哺乳动物中血管发生的方法，该方法包括向哺乳动物施用与ALK1配体结合并抑制所述ALK1配体结合ALK1的有效量的抗体，其中所述ALK1配体选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10。所述抗体可抑制由选自⑶F5、GDF6和⑶F7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。[0021]BMP/GDF家族的成员（包括81039、810310、60?5、0^6和0^7)与1型和11型受体结合从而形成有功能的信号传导复合物。这些受体的结合位点是不一样的。因此，在一些实施方案中，与ALKl配体结合并抑制所述配体与ALKl结合的抗体是在该配体的I型受体结合位点处或其附近结合的抗体。[0022]在一些方面中，本公开内容提供了用于抑制哺乳动物中血管发生的方法，其通过施用本文公开的ALKl信号传导系统的其它抑制剂来实现。这样的抑制剂可包括降低ALKl、GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9或BMP10产生的核酸(例如，反义或RNAi构建体）。也可使用各种亲和性结合试剂，例如可通过修饰而结合所选靶标的适配体、随机肽、蛋白支架(所述支架的实例包括anticalin和FNIII结构域）；在每种情形中，选择能够破坏本文公开之ALKl调节系统的亲和性结合试剂，其或者通过破坏ALKl-配体相互作用或者通过抑制结合后所发生的信号传导来实现。[0023]在另一实施方案中，本公开内容描述了DAN作为ALKl调节系统之调节剂的作用。如本文所示，DAN结合GDF5配体群，但不结合BMP9配体群。因此，预计DAN抑制由GDF5、GDF6或⑶F7介导的血管发生，但不抑制由BMP9或BMPlO介导的血管发生。因此，DAN可用作在主要表达GDF5蛋白质群的骨或关节中抑制血管发生的选择性试剂。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了DAN蛋白用作在骨或关节血管发生背景下的抗血管发生剂，包括类风湿性关节炎和涉及骨或关节的癌症（例如多发性骨髓瘤和骨转移）JAN蛋白通常结合选自GDF5、GDF6和⑶F7的一种或多种ALKl配体，而与BMP9或BMPlO的结合相对较弱。DAN蛋白可包含与对应于SEQIDNO:10之17-180位氨基酸（成熟的人DAN)或SEQIDNO:10之21-125位氨基酸(DAN的保守性半胱氨酸结（cysteineknot)结构域）的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。DAN蛋白还可由核酸编码，所述核酸包含其互补物在严格杂交条件下与下列序列杂交的序列：SEQIDN0:11的153-467位核苷酸、或具有相同编码序列的SEQIDNO:11之153-467位核苷酸的变体（"沉默"变体，例如在三联体密码的摆动位置(wobbleposition)包含一个或多个改变的变体），或者SEQIDNO:11的93-635位核苷酸或其沉默变体。在一些方面中，所述DAN蛋白是融合蛋白，例如Fc融合蛋白。尽管预期DAN特别有用于抑制骨和关节中的血管发生(包括位于骨或关节中的肿瘤，例如多发性骨髓瘤和骨转移），但是它也可用于其它方面，例如位于其它部位的肿瘤，或眼中的肿瘤。[0024]在一些方面中，本公开内容提供了用于治疗哺乳动物中类风湿性关节炎的方法，该方法包括向患类风湿性关节炎的哺乳动物施用有效量的选自下列的试剂:ALKlECD蛋白；结合ALKl配体并抑制ALKl配体与ALKl结合的抗体，其中所述ALKl配体选自⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10;结合ALK1多肽并抑制与选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的至少一种ALKl配体结合的抗体，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成;DAN多肽。[0025]在一些方面中，本公开内容提供了用于治疗哺乳动物中肿瘤的方法。这样的方法可包括向患肿瘤的哺乳动物施用有效量的选自以下的试剂:ALKlE⑶蛋白（例如，ALKl-Fc);结合ALK1配体并抑制ALK1配体与ALK1结合的抗体，其中所述ALK1配体选自⑶F5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10;结合ALK1多肽并抑制与选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的至少一种ALK1配体结合的抗体，所述ALK1多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成;DAN多肽。该方法还可包括施用抑制血管发生的另一试剂。所述肿瘤可以是与骨有关的肿瘤，例如白血病、骨髓肿瘤、多发性骨髓瘤或骨转移，例如常常与乳腺癌或前列腺癌有关的那些。肿瘤可以是黑素瘤、肺癌肿瘤、胰腺肿瘤(如胰腺内分泌组织肿瘤)或乳腺癌(如原发性乳腺癌或转移性乳腺癌）。乳腺癌可以是雌激素受体阳性(ER+)或雌激素受体阴性(ER-)。肿瘤还可以是利用多种促血管发生因子的肿瘤，例如对于抗VEGF疗法具有抗性的肿瘤。[0026]在一些方面中，本公开内容提供了眼药制剂。这样的制剂可包含选自以下的试剂：ALKlECD蛋白；结合ALKl配体并抑制ALKl配体与ALKl结合的抗体，其中所述ALKl配体选自GDF5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10;结合ALKl多肽并抑制与选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的至少一种ALKl配体结合的抗体，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成；DAN多肽。[0027]在一些方面中，本公开内容提供了用于治疗血管发生相关的眼病的方法。这样的方法可包括全身施用或者向所述眼睛施用包含有效量的选自下列之试剂的药物制剂:ALK1ECD蛋白；结合ALKl配体并抑制ALKl配体与ALKl结合的抗体，其中所述ALKl配体选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10;结合ALKl多肽并抑制与选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的至少一种ALKl配体结合的抗体，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成;DAN多肽。[0028]在每种情形中，可将本文所述的试剂与抑制血管发生的另一试剂联用。在期望抑制肿瘤的血管发生时，可将所述试剂与具有抗癌作用的另一试剂联用，所述另一试剂例如化疗试剂或生物抗癌剂。[0029]本公开内容还提供了包含ALKl-Fc融合蛋白的眼科药物制剂，所述融合蛋白具有与SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列同一性至少为97%、98%或99%的氨基酸序列，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白与GDF5、GDF7和BMP9以小于IXHT7M的Kd结合，与TGFiM以大于IXHT6的Kd结合。在一个实施方案中，所述融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。在一个实施方案中，所述Fc部分来自人IgGl。在一个实施方案中，所述融合蛋白通过在哺乳动物细胞系中表达SEQIDN0:4的核酸而得到。在一个实施方案中，所述细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。所述制剂还可包含一种或多种以下药物：倍加他尼(pegaptanib)、雷珠单抗(ranibizumab)或糖皮质激素。在一个实施方案中，所述制剂基本不含热原。[0030]本申请还提供了包含如下抗体的眼科药物制剂，所述抗体结合由SEQIDN0:1的22-118位氨基酸组成的40(1多肽并抑制与选自0^5、60?6、60?7、81039和810310的至少一种ALKl配体的结合。在一个实施方案中，所述抗体抑制由选自GDF5、GDF6和GDF7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。在一个实施方案中，所述抗体以小于5XKT8M的Kd结合ALKl多肽。在另一实施方案中，所述抗体以小于IXHT1t3M的Kd结合ALKl多肽。在一个实施方案中，所述抗体抑制由⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9或BMPlO刺激的血管发生。所述制剂还可包含一种或多种以下药物:倍加他尼、雷珠单抗或糖皮质激素。在一个实施方案中，所述制剂基本不含热原。[0031]在一些方面中，本公开内容提供了包含如下抗体的眼科药物制剂，所述抗体结合本文公开的ALKl配体并抑制所述ALKl配体与ALKl的结合。在一些实施方案中，所述抗体结合选自GDF5、⑶F6和⑶F7的配体。所述抗体可以以小于5XHT8M的Kd结合ALKl配体。可选择所述抗体用于抑制由ALKl配体所刺激的血管发生。CAM测定是适于选择理想抗体的测定系统。这样的抗体优选为重组抗体。所述制剂还可包含一种或多种以下药物:倍加他尼、雷珠单抗或糖皮质激素。在一个实施方案中，所述制剂基本不含热原。[0032]本申请还提供了治疗血管发生相关眼病的方法，该方法包括向所述眼睛施用包含ALKl-Fc融合蛋白的眼科药物制剂，所述融合蛋白包含具有与SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列同一性至少为97%、98%或99%的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd与⑶F5、⑶F7和BMP9结合，以大于IX10-6的Kd与TGF0-1结合。在一个实施方案中，所述融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。在一个实施方案中，所述Fc部分来自人IgGl。在一个实施方案中，所述融合蛋白通过在哺乳动物细胞系中表达SEQIDN0:4的核酸而得到。在一个实施方案中，所述细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。所述制剂还可包含一种或多种以下药物:倍加他尼、雷珠单抗或糖皮质激素。在一个实施方案中，所述制剂基本不含热原。[0033]本申请还提供了治疗血管发生相关眼病的方法，该方法包括向所述眼睛施用包含如下抗体的眼药制剂，所述抗体结合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成的ALKl多肽并抑制与选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMPlO的至少一种ALKl配体的结合。在一个实施方案中，所述抗体抑制由选自GDF5、⑶F6和⑶F7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。在一个实施方案中，所述抗体以小于5XHT8M的Kd结合ALKl多肽。在另一实施方案中，所述抗体以小于IX10-iqM的Kd结合ALKl多肽。在一个实施方案中，所述抗体抑制由⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9或BMPlO所刺激的血管发生。所述制剂还可包含一种或多种以下药物:倍加他尼、雷珠单抗或糖皮质激素。在一个实施方案中，所述制剂基本不含热原。[0034]在所公开方法的一个实施方案中，所述血管发生相关疾病选自肿瘤、对于抗VEGF疗法具有抗性的肿瘤、多发性骨髓瘤、已转移至骨的肿瘤、关节或骨的炎症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维增生症。【附图说明】[0035]图1显示人激活蛋白样激酶1一一ALKl的氨基酸序列（SEQIDNO:1)。单下划线表示预测的细胞外结构域。双下划线表示细胞内结构域。信号肽和跨膜结构域未用下划线示出。[0036]图2显示人ALKlcDNA的核酸序列（SEQIDN0:2)。编码序列用下划线表示。编码细胞外结构域的部分用双下划线表示。[0037]图3显示人ALKl的细胞外结构域与Fc结构域融合的实例（SEQIDNOdhhALKl-Fc蛋白包含C端与接头(下划线表示)和IgGlFc区域融合的人ALKl蛋白22-120位氨基酸。[0038]图4显示表达SEQIDN0:3的hALKl-Fc多肽的核酸序列。还显示了所编码的氨基酸序列。由于前导序列被切割，因此Asp22是所分泌蛋白的N端氨基酸。[0039]图5显示鼠ALK1-Fc("RAP"）和人ALK1-Fc("ACE"）在内皮细胞管形成测定中的抗血管发生作用。与阳性对照（内皮抑素）相比，在响应于内皮细胞生长添加剂(EndothelialCellGrowthSupplement，ECGF)时所有浓度的RAP和ACE使管形成水平降低得更多。[0040]图6显不GDF7在鸡绒毛尿囊膜（chickchorioallantoicmembrane，CAM)测定中的血管发生作用。GDF7的作用与VEGF的作用相当。[0041]图7显示人ALKl-Fc融合蛋白在CAM测定中的抗血管发生作用。hALKl-Fc抑制由VEGF、FGF和⑶F7刺激的血管发生。[0042]图8显示鼠ALKl-Fc(mALKl-Fc)、hALKl-Fc、市售的抗ALKl单克隆抗体(Anti-ALKlmAb)和市售的中和性抗VEGF单克隆抗体相比较的抗血管发生作用。ALKl-Fc构建体的抗血管发生作用与抗VEGF抗体的作用相当。[0043]图9显示hALKl-Fc和抗VEGF抗体在体内的抗血管发生作用。利用小鼠角膜微囊袋测定(mousecornealmicropocketassay)测量，hALKl-Fc和抗VEGF抗体对眼中血管发生具有相当的作用。[0044]图10显不mALKl-Fc在鼠胶原诱导关节炎（collagen-inducedarthritis，CIA)的类风湿性关节炎模型中的作用。该图显示在胶原诱导的雄性DBA/1关节炎小鼠的42天观察期中测定的平均群体关节炎评分。RAP-041是mALKI-Fc。阿瓦斯丁?是抗VEGF抗体贝伐单抗。[0045]图11显示hALKl-Fc(SEQIDN0:3)和来自R&DSystems(Minneapolis，MN)的hALKl-Fc融合蛋白在Superose1210/300GL大小排阻柱（AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上的分离度。R&DSystems的材料含有约13%的聚集蛋白（如图左侧的峰所显示）以及一些低分子量物质。所述SEQIDN0:3的材料中超过99%由合适分子大小的二聚体组成。[0046]图12显示在用PBS(圆圈）和mALKI-Fc(三角形）处理的小鼠中的表达萤光素酶之Lewis肺癌(LL/2-luc)细胞的荧光信号。将肿瘤细胞注射入尾静脉，并在施用细胞的当天开始处理(PBS或10mg/kgmALKl-Fc，腹膜内，每周两次）。在第22天处死濒死的经PBS处理的小鼠。处理组和对照组各由7只动物组成(n=7)。[0047]图13显示在胰腺内分泌肿瘤RIPl-Tag2小鼠模型中ALKl和BMP9在不同肿瘤发展阶段的表达水平。ALKl表达在血管发生活性最高的阶段达到峰值，而BMP9表达在整个肿瘤发展过程中升高。[0048]图14显示在RIPl-Tag2小鼠中mALKl-Fc处理对肿瘤生长的作用。