一种预防手足口病的联合疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种预防手足口病的联合疫苗，其含有灭活的EV71抗原、CA16抗原、CA10抗原。本发明通过将导致手足口病的主要流行病毒株EV71、CA16、CA10型进行培养、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、超滤脱糖及除菌过滤，得到纯化的病毒液，进一步将该病毒液制备成免疫原性良好、安全性和稳定性高的手足口联合疫苗，本发明的疫苗可以同时预防多种肠道病毒对机体的侵染，并且这些抗原之间不存在相互干扰的现象，相应的免疫原性较单独抗原激发的免疫原性不会降低；且使用本发明疫苗可以明显简化疫苗接种程序，提高接种效率并降低成本。
【专利说明】
一种预防手足口病的联合疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及生物制品制备技术领域，具体地，涉及一种含肠道病毒抗原的预防手 足口病的联合疫苗。
【背景技术】
[0002] 手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)在我国《传染病防治法》中列为丙类 传染病，是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病，以婴幼儿发病较为常见。患者表现为口 痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿1周左右自愈，少数患儿 可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。弓丨 起手足口病的病毒除EV71 (Enterovirus 71，EV71)及CAl6型（Coxasckievirus Al6，CAl6) 较为常见外，还包括柯萨奇病毒A组（Coxasckievirus A，CA)的2、4、5、6、10型等，13组 (Coxasckievirus B，CB)的1、2、3、4、5型等，肠道病毒68型(Enterovirus 68)以及埃可病毒 (Echovirus，Echo)等。
[0003] 以往认为，EV71和CA16为引起亚太国家多起HFMD暴发的主要病原体，但近年来由 CAlO引起HFMD暴发的报道逐渐增多，CAlO曾于2010年引起发过一起HFMD的暴发。2009年北 京地区CAlO是非EV71和非CA16型肠道病毒中的优势型别。CAlO和CA6是引起济南市手足口 病的主要病原体，且2012年CAlO构成比最高（32.5%)。在中国武汉2013年发生的HFMD暴发 中，分离出的病毒中CAlO占41.0% (190/463)。2013年湖南省郴州市手足口病流行的优势毒 株为CA6、CA10和CA16。近几年手足口病流行病学统计来看，CAlO在我国多地替代EV71或 CA16成为引起HFMD暴发的主要病原体，并能引发重症病例和聚集性病例。手足口病已成为 严重威胁儿童健康和社会稳定的公共卫生问题之一。目前，临床上尚无有效的治疗手足口 病的抗病毒药物，虽然现有已获批的EV71灭活疫苗，但由于HFMD肠道病毒病原谱的改变以 及导致HFMD高发的主导毒株类型多样，且病毒株之间不存在交叉免疫保护作用，无法实现 对感染其他型别手足口病毒的机体保护，对防控HFMD提出了新的挑战。接种EV71疫苗难以 控制CA16和CAlO引起的手足口病的爆发和流行。因此，急需制备相应的多价、多联疫苗，以 应对HFMD的暴发和重症疾病的流行。目前还没有EV71、CA16和CAlO联合疫苗研制的相关报 道，首先，EV71、CA16与CAlO病毒引发的手足口病在近期较短时间内才发生了大规模的爆 发，其次，病毒引发的手足口病存在一定的地域性分布，对于发生率相对较低的发达国家， 投入研发的机构较少，再次，不同病毒抗原之间存在的免疫干扰作用未知，而此干扰作用可 能直接降低疫苗单组份的免疫原性，影响免疫效果。因此，为了更大范围地保护机体免受手 足口系列病毒的侵害，在我国建立完善的HFMD防控体系，通过制备联苗扩大保护势在必行。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种免疫原性良好、安全性和稳定性高的 包含肠道病毒抗原的手足口联合疫苗。
[0005] 本发明的预防手足口病的联合疫苗，含有灭活的EV71抗原、灭活的CA16抗原和灭 活的CAlO抗原。
[0006] 进一步，本发明的联合疫苗中，EV71、CA16、CA10的抗原含量分别为100-1000U/人 份、100-1000U/人份、100-1000U/人份。
[0007] 优选地，EV71、CAl 6、CAl 0的抗原含量分别为200-800U/人份、200-800U/人份、200-800U/人份。
[0008] 更优选地，EV71、CAl 6、CAl 0的抗原含量分别为400U/人份、400U/人份、400U/人份。
[0009] 本发明的联合疫苗，其病毒纯化液通过以下步骤制备得到：
[0010] (1)分别将EV71、CAl 6、CAl 0病毒液灭活，超滤浓缩；
[0011] (2)分别对上述三种病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心；
[0012] (3)收集合并离心液。
[0013]步骤（1)中，EV71病毒液的制备方法为:EV71病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为： 0.0001-0.001，培养用血清浓度:2 %牛血清，培养温度:36 ± 1°C，收获时间为7-9d;
[0014] CA16病毒液的制备方法为:CA16病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为:0.001-0.01， 培养用血清浓度：1 %牛血清，培养温度:35 ± rc，收获时间为8-10d;
[0015] CAlO病毒液的制备方法为:CA10病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为:0.001-0.01， 培养温度:35 ± 1°C，收获时间为7-9d。
[0016] 优选地，本发明培养EV71、CA16、CA10病毒的细胞为人二倍体细胞SLF-1。该细胞已 在中国专利CN103255102A中公开。
[0017] 进一步地，步骤(1)中，灭活方法为甲醛灭活，甲醛灭活的终浓度为67-200μg/ml。
[0018] 其中，甲醛灭活时间为:37±1°C条件下，灭活2.7-5.4(1。优选灭活4(1。
[0019] 其中，步骤(1)的病毒液超滤浓缩是通过以下方法实现的：
[0020] 病毒灭活液经切向流膜过滤或中空纤维过滤浓缩，浓缩倍数为50-200倍，使用截 留分子量为100万_500万。
[0021]优选地，超滤浓缩采用孔径为300kD的超滤膜包。
[0022]其中，步骤(2)的蔗糖密度梯度离心方法为：
[0023]依次从离心机边孔以50-lOOrpm依次栗入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液，低浓度蔗 糖溶液，最后以50-150rpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体离心转速为28000-35000rpm，离心时间为:6_20小时，离心温度为2_8°C。
[0024]超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1:5-1:10;病毒超滤浓缩液与低浓度蔗 糖溶液的体积比为1:1-2:1;高浓度蔗糖加入标准为只要离心机中空流出液体即可停止加 入高浓度蔗糖。
[0025]其中，所述低浓度蔗糖质量百分比为25 %~45 %，高浓度蔗糖质量百分比为55 % -60% 〇
[0026] 其中，超离缓冲液选自0.01-0.5M的PB、PBS和PBST中的一种。
[0027] 其中，密度梯度离心方法中，纯化EV71、CA16、CA10病毒时，收集并合并抗原含量与 蛋白质含量比大于5U/yg的离心液。采用300KD膜包超滤脱糖，方法为:EV71病毒液等体积超 滤8次，CAl 6病毒液3倍体积超滤8次，CAlO病毒液等体积超滤8次。
[0028] 进一步地，本发明的联合疫苗还含有铝佐剂。
[0029]所述铝佐剂为氢氧化铝，其在联合疫苗中的终浓度为0.36-1.73mg/ml。
[0030]优选地，氢氧化铝，其在联合疫苗中的终浓度为1.44mg/ml。
[0031 ]进一步地，所述联合疫苗的剂型为注射剂。
[0032] 本发明通过采用
【申请人】具有自主知识产权的人二倍体细胞培养病毒，相比非人源 细胞基质疫苗，在细胞基质上有了提升，排除了非人源蛋白、非人源DNA和潜在致瘤性等不 安全因素；同时疫苗纯化过程中完全采用物理方法进行，去除了PEG、DNA酶等的残留风险， 为疫苗安全提供了保障。
[0033] 基于上述技术方案，本发明利用当前致手足口病流行株制备得到的预防手足口联 合疫苗至少具有以下优点及有益效果：
[0034] (1)疫苗采用人二倍体细胞基质培养病毒，为疫苗安全性提供了保障；同时采用的 人二倍体细胞是
【申请人】自主知识产权的SLF-I株，无知识产权壁皇。
[0035] (2)制苗苗工艺一致性良好，工艺稳定;经过大量实验，筛选了最佳的灭活工艺参 数，既能提高疫苗的安全性，实现完全灭活，又能将甲醛的使用量控制在最小限度，节省成 本。
[0036] (3)本发明的联合疫苗包含手足口病主要致病病原，能够很好的预防由EV7UCA16 和CAlO病毒引起的手足口病的发生。本发明研究表明，上述三种抗原在免疫受种者后互相 不干扰抗原性和免疫效果，具有很好的免疫原性和安全性。
[0037] (4)本发明提供的联合疫苗可以同时预防多种病原体的侵染，并且这些抗原之间 不存在相互干扰的现象，相应的免疫原性较单独抗原激发的免疫原性不会降低。联合疫苗 的使用可以明显简化疫苗接种程序，提高接种效率并降低成本，是未来技术发展的大趋势， 也是未来市场需求所在。
[0038] (5)本发明疫苗稳定性好，可长期保存。
【附图说明】
[0039] 图1为不同甲醛灭活浓度在不同时间下CA16病毒滴度变化曲线。
[0040] 图2A为CA16病毒收获液电镜照片（100000X )。