从10周龄或12周龄开始，用mALKl-Fc或对照Fc(在每种情况下均为每只小鼠300微克，每周两次)处理小鼠两周。mALKl-Fc处理完全阻滞肿瘤生长。[0049]图15显示经mALKl-Fc或对照Fc处理的RIPl-Tag2小鼠中肿瘤的血管密度(CD31+细胞）^ALKl-Fc处理将肿瘤的血管密度降低约50%。[0050]图16显示经mALKl-Fc或对照Fc处理的RIPl-Tag2小鼠肿瘤血管中的周细胞包裹(NG2+细胞与⑶31+细胞的比值）^ALKl-Fc处理将周细胞包裹升高约100%。[0051]图17显示，采用MDA-MB-231细胞系（一种源自ER-乳腺癌细胞的细胞系），mALKl-Fc对同位异种移植模型的作用。在30mg/kg的剂量下，mALKl-Fc对异种移植肿瘤有显著的生长延迟作用。[0052]图18显示，采用MCF7细胞系（一种源自ER+乳腺癌细胞的细胞系），hALKl-Fc对同位异种移植模型的作用。在10或30mg/kg的剂量下，hALKl-Fc对异种移植肿瘤有显著的生长延迟作用。【具体实施方式】[0053]1.综述[0054]ALKl是针对TGF-β超家族配体的I型细胞表面受体，也被称为ACVRLl和ACVRLK1。已提示ALKl可作为TGF-m、TGF-03和BMP-9的受体(Marchuk等，HumMolGenet.2003;Brown等，JBiolChem.2005年7月1日；280(26):25111-8)〇[0055]在小鼠中，ALK1的功能丧失突变导致发育中血管系统的多种异常（0h等，Proc.NatlAcad.Sci.USA2000，97，2626-2631;Urness等，Nat.Genet·2000，26，328-331)ο[0056]在人中，ALKl的功能丧失突变与遗传性出血性毛细血管扩张（hereditaryhemorrhagictelangiectasia，HHT或Osler-Rendu-Weber综合征）有关，其中患者发生动静脉畸形，其导致从动脉直接流向（连通)静脉(动静脉短路(arteriovenousshunt))，而不经过中间的毛细血管网（capillarybed)。患HHT患者的典型症状包括复发性鼻出血、胃肠道出血、皮肤和皮肤粘膜毛细血管扩张以及肺、脑或肝血管系统的动静脉畸形(arteriovenousmalformation，AVM)〇[0057]最近来自David等（Blood·2007年3月1日；109(5):1953-61)和Scharpfenecker等(JCellSci.2007年3月15日；120(Pt6):964-72)的出版物得出结论，BMP9和BMP10激活内皮细胞中的ALKl，并且该激活导致内皮细胞增殖和迀移的抑制。这些作用与促血管发生因子（例如VEGF)的作用刚好相反。因此这些出版物得出，BMP9和BMP10自身是抗血管发生因子，并且ALKl活化具有抗血管发生作用。相反地，本公开内容表明BMP9和BMP10的拮抗剂(而非激动剂)具有抗血管发生作用。[0058]本公开内容涉及发现包含ALKl细胞外结构域之一部分的多肽（"ALK1E⑶多肽"）可用于抑制体内血管发生，包括非VEGF依赖性的血管发生以及由多种血管发生因子(包括VEGF、FGF和TOGF)介导的血管发生。在一些方面中，本公开内容鉴定了ALKl的生理性高亲和力配体，并表明ALKlE⑶多肽抑制血管发生。该数据表明，ALKlE⑶多肽可发挥抗血管发生作用，即使ALKlE⑶多肽与TGF-βΙ未表现出明显结合。而且，ALKlE⑶多肽抑制由许多不同促血管发生因子(包括VEGF、FGF和GDF7)刺激的血管发生。因此，本公开内容描述了ALKl调节系统，其中ALKl是⑶F5配体群(包括⑶F6和⑶F7)的受体，也是BMP9配体群(包括BMP10)的受体，其与这两组配体的亲和力不同。此外，本公开内容表明由ALKl和上述配体介导的信号传导在体内是促血管发生的，在体内抑制该调节系统具有强效的抗血管发生作用。因此，在一些方面中，本公开内容提供了用以抑制血管发生(包括VEGF依赖型血管发生和非VEGF依赖型血管发生）的ALKl调节系统的拮抗剂，包括所述受体或者一种或多种所述配体的拮抗剂。然而，应注意的是，预期针对ALKl自身的抗体具有与ALKlECD多肽不同的作用。预期针对ALKl的泛中和性抗体(pan-neutralizingantibody)(抑制所有强配体和弱配体结合的抗体)抑制这些配体经由ALKl的信号传导，但预期不会抑制这些配体经由其它受体(例如，在⑶F5-7和BMP9-10情形中的810^1&、810^113、810^11，以及了6邱情形中的了81?1和了81?11)的信号传导能力。另一方面，预期ALKlECD多肽抑制所有与其紧密结合的配体(对于例如实施例中显示的构建体，包括GDF5-7和BMP9-10)，但不影响与其弱结合的配体(例如TGF-β)。所以，尽管针对ALKl的泛中和性抗体会阻断BMP9和TGF-β经由ALKl的信号传导，但其不会阻断BMP9和TGF-β经由另一受体的信号传导；尽管ALKlE⑶多肽可抑制BMP9经由所有受体的信号传导（即使受体不是ALKl)，但预期其不抑制TGFj经由任何受体（即使是ALKl)的信号传导。[0059]除非另有指明，本文所述蛋白质是人蛋白质。所述蛋白质的Genbank序列号如下：人GDF5，CAA56874;人GDF6，AAH43222;人GDF7，NP_878248;人BMP9，Q9UK05;人BMP10，095393;人ΟΑΝ,ΒΑΑΘΖΖΘδαΑυα序列列于图1-5中。[0060]人DAN氨基酸序列（SEQIDN0:10)(GenbankΒΑΑ92265):[0061]MLRVLVOAVLPAMLLAAPPPINKU^LFPPKSAWCEAKWITQIVGHSGCEAKSIQMRftCLqQCFSYgVFJOTF|>$gTE5LVHCPSCMPAQSMWSIVTLECPeHEEVPRVPKLVEKILHCSCQACGKBPSHBGIiSWVQGEDGPGSQPSTHPHPHPHPHPGGQTPEPEOPPQAPHTEEEGAED[0062]成熟的DAN蛋白预期对应于17-180位氨基酸。DAN的保守性半胱氨酸结结构域对应于21-125位氨基酸(下划线表示）。[0063]人DANcDNA序列（SEQIDN0:ll)(GenbankBC012037):[0064]gccgagcctcctggggcgcccgggcccgcgacccccgcacccagcCccgcaggaccggcgggcgcgcgcgggctctggaggccacgggcatgatgcttcgggtcctggtgggggctgtcctccctgccatgctactggctgccccaccacccatcaacaagctggcactgttcccagataagagtgcctggtgcgaagccaagaacatcacccagatcgtgggccacagcggctgtgagg[0065]ccaagtccatccagaacagggcgtgcctaggacagtgcttcagctacagcgtccccaacaccttcccacagtccacagagtccctggttcactgtgactcctgcatgccagcccagtccatgtgggagattgtgacgctggagtgcccgggccacgaggaggtgcccagggtggacaagctggtggagaagatcctgcactgtagctgccaggcctgcggcaaggagcctagtcacgaggggctgaigrcgt^cfcatgtgcagggegaggacgggccgggatcccagcccggcacceaccGtcacccccatccccacccccaccctggcgggcagacccctgagcccgagg^0ccccctgggsccccccacacagag^aagagggggctgaggactgaggcccccccaactcttcctcccctctcatccccctgtggaatgttgggtctcactctctggggaagtcaggggagaagctgaagcccccctttcrgcactagatggacttggcttcagactcggacttgaatgctgcccggttgccacggagatctgaaggggcggggttaga9ccaagctgcacaatttaatatattcaagagtggcagaggtcttcagggetctfctxfcttggggggggggtggCctcttccCgtctggcttctagagatgtgcctgtgggagggggcfcgagccattgagtgctgggggaggccatccaagatggcatgaatcgggctaaggtccctgggggtgcagatggtactgctgaggtcccgggcttagtgtgagcatcttgccagcctcaggcttgaggga^sgctgggctagaaagaccactggcagaaacaggaggctccg^ccccacaggtttccccaaggcctctcaccccacttcccatctccagggaagcgtcgccccagtggcactgaagtggccctccctcagcggaggggtttgggagtcaggcctgggcaggaccctgctgactcgtggcgcgggagctg39fa-gccaggctctccgggcctttctctggcttccttggctrtgcctggtgaggaggggaagaaggaaagggaagagtcttccaaggccagaaggagggggacaaccccccaagaccatccctgaagacgagcatccccctcctctccctgttagaaatgctagtgccccgcactgtgccccaagttctaggccccccagaaagctgtcagagccggccgccttctcccctctcccagggatgctctttgtaaatatcggatgggtgtgggagcgaggggttacctccctcgccccaaggttccagaggccctiaggcgggatgggc^cgctgaacctcgaggaactccaggacgaggaggacatgggacttgcgtggacagtcagggttcactcgggctctctctagctccccaattctgcctgcctcctccctcccagctgcacfcttaaccctagaaggtgsggacctggggggagggacagggcaggcgggcccatgaagaaagcccctcgttgcccagcactgtctgcgtctgctcttctgtgcccagggtggctgccagcccacfcgcctcctgcctggggtggcctggccctcctggctgttgcgacgcgggcttctggagcttgtcaccattggacagtctccctgatggaccctcagtcttctcatgaataaattccctcaacgccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa[0066]DAN前体的编码序列对应于93-635位核酸。成熟DAN蛋白的编码序列对应于141-632位核酸。DAN的保守性半胱氨酸结部分的编码序列对应于153-467位核酸。[0067]本说明书中使用的术语在本公开内容的上下文中以及在每个术语使用的特定上下文中一般具有本领域的普通含义。某些术语在说明书中进行了论述，从而向实施者提供有关描述本文公开的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。从术语使用的特定上下文，该术语之任何用途的范围或含义将是显而易见的。[0068]2.可溶性ALKl多肽[0069]天然ALKl蛋白是跨膜蛋白质，该蛋白的一部分位于细胞外(细胞外部分），一部分位于细胞内（细胞内部分）。本公开内容的多个方面包括含有ALKl细胞外结构域之一部分的多肽。[0070]在一些实施方案中，本公开内容提供了"ALK1E⑶多肽"。术语"ALK1E⑶多肽"意指由天然ALKl多肽细胞外结构域的氨基酸序列组成或者包含其的多肽(其包括或不包括任何信号序列和信号序列N端的序列），或者意指与天然ALKl多肽细胞外结构域具有至少33%同一性的氨基酸序列，任选地与天然ALKl多肽细胞外结构域具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99或100%同一性，例如SEQIDNO:1的34-95位氨基酸的半胱氨酸结区域或者半胱氨酸结加细胞外结构域之N-端和C-端的额外氨基酸(例如SEQIDN0:1的22-118位氨基酸）。同样，ALKlECD多肽可包含由SEQIDN0:2的100-285位核苷酸或其沉默变体或者在严格杂交条件（一般地，这样的条件是本领域已知的，例如可包括于65°C在50%(体积/体积）甲酰胺、5XSSC、2%(重量/体积)封闭剂、〇.I%N-十二烷基肌氨酸、0.3%SDS中过夜杂交，并例如于约65°C在5XSSC中清洗)下与其互补物杂交的核酸所编码的多肽。此外，ALKlE⑶多肽可包含由SEQIDNO:2的64-384位核苷酸或其沉默变体或者在严格杂交条件(一般地，这样的条件是本领域已知的，例如可包括于65°C在50%(体积/体积）甲酰胺、5XSSC、2%(重量/体积)封闭剂、0.1%N-十二烷基肌氨酸、〇.3%SDS中过夜杂交，并例如于65°C在5乂55(：中清洗)下与其互补物杂交的核酸所编码的多肽。因此，术语"ALK1ECD多肽"包含ALKl多肽的分离的细胞外部分、其变体(包括含有在对应于SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列中例如不超过2、3、4、5或10个氨基酸替换、添加或缺失的变体，以及包括含有在对应于SEQIDNO:1的34-95位氨基酸所示序列中不超过2、3、4、5或10个氨基酸替换、添加或缺失的变体）、其片段和包含任何上述序列的融合蛋白；然而，在每种情形中，任何前述的ALKlECD多肽优选将保持与GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMPlO中一种或多种的高亲和力。术语"ALK1E⑶多肽"显然旨在排除任何全长的天然ALKl多肽。一般地，ALKlE⑶多肽被设计为在生物学相关的温度、pH水平和渗透压下可溶于水性溶液。[0071]如上所述，本公开内容提供了与天然ALKl多肽共有特定程度的序列同一性或相似性的ALKlECD多肽。为了确定这两种氨基酸序列的同一性百分比，对所述序列进行以最优比较为目的的比对(例如，为了最优比对可以在第一和第二氨基酸(或核酸)序列中一个或二者中引入空位，为比较目的可以忽略非同源序列）。然后比较对应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置与第二序列中的对应位置均为同样氨基酸残基时，则所述分子在该位置是一致的（如本文所使用的"同一性"，其等同于氨基酸"同源性"）。所述两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同残基之数目的函数，其中考虑到了空位数和每个空位的长度，所述空位是为了这两个序列最优比对的需要而引入。[0072]序列比较以及确定两个序列之间同一性和相似性的百分比可使用数学算法来实现（ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.编著，OxfordUniversityPress,NewYork?1988；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects，Smith，D·W·，ed·，AcademicPress?NewYork，1993;ComputerAnalysisofSequenceData，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，HumanaPress，NewJersey，1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G·,AcademicPress，1987以及SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStocktonPress，NewYork，1991)〇[0073]在一个实施方案中，使用Needleman和Wunsch算法（JMol.Biol·(48):444-453(1970))来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入GCG软件包（可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中。在一个具体实施方案中，在GAP程序中使用以下参数:Blosum62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一实施方案中，使用GCG软件包(Devereux，J.等，NucleicAcidsRes·12(1):387(1984))(可从http://www.gcg.com获得）中的GAP程序来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。示例性参数包括使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。除非另有指明，使用采用Blosum62矩阵、空位权重为10以及长度权重为3的GAP程序来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比；如果这样的算法不能计算期望的同一性百分比，则应选择本文公开的合适的其它算法。[0074]在另一实施方案中，使用E.Myers和W.Miller的算法(CABI0S，4:11-17(1989))来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已并入采用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、空位长度罚分为12以及空位罚分为4的ALIGN程序(2.0版）中。[0075]在另一实施方案中，可使用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci·，6:237_245(1990))的FASTDB计算机程序来确定两个氨基酸序列之间的最佳整体比对。在序列比对中，查询序列和目的序列均为氨基酸序列。所述全面序列比对的结果表示为同一性百分比。在一个实施方案中，使用基于Brutlag等的算法（Comp.App.Biosci.，6:237-245(1990))的FASTDB计算机程序来确定氨基酸序列同一性。在一个具体的实施方案中，所使用的计算氨基酸比对的同一"性和相似性百分比的参数包括:矩阵=PAM150，k-tupIe=2，错配罚分=1，连接罚分（joiningpenalty)=20，随机化群组长度=0，截断值=1，空位罚分=5，空位大小罚分=0.05。[0076]在一些实施方案中，ALKlECD多肽包含天然ALKl蛋白（例如SEQIDNO:1的序列）的细胞外部分，优选是ALKl细胞外结构域的配体结合部分。在一些实施方案中，可溶性ALKl多肽包含与SEQIDN0:1的22-118位氨基酸所示序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的细胞外ALKl多肽包含SEQIDNO:1细胞外部分氨基酸序列的至少30、40或50个连续氨基酸。[0077]在一些优选的实施方案中，ALKlECD多肽结合⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10中的一种或多种。任选地，所述ALKl多肽基本上不显示与TGF-βΙ或TGF-I33的结合。可使用纯化蛋白质在溶液中或在表面等离子体共振系统(例如Biacore?系统）中对结合进行评估。优选的可溶性ALKl多肽将显示抗血管发生活性。血管发生抑制活性的生物测定包括鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定、小鼠角膜微囊袋测定、测量施用分离的或合成的蛋白质对植入肿瘤之作用的测定。CAM测定由O'Reilly等描述于"AngiogenicRegulationofMetastaticGrowth"Cell，79(2)卷，1994年10月I日，315-328页。简言之，将具有完整卵黄的3日龄鸡胚从卵中分离并置于petri培养皿中。孵育3天后，将含有待测试蛋白质的甲基纤维素盘(methylcellulosedisc)施加至每个胚胎的CAM。孵育48小时后，观察胚胎和CAM以确定内皮生长是否已被抑制。小鼠角膜微囊袋测定包括将含有生长因子的粒状物(pellet)连同含有疑似内皮生长抑制剂的另一粒状物植入小鼠的角膜中，观察角膜中形成的毛细血管模式。其它测定描述于实施例中。[0078]ALKlE⑶多肽可通过去除ALKl多肽的细胞质尾部和跨膜区域而得到。或者，可通过缺失或通过用亲水性氨基酸残基替换构成跨膜结构域的正常疏水氨基酸残基来使跨膜结构域失活。在上述任一情形中，形成了基本上亲水的亲水性模式，其降低亲脂性并增进水溶性。跨膜结构域的缺失优选依靠用亲水氨基酸残基进行替换，因为这样避免引入可能具有免疫原性的表位。[0079]ALKlE⑶多肽还可在N端包含任意的各种前导序列。在真核系统中这样的序列会使所述肽表达以及靶向到分泌途径。参见，例如Ernst等，美国专利No.5，082，783(1992)。或者，可以使用本源的ALKl信号序列来实现从细胞泌出。可能的前导序列包括本源的、tPa和蜜蜂蜂毒素(mellitin)前导序列（分别为SEQIDNO7-9)。对信号肽的加工可依所选前导序列、所使用细胞类型和培养条件等参数而变化，因此成熟ALKlECD多肽(包括SEQIDNO:5)的实际N端起始位点可在N端或C端方向上移动1-5个氨基酸。[0080]在一些实施方案中，本公开内容涵盖了ALKl多肽的特定突变从而改变该肽的糖基化。可选择这样的突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，例如0-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列一一天冬酰胺-X-苏氨酸(或天冬酰胺-X-丝氨酸）（其中"X"是任意氨基酸），其被合适的细胞糖基化酶特异性识别。还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加、替换至野生型ALKl多肽序列(针对0-连接的糖基化位点）来进行改变。在糖基化识别位点的第一个或第三个氨基酸位置的一处或两处进行多种氨基酸替换或缺失(和/或在第二个位置进行氨基酸缺失)导致经修饰三肽序列的非糖基化。在ALKl多肽上增加碳水化合物部分数目的另一方法是将糖苷通过化学方法或酶促法偶联至ALKl多肽来实现。取决于所使用的偶联模式，可以使糖连接至(a)精氨酸和组氨酸；（b)游离的羧基；（c)游离的巯基(例如半胱氨酸的巯基）；（d)游离的羟基(例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基）；（e)芳族残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基）；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于1987年9月11日公布的WO87/05330以及ApIin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.，259-306页中，其通过引用并入本文。可通过化学方法和/或酶促方法将ALKl多肽上存在的一个或多个碳水化合物去除。化学方法去糖基化可包括例如使ALKl多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）以外的大多数或所有糖被切割，而氨基酸序列则保持完好。化学方法去糖基化还描述于Hakimuddin等（1987)Arch·Biochem·Biophys·259:52以及Edge等（1981)AnaI.Biochem.118:131。酶促法切割ALK1多肽上的碳水化合物部分可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等（1987)Meth.Enzymol.138:350所描述。需要时，可根据所用表达系统的类型来调整ALKl多肽的序列，这是因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞均可引入不同的糖基化模式，这些糖基化模式可受到所述肽的氨基酸序列的影响。一般地，用于人中的ALKl蛋白将表达在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系中，例如HEK293或CHO细胞系，然而预计另一些哺乳动物表达细胞系、昆虫细胞以及含有经改造之糖基化酶的酵母细胞系也可使用。[0081]本公开内容还涵盖了获得突变体的方法，特别是ALKl多肽的组合突变体集合以及截短突变体;组合突变体库尤其可用于鉴定功能性变体序列。筛选这些组合文库的目的可以是获得例如可用作激动剂或拮抗剂的ALKl多肽变体或者具有新活性的ALK1多肽变体。以下提供了多种筛选测定，这样的测定可用于评价变体。例如，可根据结合ALKl配体之能力、阻止ALKl配体与ALKl多肽结合或者干扰ALKl配体引起之信号传导的能力来筛选ALKl多肽变体。ALKl多肽或其变体的活性还可以在基于细胞的或者体内测定中进行测试，尤其是实施例中公开的任何测定。[0082]可获得源于组合的变体，其具有相对于ALKlECD多肽(其包含天然ALKl多肽的细胞外结构域)来说选择性的或普遍提高的效力。同样，可通过诱变来获得血清半衰期显著不同于对应野生型ALKlECD多肽的变体。例如，可使经改变的蛋白质对蛋白水解降解或者导致天然ALKlECD多肽破坏、清除或失活的其它过程更稳定或更不稳定。可利用这样的变体和编码其的基因通过调节ALKl多肽的半衰期来改变ALKlECD多肽水平。例如，短半衰期可带来更短暂的生物学效应，并可更严格地控制患者体内的重组ALKlE⑶多肽水平。在Fc融合蛋白中，可在接头(如果存在的话)和/或Fc部分形成突变以改变该蛋白质的半衰期。[0083]可通过编码多肽文库之基因的简并文库来得到组合文库，所述多肽均包含潜在ALKl多肽序列的至少一部分。例如，可将合成寡核苷酸混合物酶促连接进基因序列，从而潜在ALKl多肽核苷酸序列的简并集合可表达为单独的肽，或者表达为一组较大的融合蛋白(例如，用于噬菌体展示）。[0084]可通过许多方法从简并寡核苷酸序列得到潜在ALKlE⑶变体的文库。可以在自动DNA合成仪中化学合成简并基因序列，然后将合成基因连接进合适的表达载体。简并寡核苷酸的合成在本领域是公知的（参见，例如Narang，SA(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等，(1981)RecombinantDNA，Proc.第3版ClevelandSympos.Macromolecules，ed.AGWalton，Amsterdam:Elsevier273-289页；Itakura等，（1984)Annu·Rev·Biochem·53:323;Itakura等，（1984)Science198:1056;Ike等，（1983)NucleicAcidRes.ll:477)。这样的技术已用于其它蛋白质的定向演化中（参见，例如Scott等，（1990)Science249:386-390;Roberts等，（1992)PNASUSA89:2429-2433;Devlin等，（1990)Science249:404-406;Cwirla等，(1990)PNASUSA87:6378-6382;以及美国专利N〇:5,223,409、5,198,346和5,096,815)。[0085]或者，可利用其它形式的诱变来得到组合文库。例如，可通过使用例如丙氨酸扫描诱变及类似方法（Ruf等，（1994)Biochemistry33:1565_1572;Wang等，（1994)J.Biol·Chem.269:3095-3099;Balint等，（1993)Genel37:109-118;Grodberg等，（1993)Eur·J·Biochem·218:597-601;Nagashima等，（1993)J·Biol·Chem·268:2888-2892;Lowman等，（1991)Biochemistry30:10832-10838;和Cunningham等，（1989)Science244:1081-1085)、接头扫描诱变（linkerscanningmutagenesis)(Gustin等，（1993)Virology193:653-660;Brown等，（1992)Mol·CellBiol·12:2644-2652;McKnight等，（1982)Science232:316)、饱和诱变（saturationmutagenesis)(Meyers等，（1986)Science232:613)、PCR诱变（Leung等，（1989)MethodCellMolBiol1:11-19)或随机诱变包括化学诱变等(Miller等，（1992)AShortCourseinBacterialGenetics,CSHLPress,ColdSpringHarbor，NY;和Greener等，（1994)StrategiesinMolBiol7:32-34)来筛选而从文库产生并分离出ALKl多肽变体。接头扫描诱变(特别是在组合的背景下进行的）是鉴定ALKl多肽截短(生物活性)形式的诱人方法。[0086]本领域已知多种用于筛选由点突变和截短形成的组合文库之基因产物的技术，以及就此而言已知多种用于针对具有特定性质之基因产物筛选cDNA文库的技术。这样的技术一般适用于快速筛选由组合诱变ALKl多肽获得的基因文库。筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括:将基因文库克隆进可复制的表达载体中；用得到的文库载体转化合适的细胞；以及在下述条件下表达组合基因，所述条件即在此条件下对期望活性的检测使得分离编码其产物被检测之基因的载体相对容易。优选的测定包括ALKl配体结合测定和配体介导的细胞信号传导测定。[0087]在一些实施方案中，本公开内容的ALKlE⑶多肽还可包含除了ALKl多肽中天然存在的之外的翻译后修饰。这样的修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。结果，经修饰的ALKlE⑶多肽可包含非氨基酸组分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸。这样的非氨基酸组分对ALKlE⑶多肽功能的作用可如本文针对其它ALKlE⑶多肽变体所述的那样进行测试。当ALKlECD多肽通过对ALKl多肽初始形式进行切割在细胞中产生时，翻译后加工对于正确折叠和/或蛋白质功能可能也是重要的。不同的细胞(例如〇10、他1^、1?)〇(、293、1138、肌!1-313或冊1(293)拥有针对这些翻译后活性的特定细胞机器和特有机制，并且可以选择不同的细胞以确保ALKl多肽的正确修饰和加工。[0088]在一些方面，ALKlE⑶多肽的功能性变体或经修饰形式包括含有ALKlE⑶多肽至少一部分以及一个或多个融合结构域的融合蛋白。这些融合结构域的公知实例包括但不限于多组氣fe、Glu-Glu、谷脫甘妝S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区（Fe)、麦芽糖结合蛋白（MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域使其具备所需特质。例如，某些融合结构域尤其可用于通过亲和层析来分离融合蛋白。为了亲和纯化的目的，针对亲和层析使用了相关基质，例如谷胱甘肽、淀粉酶以及缀合有镍或钴的树脂。许多这样的基质可以"试剂盒"形式得到，例如可用于HIS6融合伴侣的PharmaciaGST纯化系统和QIAexpresss?系统(Qiagen)。另一个实例是，可选择融合结构域从而有利于ALKlE⑶多肽的检测。这些检测结构域的实例包括多种荧光蛋白（例如GFP)以及通常是短肽序列的"表位标签"，针对其的特异性抗体是可用的。特异性单克隆抗体可用的公知表位标签包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域包含蛋白酶切割位点，例如针对FactorXa或凝血酶(Thrombin)的切割位点，这使得相关蛋白酶部分地消化该融合蛋白并因而从中释放重组蛋白。然后，所释放的蛋白通过随后的层析分离得以与融合结构域分离。在一些优选的实施方案中，ALKlECD多肽与在体内稳定ALKl多肽的结构域（"稳定"结构域)融合。"稳定"是指增加血清半衰期，不论是由于减少破坏、减少通过肾的清除还是其它药代动力学效应引起。已知与免疫球蛋白的Fc部分融合会赋予多数蛋白质以理想的药代动力学性质。同样，与人血清白蛋白融合可赋予理想的性质。可选择的其它类型融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能性结构域。[0089]作为一个具体实例，本公开内容提供了包含与Fc结构域融合之ALKl可溶性细胞外结构域的融合蛋白（例如，SEQIDN0:6)。[0090]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*[0091]任选地，Fe结构域在例如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434残基处具有一个或多个突变。在一些情况下，包含一个或多个所述突变(例如Asp-265突变)的突变Fe结构域与野生型Fe结构域相比具有降低的结合Fey受体的能力。在另一些情况下，包含一个或多个所述突变(例如Asn-434突变)的突变Fe结构域与野生型Fe结构域相比具有提高的结合I类MHC相关Fe受体(FcRN)的能力。[0092]应理解，融合蛋白的不同组分可以按照符合所需功能的任何方式排列。例如，ALKlECD多肽可置于外源结构域的C端，或者外源结构域可置于ALKlECD多肽的C端。ALKlECD多肽结构域和外源结构域不需要在融合蛋白中邻接，另外的结构域或氨基酸序列可包含在各结构域的C端或N端或者所述结构域之间。[0093]本文使用的术语"免疫球蛋白Fe区域"或简称"Fc"应理解为是指免疫球蛋白链恒定区（优选免疫球蛋白重链恒定区）的羧基端部分或其一部分。例如，免疫球蛋白Fe区可包含：I)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域;2)CH1结构域和CH2结构域;3)CH1结构域和CH3结构域;4)CH2结构域和CH3结构域;或5)两个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白Fe区域包含至少免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，优选缺少CHl结构域。[0094]在一个实施方案中，所述重链恒定区源自的免疫球蛋白类型是IgG(Igγ)(γ亚型1、2、3或4)。可使用免疫球蛋白的其它类型=IgA(Iga)、IgD(IgS)、IgE(Ige)和IgM(Igy)。有关选择合适的免疫球蛋白重链恒定区的论述详见美国专利No.5，541，087和5，726，044。认为从某些免疫球蛋白类型和亚型选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以实现特定的结果是在本领域技术水平之内的。编码免疫球蛋白Fe区之DNA构建体的一部分优选包含铰链结构域的至少一部分以及优选地Feγ的CH3或者IgA、IgD、IgE或IgM任一中同源结构域的至少一部分。[0095]此外，还考虑到，在本文公开的方法和组合物的实施中，替换或缺失免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸可能是有用的。一个实例是在上游的CH2区域中引入氨基酸替换以构建与Fe受体亲和力降低的Fe变体(Cole等（1997)J.Immunol·159:3613)。[0096]在一些实施方案中，本公开使得分离和/或纯化形式的ALKlE⑶多肽可用，其从其它蛋白质和/或其它ALKlE⑶多肽种类中分离出来或者基本不含（例如，至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%地不含)其它蛋白质和/或其它ALKlECD多肽种类。[0097]在一些实施方案中，本公开内容包括编码可溶性ALKl多肽的核酸，所述核酸包含ALKl蛋白细胞外部分的编码序列。在另一些实施方案中，本公开内容还涉及包含这些核酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任意原核和真核细胞。例如，本公开内容的多肽可以表达在细菌细胞(例如大肠杆菌）、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达载体）、酵母或哺乳动物细胞中。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。因此，本公开内容的一些实施方案还涉及生产ALKlE⑶多肽的方法。已证实，SEQIDN0:3所示的在CHO细胞中表达的ALKl-Fc融合蛋白具有强的抗血管发生活性。[0098]可如ALKlE⑶蛋白有关描述得到和表征DAN多肽(包括野生型DAN的变体)和包含DAN蛋白的融合蛋白。[0099]3.编码ALKl多肽的核酸[0100]在一些方面中，本公开内容提供了编码包括本文公开的片段、功能性变体和融合蛋白在内的任何ALK1多肽(例如，ALKlE⑶多肽）的分离的和/或重组的核酸。例如，SEQIDN0:2编码天然的人ALKl前体多肽，而SEQIDN0:4编码与IgGlFe结构域融合的ALKl细胞外结构域的前体。所述目标核酸可以是单链的或双链的。这样的核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可用于例如制备ALKl多肽的方法中或用作直接的治疗剂(例如，在反义、RNAi或基因治疗策略中）。[0101]在一些方面中，所述编码ALKl多肽的目标核酸还应理解为包括SEQIDNO:2或4之变体的核酸。变体核苷酸序列包括由于一个或多个核苷酸替换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。[0102]在一些实施方案中，本公开内容提供了分离的或重组的核酸序列，其与SEQIDNO:2或4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。本领域普通技术人员会理解，与SEQIDN0:2或4互补以及与SEQIDN0:2或4的变体互补的核酸序列也在本公开的范围内。在另一些实施方案中，本公开内容的核酸序列可被分离、重组和/或与外源核苷酸序列融合，或者在DNA文库中。[0103]在另一些实施方案中，本公开内容的核酸还包括在高度严格条件下与SEQIDNO:2或4所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列、SEQIDN0:2或4的互补序列或者其片段。如上所述，本领域普通技术人员会容易地理解，促进DNA杂交的合适的严格条件可有不同。例如，可以于约45°C在6.OX氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中进行杂交，然后于50°C用2.OXSSC清洗。例如，所述清洗步骤中的盐浓度可以从低严格的50°C、约2.0XSSC到高严格的50°C、约0.2XSSC之中选择。另外，所述清洗步骤中的温度可从低严格条件的室温(约22°C)提高到高严格条件的约65°C。温度和盐均可变化，或者温度或盐浓度可保持恒定而其它变量发生改变。在一个实施方案中，本公开内容提供了在室温6XSSC的低严格条件下杂交并随后在室温用2XSSC清洗的核酸。[0104]本公开内容的范围还包括由于遗传密码简并性而导致不同于SEQIDN0:2或4所示核酸的核酸。例如，许多氨基酸对应于超过一种的三联体。对应于同一氨基酸的密码子，或称"同义密码子"（例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子），可导致不影响该蛋白之氨基酸序列的"沉默"突变。然而，导致目的蛋白质之氨基酸序列改变的DNA序列多态性预期会存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员会理解，在编码特定蛋白质之核酸的一个或多个核苷酸(多达核苷酸的约3-5%)中的这些变化可能由于天然等位基因变化而存在于给定物种的个体中。任何以及全部这样的核苷酸改变和得到的氨基酸多态性均在本公开内容的范围内。[0105]在一些实施方案中，本公开内容的重组核酸可有效连接至表达构建体的一个或多个调控核苷酸序列。调控核苷酸序列一般会适合于用于表达的宿主细胞。本领域已知针对多种宿主细胞的众多类型的合适表达载体和适当调控序列。通常，所述一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于：启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子(activator)序列。本公开内容涵盖了本领域已知的组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然启动子或者组合了多于一种启动子之元件的杂合启动子。表达构建体可以以附加体(例如质粒）的形式存在于细胞中，或者表达构建体可插入染色体中。在一个优选的实施方案中，表达载体包含选择标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。选择标记基因是本领域周知的，并且随所使用宿主细胞而不同。[0106]在本文公开的一些方面中，目标核酸在包含编码ALKl多肽并与至少一种调控序列有效连接的核苷酸序列的表达载体中提供。调控序列是本领域公知的，并被选择用于指导ALKl多肽的表达。因此，术语"调控序列"包括启动子、增强子和其它表达调控元件。示例性的调控序列描述于Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。例如，在与之有效连接时调控DNA序列表达的许多种表达调控序列中任意一种均可用于这些载体中以表达编码ALKl多肽的DNA序列。这样可用的表达调控序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、表达由T7RNA聚合酶指导的T7启动子、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外被蛋白的调控区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如Ph〇5)、酵母α-接合因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子以及其它已知调控原核或真核细胞或其病毒之基因表达的序列，及其多种组合。应理解，设计表达载体可取决于如下因素：待转化之宿主细胞的选择和/或所需表达之蛋白的类型。并且，还应考虑载体的拷贝数、调控该拷贝数的能力以及该载体编码之任何其它蛋白（例如抗生素标记)的表达。[0107]本公开内容中涉及的重组核酸可通过将所克隆基因或其一部分连接进适于在原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中而产生。用于产生重组ALKl多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括用于在原核细胞(例如大肠杆菌）中表达的如下类型的质粒:PBR322来源的质粒、pEMBL来源的质粒、ρΕΧ来源的质粒、pBTac来源的质粒和pUC来源的质粒。[0108]-些哺乳动物表达载体既包含利于在细菌中扩增载体的原核序列，也包含在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单元。适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例有：pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pk〇-ne〇和pHyg来源的载体。这些载体中的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列进行修饰，以利于在原核和真核细胞中进行复制和药物抗性筛选。或者，病毒例如牛乳头瘤病毒(BPV-I)或EB病毒的衍生物(pHEBo、pREP来源的以及p205)可用于在真核细胞中瞬时表达蛋白。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可见于以下对基因治疗递送系统的描述。用于制备质粒和转化宿主生物的各种方法是本领域周知的。对于其它针对原核和真核细胞的合适表达系统以及通用重组方法，参见Sambrook，Fritsch和Maniatis编著的MolecularCloningALaboratoryManual，第3版（ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)。在一些情况下，通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽可能是理想的。这样的杆状病毒表达系统的实例包括PVL来源的载体（例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW来源的载体(例如pAcUWl)和pBlueBac来源的载体(例如含β-gal的pBlueBacIII)。[0109]在一个优选的实施方案中，载体被设计成用于在CHO细胞中产生目的ALKl多肽，例如Pcmv-Script载体（Stratagene，LaJ。11a，Calif.)、pcDNA4载体（Invitrogen，CarIsbad，Calif·)和pCI-neo载体(Promega，Madison，Wisc.)。很明显，可使用目的基因构建体使目的ALKl多肽在培养扩增的细胞中表达，从而例如产生用于纯化的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白。[0110]本公开内容还涉及转染有包含编码序列（例如，SEQIDNO:2或4)之重组基因的宿主细胞，所述编码序列针对一种或多种目的ALKl多肽。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文公开的ALKl多肽可表达于细菌细胞(例如大肠杆菌）、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统）、酵母或哺乳动物细胞中。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。[0111]因此，本公开内容还涉及产生目的ALKl多肽(包括ALKlE⑶多肽)的方法。例如，可以在合适的条件下培养转染有编码ALKl多肽之表达载体的宿主细胞以表达ALKl多肽。所述ALKl多肽可从含有ALKl多肽的细胞和培养基混合物中泌出并分离。或者，ALKl多肽可保留在细胞质中或膜级分中，收集、裂解细胞并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域公知的。可使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术来从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离出目的ALKl多肽，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、使用特异性针对ALKl多肽之特定表位的抗体的免疫亲和纯化以及使用与融合到ALKl多肽之结构域结合的试剂的亲和纯化(例如，可使用蛋白A柱来纯化ALKl-Fc融合蛋白）。在一个优选的实施方案中，所述ALKl多肽是含有利于其纯化之结构域的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，通过一系列柱层析步骤来实现纯化，包括例如下述的三种或更多种:蛋白A层析、Qsepharose层析、phenylsepharose层析、大小排阻层析和阳离子交换层析。可以通过病毒过滤（viralfiltration)和缓冲液交换(bufferexchange)来完成纯化。[0112]在另一实施方案中，编码纯化用前导序列(例如在重组ALKl多肽所需部分之N端的多-(His)/肠激酶切割位点序列）的融合基因可允许使用Ni2+金属树脂的亲和层析来纯化所表达的融合蛋白。然后，可通过用肠激酶处理来除去所述纯化用前导序列，以提供经纯化的ALKl多肽（例如，参见Hochuli等，（1987)J·Chromatography411:177以及Janknecht等，PNASUSA88:8972)。[0113]用于制备融合基因的技术是周知的。实质上，按照常规技术对编码不同多肽序列的多种DNA片段进行连接，其使用平末端或交错末端（stagger-end)进行连接，使用限制酶消化以提供合适的末端，需要时填补粘性末端，用碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶促连接。在另一实施方案中，可通过常规技术(包括自动DNA合成仪)来合成融合基因。或者，可使用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，所述锚定引物产生了两个连续基因片段之间的互补突出端，所述突出端可随后退火以得到嵌合基因序列（参见，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等编著，JohnWiley&Sons:1992)〇[0114]41^1、81^9、81^10、60?5、0^6或0^7之拮抗剂的各类核酸化合物的实例包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物还可包括突出端或非互补的区域，在此处一条链或另一条链是单链的。单链化合物可包括自身互补的区域，即该化合物的双螺旋结构区域形成所谓"发夹"或"茎环"结构。核酸化合物可包含与由全长ALKl核酸序列或配体核酸序列之至多1000、至多500、至多250、至多100或至多50、35、30、25、22、20或18个核苷酸组成的区域互补的核苷酸序列。互补区域优选为至少8个核苷酸，任选地至少10个或至少15个核苷酸，任选地在15到25个核苷酸之间。互补区域可落入靶转录物的内含子、编码序列或非编码序列内，例如编码序列部分。一般地，核酸化合物的长度为约8至约500个核苷酸或碱基对，任选地其长度为约14至约50个核苷酸。核酸可以是DNA(特别是用作反义核酸时）、RNA或RNA:DNA杂合物。任何一条链可包含DNA和RNA混合物，以及不能简单归类为DNA或RNA的经修饰形式。同样，双链化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA，任何一条链也可包含DNA和RNA混合物以及不能简单归类为DNA或RNA的经修饰形式。核酸化合物可包含多种修饰中的任意种，包括对骨架(天然核酸的糖-磷酸部分，包括核苷酸间连接)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分）的一种或多种修饰。反义核酸化合物优选具有约15至约30个核苷酸的长度，并常包含一种或多种修饰以改善性质，例如在血清中、在细胞中或者在该化合物可能被递送至的位置(例如，在经口递送化合物情形中的胃部，对吸入型化合物来说的肺部）的稳定性。在RNAi构建体的情形中，与靶转录物互补的链一般是RNA或其修饰物。另一条链可以是RNA、DNA或任何其它变化形式。双链或单链"发夹"RNAi构建体的双链体部分优选具有18~40个核苷酸的长度，任选地约21~23个核苷酸长度，只要其可作为Dicer的底物即可。催化性或酶促性核酸可以是核酶或DNA酶，还可包括经修饰的形式。当在生理条件下以及在无义或有义对照很少或没有作用的浓度下与细胞接触时，核酸化合物可抑制靶标表达约50%、75%、90%或更多。测试核酸化合物效应的优选浓度为1、5和10微摩尔/升。还可测试核酸化合物例如针对血管发生的作用。[0115]编码DAN多肽(包括野生型DAN之变体)的核酸以及编码含有DAN蛋白之融合蛋白的核酸可如上有关编码ALKlE⑶蛋白之核酸所述产生以及表征。[0116]4·抗体[0117]本公开内容的另一方面涉及与ALKl多肽细胞外部分反应的抗体，优选特异性与ALK1多肽反应的抗体。在一个优选的实施方案中，这样的抗体可干扰ALK1与配体（例如GDF5、GDF6、⑶F7、BMP-9或BMP-10)的结合。应理解，针对ALKl配体的抗体应结合成熟的、经加工形式的相应蛋白质。本公开内容还提供了与⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP-9和/或BMP-10结合并抑制ALKl与这些配体结合的抗体。优选的抗体会在生物测定(例如CAM测定或角膜微囊袋测定，参见上文）中表现出抗血管发生活性。[0118]本文使用的术语"抗体"意在包括全部抗体，例如任何同种型（IgG、IgA、IgM、IgE等），并包括与所选抗原反应的免疫球蛋白之片段或结构域。可使用常规技术将抗体片段化，并筛选可用的和/或与目标特定表位相互作用的片段。因此，该术语包括抗体分子的经蛋白水解切割或重组制备部分的片段，并且该片段能够选择性地与某些蛋白质反应。这些蛋白水解和/或重组的片段之非限制性实例包括Fab、F(ab'）2、Fab'、Fv以及含有由肽接头连接之V[L]和/或V[H]结构域的单链抗体(scFv)。所述scFv可共价或非共价连接以形成具有两个或多个结合位点的抗体。术语"抗体"还包括多克隆、单克隆或者抗体和重组抗体的其它纯化制备物。术语"重组抗体"是指从使用分子生物学技术构建的核酸表达的抗体或免疫球蛋白之抗原结合结构域，例如从单链抗体开发而来的人源化抗体或完全人抗体。单结构域和单链抗体也涵盖在术语"重组抗体"的范围内。[0119]抗体可通过本领域已知的多种方法中任一种来产生，包括向动物施用抗原，向携带了人免疫球蛋白基因的动物施用抗原，或者用抗原针对抗体(常常为单链抗体或抗体结构域)文库进行筛选。一经检测到抗原结合活性，则可将蛋白质的相应部分移植进其它抗体框架中，包括全长IgG框架。例如，通过使用源自ALKl多肽或ALKl配体的免疫原，可利用标准方案（参见，例如Harlow和Lane编著的Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress:1988))来制备抗蛋白/抗肽的抗血清或单克隆抗体。可使用免疫原形式的肽(例如，ALKl多肽，或能够引发抗体应答的抗原片段，或融合蛋白）来免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔。对蛋白质或肽赋予免疫原性的技术包括与载体缀合或其它本领域公知的技术。可在佐剂存在时施用ALKl多肽的免疫原性部分(优选细胞外部分）。可通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫过程。可利用免疫原作为抗原使用标准ELISA或其它免疫测定来评价抗体水平。[0120]在用ALK1多肽的抗原制备物免疫动物后，可获得抗ALK1抗血清，如果需要的话，可从该血清中分离出抗ALKl抗体。为了产生单克隆抗体，可从经免疫动物收集产抗体细胞(淋巴细胞），通过标准体细胞融合步骤与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合以得到杂交瘤细胞。这样的技术是本领域公知的，包括例如杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein，（1975)Nature，256:495-497开发）、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，（1983)ImmunologyToday，4:72)以及产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，（1985)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.77-96页）。可通过免疫化学方法来筛选杂交瘤，以产生与本公开内容之哺乳动物ALKl多肽特异性反应的抗体以及从包含所述杂交瘤细胞之培养物分离出的单克隆抗体。[0121]本文使用的术语"抗体"意在包括同样与目标ALKl多肽之一特异性反应的其片段。可使用常规技术将抗体片段化，用来以与上述针对完整抗体同样的方式筛选可用的片段。例如，可通过用胃蛋白酶处理得到F(ab)2片段。可处理所得的F(ab)2片段以还原二硫桥，从而得到Fab片段。本公开内容的抗体还意在包括对ALKl多肽具有亲和力(其由抗体的至少一个CDR区域所赋予）的双特异性、单链、嵌合以及人源化的分子。在一些优选的实施方案中，所述抗体还包含与其连接并能够被检出的标签(例如，所述标签可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子）。[0122]在一些优选的实施方案中，本公开内容的抗体是重组抗体，特别是人源化单克隆抗体或完全人重组抗体。[0123]如本领域一般所理解地，涉及抗体时使用的"与……特异性反应"意在指抗体在目标抗原(例如，ALKl多肽或ALKl配体)与其它非目标抗原之间具有足够的选择性，因此该抗体至少可用于检测特定类型生物样品中目标抗原的存在。在一些使用抗体的方法中，较高程度的结合特异性可能是理想的。例如，如果抗体在目标抗原和其它交叉反应物之间具有较高程度的选择性，则其在一种或多种非常高丰度的非目标蛋白存在下检测低丰度目标蛋白时可表现得更好。单克隆抗体一般可更好地(与多克隆抗体相比)有效区分期望抗原和交叉反应性多肽。另外，有效用于在一类生物样品（例如，粪便样品）中选择性鉴定目标抗原的抗体可能在选择性鉴定另一类生物样品（例如，血液样品）中的相同抗原时无法同样有效。同样，有效用于鉴定纯化蛋白制备物(其不含其它生物杂质）中目标抗原的抗体可能在鉴定粗制生物样品中的目标抗原时无法同样有效。因此，在一些优选的实施方案中，本申请提供了已证实其对抗体使用时可能选择之样品类型中的目标抗原具有特异性的抗体。[0124]影响抗体-抗原相互作用特异性的一个特征是抗体对抗原的亲和力。尽管实现所需特异性要在一定的亲和力范围内，但是优选抗体一般具有(解离常数)约为10-6、10-7、1〇一8、10_9或更低数值的亲和力。鉴于TGFP对ALKl的明显低的结合亲和力，预期许多抗ALKl抗体会抑制TGF0结合。然而，⑶F5、6、7的配体群以约5XI(T8M的Kd结合，BMP9、10配体以约IXHT1t3M的Kd结合。因此，可选择具有适当亲和力的抗体来干扰这些配体的信号传导活性。[0125]此外，用于筛选抗体以鉴别所需抗体的技术可影响所获得抗体的性质。例如，用于某些治疗目的的抗体优选地能够靶向特定细胞类型。因此，为了获得这类抗体，可能需要筛选与表达目标抗原之细胞结合的抗体(例如，通过荧光激活细胞分选来实现）。同样，如果抗体是用于结合溶液中的抗原，可能需要测试溶液结合。多种不同的测试抗体-抗原相互作用以鉴别特别理想之抗体的技术是可用的。这样的技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定（例如，Biacore结合测定，Bia-coreAB，Uppsala，Sweden)、夹心法测定（例如，IGENInternational，Inc·，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠系统）、western印迹、免疫沉淀测定和免疫组化。[0126]5.抗体和Fc融合蛋白中的改变[0127]本申请还提供了具有经改造或改变之Fc区域的抗体、ALKl-Fc融合蛋白和DAN-Fc融合蛋白。这样的抗体和Fc融合蛋白可用于例如调节效应子功能，例如抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，所述修饰可改善抗体和Fc融合蛋白的稳定性。通过将合适的核苷酸改变引入DNA或通过肽合成来制备所述抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列变体。这样的变体包括例如在本文公开的抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或替换残基。可进行缺失、插入和替换的任意组合以形成最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征。氨基酸变化还可改变抗体和Fc融合蛋白的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。[0128]效应子功能降低的抗体和Fc融合蛋白可通过在氨基酸序列中引入改变来产生，所述改变包括但不限于Bluestone等所述的Ala-Ala突变(参见WO94/28027和WO98/47531;还参见Xu等2000CellImmunol200;16-26)。因此，在一些实施方案中，在恒定区内具有突变(包括Ala-Ala突变）的本公开内容之抗体和Fc融合蛋白可用于降低或消除效应子功能。根据这些实施方案，抗体和Fc融合蛋白可包含234位的丙氨酸突变或235位的丙氨酸突变，或者其组合。在一个实施方案中，所述抗体或Fc融合蛋白包含IgG4框架，其中Ala-Ala突变为在234位从苯丙氨酸突变为丙氨酸和/或235位从亮氨酸突变为丙氨酸。在另一实施方案中，所述抗体或Fc融合蛋白包含IgGl框架，其中Ala-Ala突变表示在234位从亮氨酸突变为丙氨酸和/或235位从亮氨酸突变为丙氨酸。所述抗体或Fc融合蛋白可作为替代地或另外地携带其它突变，包括CH2结构域中的点突变K322A(Hezareh等2001JVirol.75:12161-8)。[0129]在一些具体实施方案中，可对所述抗体或Fe融合蛋白进行修饰使其增强或抑制补体依赖性细胞毒性(CDC)。可通过在Fc区域中引入一个或多个氨基酸替换、插入或缺失来实现⑶C活性的调节(参见，例如美国专利No.6,194,551)。作为替代地或另外地，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。因此，所得到的同源二聚体抗体可具有提高的或降低的内化能力和/或增强的或减弱的补体介导之细胞杀伤。参见，Caron等，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol·148:2918-2922(1992)，W099/51642，Duncan&WinterNature322:738-40(1988);美国专利No·5，648，260;美国专利No·5，624，821以及W094/29351。[0130]6.调节血管发生、周细胞包裹和某些疾病的方法和组合物[0131]本公开内容提供了抑制哺乳动物中血管发生和/或提高周细胞包裹的方法，其通过向对象施用有效量的此后统称为"治疗剂"的ALKlE⑶多肽(例如ALKl-Fc融合蛋白）、DAN蛋白（例如DAN-Fc融合蛋白）、本文公开的抗体(例如针对⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9、BMPl0或ALKlECD的抗体)或任何前述核酸拮抗物(例如，反义核酸或siRNA)来实现。所展示数据具体表明，本文公开的抗血管发生治疗剂可用于抑制哺乳动物眼中的血管发生。预期这些治疗剂还可用于抑制骨和关节以及肿瘤中的血管发生，尤其是与骨和关节有关的肿瘤。[0132]血管发生相关疾病包括但不限于血管发生依赖性癌症，其包括例如实体瘤、血源性肿瘤(例如白血病)和肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤(acousticneuroma)、神经纤维瘤(neurofibroma)、沙眼（trachoma)和化胺性肉芽肿（pyogenicgranuloma);类风湿性关节炎;银肩病;红变(rubeosis);奥斯勒-韦伯综合征(Osler-WebberSyndrome);心肌血管发生（myocardialangiogenesis);动脉粥样斑块新血管形成（plaqueneovascularization);毛细血管扩张（telangiectasia);血友病性关节（hemophiIiacjoint)和血管纤维瘤(angiofibroma)。[0133]特别地，本公开内容的多肽治疗剂可用于治疗或预防癌症（肿瘤），特别是已知依赖于血管发生过程来支持生长的那些癌症。与大多数抗血管发生剂不同的是，ALKlE⑶多肽影响由多种因素引起的血管发生。这与癌症中的情况非常吻合，在癌症中常需要多种因素来支持肿瘤血管发生。因此，本文公开的治疗剂特别有效地用于治疗对于靶向单一血管发生因素之药物(例如，靶向VEGF的贝伐单抗)治疗具有抗性的肿瘤。如本文证明地，ALKl-Fc融合蛋白有效用于减轻黑素瘤、肺癌、胰腺癌（如，胰腺内分泌组织肿瘤）、多发性骨髓瘤和乳腺癌(例如，原发性乳腺癌或转移性乳腺癌;雌激素受体阳性(ER+)或雌激素受体阴性(ER-))的病理作用。[0134]多发性骨髓瘤被普遍认为是包括显著的血管发生要素的癌症。因此，预期ALKl-Fc融合蛋白和本文公开的其它治疗剂可用于治疗多发性骨髓瘤和与骨相关的其它肿瘤。如本文所证明地，本文公开的治疗剂可用于改善与多发性骨髓瘤相关的骨损伤，并且因此可用于减轻与其它肿瘤(例如乳腺癌或前列腺癌)之骨转移有关的骨损伤。如本文指出地，GDF5-7配体在骨中高度表达，不希望受任何具体机制的约束，干扰这些配体可破坏骨中肿瘤发展所需的过程。[0135]在所述方法的一些实施方案中，可一起（同时)或在不同时间（依次地)施用一种或多种多肽治疗剂。另外，多肽治疗剂可与另一类治疗癌症或抑制血管发生的化合物一起施用。[0136]在一些实施方案中，本公开内容的主题方法可单独使用。或者，可将所述主题方法与其它用于治疗或预防增殖性疾病(例如肿瘤）的常规抗癌治疗法组合使用。例如，这些方法可用于预防癌症、预防癌症复发和手术后转移，以及作为其它癌症治疗的辅助手段。本公开内容表明，可通过使用目标多肽治疗剂来增强常规癌症治疗(例如，化疗、放疗、光疗、免疫疗法和手术)的有效性。[0137]众多的常规化合物已显示出具有抗肿瘤活性。这些化合物已用作化疗中的药剂来缩小实体瘤、预防转移及进一步生长或者降低白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数目。尽管化疗已有效用于治疗多种类型的恶性肿瘤，但是许多抗肿瘤化合物会诱导有害副作用。已显示，当联合应用两种或更多种不同的治疗时，这些治疗可协同作用并使每种治疗的剂量降低，从而降低了每种化合物在较高剂量下的有害副作用。在另一些情况下，对某种治疗具有"难治性"的恶性肿瘤可对包括两种或多种不同治疗的组合治疗产生反应。[0138]当将本文公开的多肽治疗剂与另一常规抗肿瘤药剂（同时或依次)联合施用时，这些治疗剂可提高该抗肿瘤药剂的治疗效果或者克服对该抗肿瘤药剂的细胞抗性。这允许减少抗肿瘤药剂的剂量，从而降低有害副作用，或者恢复抗肿瘤药剂在抗性细胞中的有效性。[0139]根据本公开内容，本文所述的抗血管发生药剂可与其它治疗疾病的组合物和方法联合使用。例如，可使用与ALKl或ALKl配体拮抗剂相联合的手术、放疗或化疗来常规地治疗肿瘤，随后向患者施用该诘抗剂以延长微转移(micrometastasis)的休眠以及稳定任何残余的原发肿瘤。[0140]还可以将血管发生抑制剂预防性地给予已知具有发生新发癌症或复发癌症高风险的个体。因此，本公开内容的一个方面包括在对象中预防癌症发生的方法，所述方法包括向该对象施用有效量的ALKl或ALKl配体拮抗剂和/或其衍生物或者本公开内容的另一种血管发生抑制剂。[0141]如本文所证明地，ALKl-Fc有效用于减轻类风湿性关节炎小鼠模型的表型。因此，本文公开的治疗剂可用于治疗类风湿性关节炎和其它类型的骨或关节炎症。[0142]某些正常的生理过程也与血管发生有关，例如排卵、月经和胎盘形成。本公开内容的血管发生抑制蛋白可用于治疗过度或异常刺激内皮细胞的疾病。这些疾病包括但不限于肠粘连、动脉粥样硬化、硬皮病和肥厚性瘢痕（即瘢痕疙瘩）。它们还可用于治疗以血管发生为病理性后果的疾病，例如猫抓病(catscratchdisease)(Rocheleminaliaquintosa)和溃疡(幽门螺杆菌(1^1；[(3(^3(^61口7101'；0)。[0143]-般的血管发生抑制蛋白可用作生育控制剂，其通过降低或阻止胚胎着床所需的子宫血管发生来实现。因此当将足以阻止胚胎着床之量的所述抑制蛋白施用于雌性个体时，本公开内容提供了有效的生育控制方法。在所述生育控制方法的一个方面，在性交和受精发生前或发生后施用足以阻止胚胎着床之量的所述抑制蛋白，从而提供了生育控制的有效方法，有可能为"房事后施用(morningafter)"的方法。不希望受本说明书的约束，认为抑制子宫内膜的血管生成会干扰胚泡的着床。类似的对输卵管粘膜血管生成的抑制会干扰胚泡的着床，防止输卵管妊娠的发生。施用方法可包括但不限于药片、注射(静脉内、皮下、肌内）、栓剂、阴道海绵(vaginalsponge)、阴道棉条(vaginaltampon)和子宫内装置。还认为，施用本公开内容的血管发生抑制剂会干扰胎盘的正常血管生成增加，还会干扰成功着床的胚泡以及发育中胚胎和胎儿内的血管发育。[0144]在眼中，血管发生与例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病(retinopathyofprematurity)、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶状体后纤维增生症(retrolentalfibroplasia)相关。本文公开的治疗剂可在眼内施用或通过其它施用至眼的局部施用来实现。另外，如实施例中所示，ALKl-Fc可全身施用，仍可对眼部血管发生具有期望效果。[0145]与眼中血管发生有关的其它疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎（epidemickeratoconiunctivitis)、维生素A缺乏症（VitaminAdeficiency)、隐形眼镜过戴(contactlensoverwear)、特应性角膜炎（atopickeratitis)、上边缘角膜炎（superiorlimbickeratitis)、干燥性翼状胬肉角膜炎（pterygiumkeratitissicca)、舍格伦病(sjogren)、玫瑰痤疮（acnerosacea)、小水疱病、梅毒（syphilis)、分支杆菌感染(Mycobacteriainfection)、脂质变性（lipiddegeneration)、化学烧伤、细菌性溃疡(bacterialulcer)、真菌性溃疡（fungalulcer)、单纯疱疼感染（Herpessimplexinfection)、带状疱疼感染（Herpeszosterinfection)、原生动物感染（protozoaninfection)、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、莫伦溃疡(Moorenulcer)、Terrie角膜边缘性变性（Terrien'smarginaldegeneration)、边缘性角质分离（mariginalkeratolysis)、类风湿性关节炎、系统性狼疮（systemiclupus)、多动脉炎（polyarteritis)、创伤(trauma)、韦格纳结节病(Wegenerssarcoidosis)、巩膜炎(Scleritis)、史-约病(Stever/sJohnsondisease)、类天疱疮放射状角膜切开术(periphigoidradialkeratotomy)和角膜移植排斥(cornealgraftreiection)、镰状细胞贫血(sicklecellanemia)、结节病(sarcoid)、弹性假黄瘤（pseudoxanthomaelasticum)、佩吉特病（Pagetsdisease)、静脉阻塞（veinocclusion)、动脉阻塞（arteryocclusion)、颈动脉阻塞性疾病（carotidobstructivedisease)、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎(chronicuveitis/vitritis)、分支杆菌感染(mycobacterialinfections)、莱姆病（Lyme'sdisease)、系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosis)、早产儿视网膜病（retinopathyofprematurity)、伊尔斯病(Ealesdisease)、白塞病（Bechetsdisease)、导致视网膜炎(retinitis)或脉络膜炎(choroiditis)的感染、假定的眼组织胞衆菌病(presumedocularhistoplasmosis)、贝斯特病（Bestsdisease)、近视（myopia)、视凹（opticpit)、斯达加特病（Stargartsdisease)、睫状体平坦部炎（parsplanitis)、慢性视网膜脱落（chronicretinaldetachment)、高粘滞综合征（hyperviscositysyndromes)、弓形体病（toxoplasmosis)、创伤(trauma)和激光手术后并发症(post-lasercomplication)。其它疾病包括但不限于与红变（角新生血管（neovasculariationoftheangle))有关的疾病以及由纤维血管(fibrovascular)或纤维组织(fibroustissue)异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病('^廿60代1：；[11(^31：1150。[0146]可通过以下方式来治疗或预防眼部病症，例如通过治疗剂的全身、局部、眼内注射或通过植入释放治疗剂的持续释放装置来实现。可利用可药用眼科装置来递送治疗剂，从而使该化合物与眼表面维持接触足够的时间以使该化合物穿透眼的角膜和内部区域(例如前房（anteriorchamber)、后房（posteriorchamber)、玻璃体（vitreousbody)、房水(aqueoushumor)、玻璃体液（vitreoushumor)、角膜（cornea)、虹膜/睫状体（iris/ciliary)、晶状体、脉络膜/视网膜(choroid/retina)和巩膜(sclera)。所述可药用的眼科载体可以是例如软膏、植物油或包裹材料。或者，本公开内容的治疗剂可直接注射进玻璃体液或房水中。在另一替代性方案中，可全身施用所述化合物进行眼部治疗，例如通过静脉内输注或注射来实现。[0147]可施用一种或多种治疗剂。本公开内容的方法还包括与用于治疗眼部病症的其它药物共施用。当施用多于一种药剂或者药剂和药物组合时，可同时施用或依时间前后施用。可通过不同施用途径或通过同样的施用途径来施用所述治疗剂和/或药物。在一个实施方案中，治疗剂和药物以眼科药物制剂的形式一起施用。[0148]在一个实施方案中，使用治疗剂来治疗与眼中血管发生有关的疾病，其通过与利用药物机制阻断血管发生的其它药物同时施用来实现。可与本公开内容的治疗剂同时施用的药物包括但不限于：倍加他尼（Macugen?)、雷珠单抗（Lucentis?)、乳酸角鲨胺(squalaminelactate)(EvizonTM)、肝素酶(heparinase)和糖皮质激素（例如曲安西龙(Triamcinolone))。在一个实施方案中，提供了治疗血管发生相关疾病的方法，其通过施用含有至少一种本文公开之治疗剂和至少一种以下药物的眼科药物制剂来治疗：倍加他尼(Macugen?)、雷珠单抗(Lucentis?)、乳酸角藍胺(Evizon?)、肝素酶和糖皮质激素(例如曲安西龙）。[0149]7.制剂和有效剂量[0150]可将本文所述的治疗剂配制成药物组合物。按照本公开内容使用的药物组合物可使用一种或多种生理可接受的载体或赋形剂以常规方式进行配制。这样的制剂通常基本不含热原，以符合大多数法规要求。[0151]在一些实施方案中，本公开内容的治疗方法包括全身性或者作为植入物或装置局部地施用所述组合物。当施用时，本公开内容中使用的治疗组合物是无热原、生理可接受的形式。组合物中除ALKl信号传导拮抗剂以外的可任选含有的上述治疗用药剂可与本文公开之方法中的目的化合物（例如，本文公开的ALKlECD多肽或任何抗体）同时施用或依次施用。[0152]通常，本文公开的蛋白质治疗剂经胃肠外施用，特别是静脉内或皮下施用。适于胃肠外施用的药物组合物可包含一种或多种ALKlECD多肽或其它抗体并联合一种或多种药物可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散体系、混悬液或乳剂、或可在使用前被重构成无菌注射用溶液或分散体系的无菌粉末，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与目标接受者之血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。本公开内容的药物组合物中可用的合适的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当的混合物、植物油（例如橄榄油）以及可注射有机酯（例如油酸乙酯）。可保持适当的流动性，例如通过使用涂层物质（例如卵磷脂）、（在胶体溶液的情形中）通过保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来实现。[0153]在一个实施方案中，本文公开的抗体和ALKlE⑶蛋白采用眼科药物制剂的形式来施用。在一些实施方案中，所述眼科药物制剂是无菌水溶液(优选合适的注射用浓度)或者油膏（salve)或软膏(ointment)。这样的油膏或软膏通常包含溶于或悬于无菌可药用油膏或软膏基质（例如矿物油-白凡士林基质）中的一种或多种本文公开的抗体或ALKlECD蛋白。在油膏或软膏组合物中，所述制剂中还可包含无水羊毛脂。硫柳汞或氯代丁醇也优选作为抗微生物剂被添加至所述软膏组合物中。在一个实施方案中，所述无菌水溶液描述于美国专利No.6,071,958中。[0154]本公开内容提供了包含酸和碱以调节pH的可变化的制剂;将pH保持在一窄范围内的缓冲剂。可将另外的药物添加至所述制剂中。这些药物包括但不限于倍加他尼、肝素酶、雷珠单抗或糖皮质激素。通过无菌操作来制备本公开内容的眼科药物制剂，或者在制备的适当阶段进行灭菌处理。[0155]如果需要，所述组合物和制剂可采用包(盒、袋)或分配装置的形式提供，其可包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。所述包(盒、袋)可例如包含金属箱或塑料箱，例如吸塑包装(blisterpack)。所述包(盒、袋)或分配装置可带有施用说明。[0156]实施例[0157]实施例1=ALKl-Fc融合蛋白的表达[0158]【申请人】构建了包含融合有人Fc的人ALKl细胞外结构域或融合有小鼠Fc结构域的小鼠ALKl的可溶性ALKl融合蛋白，其中所述ALKl和Fc结构域之间具有最小接头。所述构建体分别表示为MLKl-Fc^PmALKl-Fc0[0159]图3显示从CHO细胞系纯化的hALKl-Fc(SEQIDN0:3)。值得注意的是，尽管惯常的人ALKl蛋白细胞外结构域C端是SEQIDNO:1的118位氨基酸，但我们已证实避免以谷氨酰胺残基结尾的结构域是理想的。因此，源自人ALKl的SEQIDNO:3的部分在Ql18之C端并入两个残基一一亮氨酸和丙氨酸。因此，本公开内容提供了ALKlECD多肽(包含Fc融合蛋白），其ALKl来源序列的C端包含Q118上游(SEQIDNO:1的113-117位)或下游（119-123位)的1~5个氨基酸。[0160]所述hALKl-Fc和mALKl-Fc蛋白表达在CHO细胞系中。考虑三种不同的前导序列：：[0161](i)蜜蜂蜂毒素(HBML):MKFLVNVALVFMWYISYIYA(SEQIDN0:7);[0162](ii)组织型纤维蛋白溶酶原激活蛋白（tissueplasminogenactivator，TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQIDNO：8)；[0163](iii)天然的：MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG(SEQIDN0:9)。[0164]所选形式使用了TPA前导序列并具有图4中所示的未加工氨基酸序列（SEQIDNO:5)〇[0165]该多肽由图4中所示核酸序列（SEQIDN0:4)编码。[0166]可通过一系列柱层析步骤实现纯化，包括例如采用任何顺序的以下中三种或更多种：蛋白A层析、Qsepharose层析、phenylsepharose层析、大小排阻层析和阳离子交换层析。可使用病毒过滤和缓冲剂交换来完成纯化。将MLKl-Fc蛋白纯化至纯度>98%(通过大小排阻层析来确定）以及>95%(通过SDSPAGE来确定）。[0167]在蛋白质产生和纯化过程中，我们观察到，尽管在变性、还原性条件下(例如，还原性SDS-PAGE)hALKl-Fc显示为纯的，但其倾向于以二聚体与更高级聚集体的混合物表达，这会对向患者施用带来问题。所述聚集体可以是免疫原性的或生物利用度低的，并且由于其不均一性，这些聚集体难以赋予药物制剂以药物开发期望水平的特征。因此，已测试多种方法来降低最终制剂中聚集体的量。[0168]在一个方法中，测试了多种不同的细胞培养基。ISCHO-CD(货号91119，IrvineScientific，SantaAna，CA)显示显著降低了聚集体产物的产生，同时保持了hALKl-Fc的高水平产生。此外，在pH8.0将材料从疏水相互作用柱(如苯基琼脂糖)进行洗脱使得聚集产物进一步分离。所得的材料包含超过99%的二聚体。与R&DSystems(货号370-AL，Minneapolis，MN)所售ALKl-Fc融合蛋白的比较显示，在NSO细胞中产生的该蛋白质的84%为二聚体，其余的蛋白质经大小排阻层析显示为高分子量种类。图11显示制剂的大小排阻柱谱图的比较。由于已确定聚集体的形成是ALKl-Fc生产的重要问题，预期可以开发出其它方法，包括涉及额外纯化步骤的方法(尽管此种步骤可导致纯化蛋白的低产量）。[0169]实施例2=ALKl-Fc配体的鉴定[0170]ALKl是TGFP家族成员的I型受体。使用Biacore?系统测试了TGFP家族多种成员与人ALKl-Fc融合蛋白的结合。TGFP本身、GDF8、⑶F11、BMP2和BMP4均不显示与hALKl-Fc蛋白的显著结合。BMP2和BMP4显示有限的结合。GDF5、⑶F7和BMP9分别显示Kd值约为5X10-8M、5XHT8M和IX的结合。基于⑶F5和⑶F7与⑶F6的相似性，预计⑶F6会以类似的亲和力结合。BMP10与BMP9密切相关，因此也预期BMP10以类似的亲和力结合。[0171]实施例3:表征ALKl-Fc和抗ALKl抗体对内皮细胞的作用[0172]使用受四个连续的相同SBE位点调控的萤光素酶报告基因构建体(SBE4-1UC)，其响应于Smadl/5/8介导的信号传导，我们在HMVEC细胞中测量了在hALKl-Fc药物或中和性ALKl特异性单克隆抗体存在和不存在时BMP-9介导的活性。HMVEC细胞被诱导Smadl/5/8介导之转录活化的rhBMP-9(50ng/ml)所刺激，在这里由SBE4-luc调节之转录上调的增加显示。当添加后，hALKl-Fc化合物（10μg/ml)或抗体（10μg/ml)降低了该转录应答，每种均降低了几乎60%，这表明ALKl-Fc的存在显著降低了BMP9信号传导，并且BMP9信号传导与ALKl活性有关。[0173]常使用SMAD磷酸化的活化来测定上游激活蛋白受体的活化。已知ALKl在被其配体活化后调节SMAD蛋白1、5和8的磷酸化。在这里，我们添加rhBMP-9(50ng/ml)，在30分钟时程期间起始HUVEC细胞中的SMAD磷酸化，所述HUVEC细胞是固有表达ALKl受体的人内皮细胞系。在用所述配体处理细胞5分钟后观察到SMAD1/5/8的磷酸化，并且在整个30分钟期间保持磷酸化。在相对低浓度的hALKl-Fc(250ng/ml)存在时，SMAD1/5/8磷酸化减少，证明该药剂抑制内皮细胞中的Smad1/5/8活化。[0174]为了评价ALKl-Fc在体外系统中对血管发生的作用，我们测定了该化合物对减少Matrigel基底上内皮细胞管形成的有效性。该技术常用于评估新血管生成，其可得到快速且高重复性的结果。使用内皮细胞生长添加剂(ECGS)来诱导从Matrigel上由内皮细胞形成微血管，然后在18小时时程期间，在所述药物和ECGS存在下，测量抗血管发生化合物减少管形成的效果。正如预期的一样，与阴性对照(未施加处理)相比，添加ECGS(200ng/ml)诱导显著的管形成，这表明在Matrigel基底上产生了基础水平的内皮细胞管形成（图5)。添加了1^1(1-?〇(10〇1^/1111)或11^1(1-?(3(10〇1^/1111)之后，可观察到管形成的减少。最后对所有样品中的管长度定量测定表明，各种浓度的hALKl-Fc或mALKl-Fc均将新生血管发生减少至基础水平。另外，在强的促血管发生因子ECGS存在时，hALKl-Fc和mALKl-Fc对新血管生成保持强的抑制，这表明其比阴性对照内皮抑素(lOOng/ml)具有更强的抗血管发生活性。[0175]实施例4:CAM检测[0176]VEGF和FGF刺激血管发生是众所周知的。使用CAM(鸡绒毛尿囊膜)测定系统来评估GDF7的血管发生作用。如图6所示，⑶F7刺激血管发生的效力与VEGF类似。使用GDF5和⑶F6也观察到类似的结果。[0177]在CAM测定中测试ALKl-Fc融合蛋白的抗血管发生活性。这些融合蛋白对由VEGF、FGF和⑶F7刺激的血管发生显示出强的抗血管发生作用。参见图7。在该测定中，BMP9和TOGF显示出相对较弱的血管发生诱导能力，尽管如此，这些因子的血管发生作用仍被ALKl抑制。[0178]在CAM测定中将ALKl-Fc蛋白与市售抗血管发生的抗VEGF单克隆抗体进行比较。与抗VEGF相比，ALKl-Fc蛋白具有相似的效力。抗VEGF抗体贝伐单抗目前用于在人中治疗癌症和黄斑变性。参见图8。[0179]令人感兴趣的是，在该测定系统中抗ALKl抗体(R&DSystems)不能显著抑制血管发生。我们预计这可能反映出不同物种中ALKl序列的差异。[0180]实施例5:小鼠角膜微囊袋测定[0181]小鼠角膜微囊袋测定用于评估ALKl-Fc对小鼠眼中血管发生的作用。经腹膜内施用的hALKl-Fc显著抑制眼部血管发生。如图9所示，hALKl-Fc与抗VEGF抑制眼部血管发生的程度相同。MLKl-Fc和抗VEGF以同样的重量/重量剂量使用。当将灌满VEGF的Matrigel栓植入非眼部位置时，得到了类似的数据。[0182]这些数据表明ALKl的高亲和力配体促进血管发生，ALKl-Fc融合蛋白具有强的抗血管发生活性。ALKl的配体归为两类，其中⑶F5、6、7组具有针对ALKl的中等亲和力，BMP9、10组具有针对ALKl的高亲和力。[0183]GDF5、6和7主要定位于骨和关节，而BMP9在血液中循环。因此，似乎存在骨和关节的促血管发生系统（其包含ALKl、GDF5、6和7)以及全身的血管发生系统（其包含ALKl和BMP9,以及可能的BMP10)。[0184]实施例6:小鼠类风湿性关节炎模型[0185]胶原诱导的关节炎小鼠模型是广泛接受的类风湿性关节炎模型。在该研究中，用载体、抗VEGF(贝伐单抗--作为阴性对照，因为贝伐单抗不抑制小鼠VEGF)或lmg/kg、10mg/kg或25mg/kg剂量的mALKl-Fc("RAP-041"）处理每组10只的小鼠组。在第21天用胶原加强后，所有组中的关节炎评分(参见图10)和爪肿胀均持续提高，在约第38天时到达峰值。用mALKl-Fc("RAP-041"）处理的小鼠显示出上述两项特征评分的降低，尤其是在最高剂量(25mg/kg)时，尽管该降低不具有统计学显著性。但是，剂量相关性趋势是明显的。[0186]通过研究第42天结束时的情形，关节炎的发生已达到：在用载体对照处理的小鼠中为10/10,在用贝伐单抗处理的小鼠中为9/10,在lmg/kgmALKl-Fc处理组中为8/10,在10mg/kgmALKl-Fc处理组中为9/10。在25mg/kgmALKl-Fc处理组中疾病发生降低至6/10。[0187]实施例7:DAN的配体结合特性[0188]DAN是分泌型胱氨酸结蛋白家族的成员，其抑制BMP活性。已知DAN结合并拮抗GDF5。我们已测定DAN还紧密结合GDF7，但不结合BMP9。因此，我们得出结论:DAN抑制定位于骨和关节的ALKl配体组，并预计DAN是骨和关节相关血管发生的强拮抗剂。因此，DAN可用于治疗骨癌，例如多发性骨髓瘤和骨转移，以及类风湿性关节炎和骨关节炎。[0189]综上，这些实施例公开的发现提供了本文所述的多种试剂用于体内抑制血管发生，特别是眼部血管发生。这些发现还表明，靶向⑶F5、6和7的药剂可用于选择性地抑制骨和关节血管发生。这些发现还表明这些药剂可用于治疗癌症和类风湿性关节炎。[0190]实施例8=ALKl-Fc在CAM测定中减少肿瘤血管发生[0191]任何组织的肿瘤都有基本的营养和氧气需求。尽管小肿瘤可从邻近血管的扩散中获得足够的量，但随着肿瘤大小的增加，其必须通过募集和维系已存在的毛细血管来确保营养供应。为了测试ALKl-Fc蛋白通过抑制血管而限制肿瘤生长的能力，我们在黑素瘤外植体CAM测定中测试了不同浓度的mALKl-Fc。与上述CAM测定一样，在每个蛋表面开小孔，并通过该小孔植入5X105个B16黑素瘤细胞。然后，每天用0.02mg/mlmALKl-Fc、0.2mg/mlmALKl-Fc处理蛋，持续一周，或者不进行处理。在实验结束时，小心取出肿瘤，称重并获取数码图像。与未处理的CAM肿瘤相比，源自用mALKl-Fc处理的CAM肿瘤的大小显示显著的体积减小。对肿瘤重量定量表明，与未处理的CAM相比，每天用0.02mg/ml或0.2mg/mlmALKl-Fc处理的肿瘤的重量分别有65%和85%的降低（图6E)。结论是，加入ALKl-Fc使新血管发生和肿瘤生长以剂量响应的方式被显著抑制，这表明ALKl-Fc是强的抗血管发生药剂。[0192]实施例9:肺癌实验模型[0193]为了进一步证实ALKl-Fc对肿瘤进展的作用，测试了小鼠肺癌模型。将荧光标记的鼠Lewis肺癌细胞(LL/2-luc)经由尾静脉施加到白化Black6小鼠中。在同一天，开始用经腹膜内施加的PBS对照(n=7)或10mg/kgmALKl-Fc(n=7)处理小鼠。活体焚光成像显示了对照小鼠中肺部肿瘤的显著进展，以致于在植入后22天小鼠已濒临死亡，并只能进行处死。与之相反，经ALKl-Fc处理的小鼠显示了显著的肺肿瘤生长延迟，在第22天时仍具有100%的存活率。见图12。[0194]这些数据表明，ALKl-Fc对肺癌小鼠模型中的肿瘤生长有明显的作用，并有益于存活。[0195]实施例10:ALKl-Fc蛋白对胰腺肿瘤模型的作用[0196]SV40大T抗原是癌基因，其可在小鼠的多种不同组织中表达从而刺激小鼠中自发、同位肿瘤的形成。与常用的异种移植模型相比，这些肿瘤可具有与天然肿瘤更大的相似性。在RIPl-Tag2小鼠中，对小鼠进行遗传改造从而在胰岛素启动子的控制下表达T抗原，这样小鼠会特异性地在胰腺内分泌组织中生成肿瘤。我们测试了ALKl-Fc对RIPl-Tag2肿瘤的作用。[0197]我们观察到RIPl_Tag2小鼠的胰腺组织经历一系列阶段，开始为正常组织，然后表现出增生，经历血管发生形成显著的新血管系统，并最终产生成形的肿瘤。在这些不同阶段监测了组织中ALKl和BMP9的表达。结果显示在图13中。在肿瘤生成的血管发生阶段ALKl的表达到达峰值，而BMP9的表达则在肿瘤生成的整个过程中升高。[0198]从10周龄(肿瘤生成早期)或12周龄(肿瘤生成成熟期)开始，用mALKl-Fc或对照Fc(每只小鼠300微克，或约12mg/kg，一周两次，持续2周）处理RIPl-Tag2小鼠。在每种情形中，mALKl-Fc的处理都基本停止了肿瘤的生长。见图14。值得注意的是，在10周龄进行处理的小鼠的肿瘤体积在10周到12周期间未增加，而用对照Fc蛋白处理的小鼠在相同的期间内肿瘤体积增加为3倍。类似地，在12周龄进行处理的小鼠的肿瘤体积在12周到14周期间未增加，但对照组则显示肿瘤体积又增加了30%。[0199]如对⑶31(内皮细胞标志物)进行染色所测量地，对经处理和对照肿瘤的荧光染色显示mALKl-Fc处理导致血管化降低。图15。明显地，如通过NG2阳性细胞（周细胞)与CD31阳性细胞的比值而测量地，mALKl-Fc处理使得肿瘤血管的周细胞包裹升高。见图16。周细胞是形成血管之一部分并在调节血管稳定性和渗透性中起作用的细胞。在用CaLu6非小细胞肺癌细胞系的异种移植肿瘤模型中，观察到周细胞包裹响应于ALKl-Fc处理的类似升高。[0200]总之，这些数据显示ALKl-Fc是RIPl-Tag2小鼠中形成的自发、同位胰腺肿瘤中肿瘤生长的强效抑制剂，且肿瘤抑制与肿瘤血管化的显著降低和肿瘤血管周细胞包裹的显著升高相关。后者对肿瘤生物学的意义仍待确定。然而，应注意，糖尿病性视网膜病的病理很大程度上归因于周细胞的缺失以及从糖尿病性视网膜血管的流体泄漏。因此，这些数据表明ALKl-Fc可用作抗肿瘤/抗血管发生药剂，进一步地，该药剂可用于促进血管化组织中周细胞的形成。[0201]实施例11=ALKl-Fc融合蛋白对乳腺癌肿瘤模型的作用[0202]mALKl-Fc有效地延迟了源自雌激素受体阳性(ER+)和雌激素受体阴性(ER-)两种肿瘤细胞的乳腺癌肿瘤细胞系的生长。[0203]用萤光素酶基因稳定转染MDA-MB-231乳腺癌细胞系(源自ER-细胞）以允许体内检测肿瘤生长和潜在转移。在本研究中，将IXIO6个MDA-MB-231-LUC细胞同位植入无胸腺裸鼠（Harlan)的乳房脂肪垫中。用IVIS光谱成像系统(CaliperLifeSciences)通过生物发光检测来跟踪肿瘤进展。发光(所检测的光子数)的提高对应于肿瘤负荷的增加。[0204]将IXIO6个肿瘤细胞注射入30只雌性裸鼠的乳房脂肪垫中。肿瘤植入3天后通过皮下（SC)注射用对照载体或mALKl-Fc(30mg/kg)每周2次处理小鼠。继续进行处理，并利用生物发光成像监测肿瘤进展，持续10周。利用生物发光检测，与载体处理的对照相比，用30mg/kgmALKl-Fc进行处理减缓了肿瘤进展（图17)。在该模型中，用mALKl-Fc处理延迟了肿瘤生长，但并没有逆转肿瘤生长。这是抗血管发生化合物的可预期作用，即肿瘤可以在需要新血管形成以支持其继续生长之前存活至一定体积。在一个类似的实验中，在低至3mg/kg的剂量水平下，hALKl-Fc产生了类似(稍小）的作用。[0205]还在同位植入模型中测试了雌激素受体阳性(ER+)的表达萤光素酶的细胞系MCF-7。在该模型中，在雌性裸鼠皮下植入17β-雌二醇的60天缓释颗粒。在植入颗粒两天后，将5\106个1^-7肿瘤细胞植入乳房脂肪垫中。经腹膜内途径用载体对照或3、10和3〇11^/1^的hALKl-Fc处理小鼠，一周2次。用IVIS光谱成像仪(CaliperLifeSciences)通过生物发光成像每周跟踪肿瘤进展。在载体处理的小鼠中，肿瘤快速进展直至研究第26天（图18)。26天后肿瘤发光有起伏，一直持续到第60天本研究终止时（当雌二醇颗粒耗尽时）。这些起伏是该模型的常见特点，即肿瘤快速生长可超过宿主动物的血管发生应答，导致肿瘤坏死并伴随着发光信号的下降。存留的细胞继续生长并导致信号增强。与载体处理的对照相比，用10或30mg/kghALKl-Fc处理的小鼠可在本研究期间使肿瘤大小维持在恒定的水平，这表明该分子对肿瘤生长的强效作用。[0206]通过引用并入[0207]本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，如同指明每篇出版物或专利具体地以及单独地通过引用并入本文一样。在存在矛盾时，以本申请(包括本文中的任意定义)为准。[0208]等同方案[0209]尽管本发明的【具体实施方式】在本文中明确地公开，以上说明书是示例性的而非限制性的。通过阅读本说明书和权利要求书，本发明的许多变化形式对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的完整范围应参考权利要求书及其等同方案的完整范围以及说明书连同所述变化形式来确定。[0210]以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：[0211]1.包含ALKl-Fc融合蛋白的药物制剂，所述融合蛋白包含：具有与SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少97%同一性的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd结合⑶F5、⑶F7和BMP9,以大于IX10_6的Kd结合TGFI3-1，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少90%以二聚体形式存在。[0212]2.项1的药物制剂，其中所述ALKl-Fc融合蛋白的Fc部分是人IgGl的Fc部分。[0213]3.项1的药物制剂，其中所述AUQ-Fc融合蛋白包含SEQIDN0:3的氨基酸序列。[0214]4.项1的药物制剂，其中所述ALKl-Fc融合蛋白通过在哺乳动物细胞系中表达SEQIDNO:4的核酸来产生。[0215]5.项4的药物制剂，其中所述ALKl-Fc融合蛋白通过在中国仓鼠卵巢(CH0)细胞系中表达SEQIDN0:4的核酸来产生。[0216]6.项1的药物制剂，其中所述药物制剂为适于施用于眼部的药物制剂。[0217]7.项1-6中任一项的药物制剂，其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少95%以二聚体形式存在。[021S]8.项I-6中任一项的药物制剂，其中所述ALKI-Fe融合蛋白的至少99%以二聚体形式存在。[0219]9.在有此需要的哺乳动物中抑制血管发生的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的项1之药物制剂。[0220]10.在有此需要的哺乳动物中治疗肿瘤的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的项1之药物制剂。[0221]11.在有此需要的哺乳动物中治疗血管发生相关眼部疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的项1之药物制剂。[0222]12.在有此需要的哺乳动物中治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的项1之药物制剂。[0223]13.项9-12中任一项的方法，其中所述方法还包括施用抑制血管发生的另一种药剂。[0224]14.在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的ALKlE⑶蛋白。[0225]15.项14的方法，其中所述ALKlE⑶蛋白是ALKl-Fc融合蛋白。[0226]16.项15的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含具有与SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fe部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd结合TGF0-1。[0227]17.项14的方法，其中所述ALKIECD蛋白结合选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的一种或多种ALKl配体。[0228]18.项14的方法，其中所述ALKlECD多肽包含与对应于SEQIDNO:1之34-95位氨基酸的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。[0229]19.项14的方法，其中所述ALKlECD包含由在严格杂交条件下与SEQIDN0:2之100-285位核苷酸或者SEQIDN0:2之100-285位核苷酸的编码相同氨基酸序列的变体杂交的核酸所编码的氨基酸序列。[0230]20.项15的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。[0231]21.项15的方法，其中所述ALKI-Fe融合蛋白在药物制剂中施用，其中所述ALKI-Fe融合蛋白的至少90%为二聚体形式。[0232]22.项14的方法，其中所述ALKlE⑶融合蛋白经静脉内递送或局部递送至眼。[0233]23.项14的方法，其中所述方法还包括施用抑制血管发生的另一种药剂。[0234]24.项14的方法，其中所述血管化组织选自肿瘤、骨、关节和哺乳动物的眼。[0235]25.项14的方法，其中所述哺乳动物患有糖尿病性视网膜病或者特征在于视网膜血管中周细胞包裹缺失的其它视网膜疾病。[0236]26.项14的方法，其中所述哺乳动物患有选自黑素瘤、肺肿瘤、多发性骨髓瘤和乳腺癌的肿瘤。[0237]27.项14的方法，其中所述哺乳动物患有胰腺肿瘤。[0238]28.项27的方法，其中所述哺乳动物患有胰腺内分泌组织肿瘤。[0239]29.在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用有效量的与ALKl多肽结合并抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP^PBMPlO之至少一种ALKl配体结合的抗体，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成。[0240]30.项29的方法，其中所述抗体以小于5XHT8M的Kd结合所述ALKl多肽。[0241]31.项29的方法，其中所述抗体以小于IX10_1()M的Kd结合所述ALK1多肽。[0242]32.项29的方法，其中所述抗体抑制ALK1与ALK1配体的结合，其中所述ALK1配体选gBMP^BMP10〇[0243]33.项29的方法，其中所述抗体经静脉内递送。[0244]34.项29的方法，其中所述方法还包括施用抑制血管发生的另一种药剂。[0245]35.项29的方法，其中所述血管化组织选自肿瘤、骨、关节和哺乳动物的眼。[0246]36.项29的方法，其中所述哺乳动物患有糖尿病性视网膜病或者特征在于视网膜血管中周细胞包裹缺失的其它视网膜疾病。[0247]37.项29的方法，其中所述哺乳动物患有选自黑素瘤、肺肿瘤、多发性骨髓瘤和乳腺癌的肿瘤。[0248]38.项29的方法，其中所述哺乳动物患有胰腺肿瘤。[0249]39.项38的方法，其中所述哺乳动物患有胰腺内分泌组织肿瘤。[0250]40.用于治疗哺乳动物中肿瘤的方法，该方法包括向患有肿瘤的哺乳动物施用有效量的选自以下的药剂：[0251](a)ALKlECD蛋白；[0252](b)结合ALK1配体并抑制所述ALK1配体与ALK1结合的抗体，其中所述ALK1配体选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10;[0253](c)结合ALKl多肽并抑制选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO之至少一种ALKl配体结合的抗体，其中所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成;和[0254]⑷DAN多肽，[0255]其中所述肿瘤选自：黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨相关肿瘤、已转移至骨的肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺癌。[0256]41.项40的方法，其中所述ALKlE⑶蛋白是ALKl-Fc融合蛋白。[0257]42.项41的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含具有与SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd结合TGF0-1。[0258]43.项40的方法，其中所述ALK1ECD蛋白结合选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10的一种或多种ALKl配体。[0259]44.项41的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。[0260]45.项40的方法，其中所述ALKlECD多肽包含与对应于SEQIDNO:1之34-95位氨基酸的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。[0261]46.项40的方法，其中所述ALKlECD包含由在严格杂交条件下与SEQIDN0:2之100-285位核苷酸或者SEQIDNO:2之100-285位核苷酸的具有相同编码序列的变体杂交的核酸所编码的氨基酸序列。[0262]47.项40的方法，其中（b)中所述抗体以小于5XHT8M的Kd结合所述ALKl多肽。[0263]48.项40的方法，其中（b)中所述抗体以小于IX10-iqM的Kd结合所述ALK1多肽。[0264]49.项40的方法，其中（b)中所述抗体抑制由选自GDF5、GDF6和GDF7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。[0265]50.项40的方法，其中（b)中所述抗体抑制ALK1与ALK1配体的结合，其中所述ALK1配体选自BMro和BMPlO。[0266]51.项40的方法，其中（c)中所述抗体抑制由选自GDF5、GDF6和GDF7的至少一种ALKl配体所刺激的血管发生。[0267]52.项40的方法，其中（c)中所述抗体抑制由选自BMP9和BMP10的至少一种ALK1配体所刺激的血管发生。[0268]53.项40的方法，其中所述DAN蛋白是DAN-Fc融合蛋白。[0269]54.项53的方法，其中所述DAN-Fc融合蛋白包含具有与SEQIDNO:10之21-125位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd结合TGF0-1。[0270]55.项40的方法，其中所述DAN蛋白结合选自GDF5、GDF6和⑶F7的一种或多种ALKl配体。[0271]56.项40的方法，其中所述DAN蛋白包含与对应于SEQIDNO:10之17-180位氨基酸的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。[0272]57.项40的方法，其中所述DAN蛋白包含由在严格杂交条件下与SEQIDNO:11之153-467位核苷酸或者SEQIDNO:11之153-467位核苷酸的具有相同编码序列的变体杂交的核酸所编码的氨基酸序列。[0273]58.项40的方法，其中所述药剂经静脉内递送。[0274]59.项40的方法，其中该方法还包括施用抑制血管发生的另一种药剂。[0275]60.项10的方法，其中所述肿瘤选自：黑素瘤、肺肿瘤、多发性骨髓瘤、胰腺肿瘤和乳腺癌。【主权项】1.包含ALKl-Fc融合蛋白的药物制剂，所述融合蛋白包含：具有与SEQIDN0:1之22-118位氨基酸所示序列有至少97%同一性的氨基酸序列的多肽，该多肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于1X10_7M的KD结合⑶F5、GDF7和BMP9,以大于1X10_6的KD结合TGFI3-1，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少90%以二聚体形式存在。2.权利要求1的药物制剂，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。3.权利要求1的药物制剂，其中所述药物制剂为适于施用于眼部的药物制剂。4.权利要求1的药物制剂在制备用于在有此需要的哺乳动物中抑制血管发生之药物中的用途。5.权利要求1的药物制剂在制备用于在有此需要的哺乳动物中治疗肿瘤之药物中的用途。6.权利要求1的药物制剂在制备用于在有此需要的哺乳动物中治疗血管发生相关眼部疾病之药物中的用途。7.权利要求4-6中任一项的用途，其中所述权利要求1的药物制剂与抑制血管发生的第二药剂组合使用。8.ALK1ECD蛋白在制备用于在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高之药物中的用途。9.抗体在制备用于在有此需要的哺乳动物中促进血管化组织中周细胞包裹提高之药物中的用途，其中所述抗体结合ALK1多肽并抑制选自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10之至少一种ALK1配体结合，其中所述ALK1多肽由SEQIDΝΟ:1的22-118位氨基酸组成。10.选自以下的药剂在制备用于在哺乳动物中治疗肿瘤之药物中的用途：(a)ALKlECD蛋白；(b)结合ALK1配体并抑制所述ALK1配体与ALK1结合的抗体，其中所述ALK1配体选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10;(c)结合ALK1多肽并抑制选自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10之至少一种ALK1配体结合的抗体，其中所述ALK1多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸组成;和(d)DAN多肽，其中所述肿瘤选自：黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨相关肿瘤、已转移至骨的肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺癌。【文档编号】A61P35/00GK105963695SQ201610297436【公开日】2016年9月28日【申请日】2009年5月1日【发明人】阿斯亚·格林贝格,约翰·克诺夫,拉温德拉·库马尔,罗伯特·斯科特·皮尔索尔,亚斯比尔·西拉,克里斯蒂安·彼得拉斯【申请人】阿塞勒隆制药公司,路德维格癌症研究有限公司