[0041 ] 图2B为CA16疫苗原液电镜照片（100000 X )。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0043] 若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若 未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0044] 本发明EV71病毒株保藏号为CGMCC如.3544，已在中国专利0附03386126六中公开； CA16病毒株保藏号为CGMCC如.5371，已在中国专利0附03386126六中公开 ;0六10病毒株保藏 号为VR-1016AS/MK?(购买自 ATCC)。
[0045] 本发明培养EV71、CA16、CA10病毒的细胞为人二倍体细胞SLF-1，该细胞已在中国 专利CN103255102A中公开。
[0046] 实施例1病毒液的制备
[0047] 1、细胞培养复苏SLF-I细胞，使用含20%牛血清的MEM溶液，置37 ± TC培养，贴壁 后换液，使用含10 %牛血清的MEM溶液。单层后洗涤、0.25 %胰蛋白酶消化，按1:4比例分种 至培养瓶或细胞工厂中，传至40层细胞工厂，长至单层后，准备接种病毒。
[0048] 2、病毒培养
[0049] EV71病毒以MOI 0.0001接种细胞，采用含2%牛血清的培养液，置36±1°C培养，8d 收获病毒。
[0050] CA16病毒以MOI 0.001接种细胞，采用含1%牛血清的培养液，置35±1°C培养，IOd 收获病毒。
[00511 CAlO病毒以MOI 0.001接种细胞，采用不含牛血清的培养液，置35±1°C培养，9d收 获病毒。
[0052]实施例2病毒的灭活
[0053] (1)澄清将病毒液经连续2级孔径为3-0.8μπι、0.65-0.22μπι的滤芯过滤或离心（包 括连续流离心)转速为3000rpm，离心时间为0.5个小时，得到病毒澄清液；
[0054] (2)灭活将EV71、CA16、CA10病毒澄清液分别分成9组，每组加入不同体积的1:200 福尔马林溶液，使其理论终浓度为200、100、67μg/ml，每个浓度3组平行样品，置37 ± TC条 件下灭活，分组信息见表1。在灭活的〇、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时进行取样， 取样结束后立即用亚硫酸氢钠溶液中和甲醛，进行病毒滴度测定。对每组灭活剂浓度的病 毒滴度取平均值(结果见表2)。根据病毒滴度分别绘制EV7UCA16和CAlO病毒灭活动力学曲 线(不同甲醛灭活浓度下CA16病毒滴度变化曲线如图1所示）。根据灭活动力学曲线推算病 毒完全灭活所需时间（结果见表3)。
[0055] 表1分组信息
[0057] 表2不同浓度甲醛灭活后病毒滴度（lg CCID5Q/ml)
[0060] 注：绘制灭活动力学曲线时，若滴度值为小于某值时就按此值计算，如〈1.501g CCID5〇/ml按 1 · 501g CCID5〇/ml绘制曲线
[0061] 表3不同甲醛浓度灭活时间的推算
[0063]由表3可见三种不同浓度甲醛溶液
(200、100、67μg/ml)在31h内均能将EV71完全灭 活，32h内均能将CA16完全灭活，28h内均能将CAlO完全灭活，在但是考虑到灭活疫苗规模化 生产病毒灭活的安全性风险，慎重起见选择1:2000作为甲醛灭活的终浓度，即200μg/ml甲 醛终浓度作为灭活剂量，37 ± 1°C灭活4天。
[0064]实施例3病毒的纯化
[0065] (1)病毒液的超滤浓缩选择截留分子量为100kD、300kD和500kD三种孔径的超滤 膜包，分别将EV71(或CA16或CA10)同一批灭活液进行超滤浓缩，固定超滤压力，浓缩相同倍 数(100倍），固定洗滤次数(洗滤8次），比较超滤时间以及三种膜包的抗原回收率，杂蛋白去 除率和超滤浓缩前后产品的活性比(抗原含量/蛋白质含量），并检测各滤出液的抗原含量。 根据检测结果确定超滤用膜包孔径。结果见表4。
[0066]表4不同膜包孔径超滤效果比较结果
[0069] 表4的研究结果显示，滤过液EV71(或CA16或CA10)抗原含量检测结果均小于检测 下限，表明三种膜包均能有效截留目的病毒。随着膜包孔径的增大，超滤用时逐渐缩短，虽 然抗原回收率下降，但是蛋白质去除率和活性比提高。综合抗原回收率、蛋白质去除率及对 目的病毒的截留效果研究结果，确定超滤浓缩工艺膜包孔径为300kD。
[0070] (2)蔗糖密度梯度离心蔗糖溶液的低、高浓度分别为40%，55%。密度梯度离心缓 冲液为0.5mol/L PBS缓冲液，其pH值为:6.5。使用日立CP70MX/ME超速离心机，依次从边孔 以IOOrpm栗入100mL超离心缓冲液，约700ml的步骤（1)超滤浓缩获得的EV71(或CA16或 CA10)病毒超滤液，低浓度蔗糖溶液500ml，最后以IOOrpm栗入高浓度蔗糖溶液直至中孔流 出液体，4°C离心12小时，先收集800ml废液，后分管收集500ml病毒液，经抗原含量和蛋白质 含量检测后，合并抗原含量与蛋白质含量比大于5UAxg所在区段。
[0071] 300KD膜包超滤脱糖，等体积或三倍体积洗滤8次，用50ml的0.OlM PBST(pH7.2)溶 液顶洗1次，用50ml的0.0IM PBST (pH7.2)溶液洗膜2次。得到各病毒脱糖液。检测BSA含量， 滤出液抗原含量，比较抗原回收率和蛋白质去除率(结果见表5)。确定超滤脱糖洗滤体积。
[0072] 表5超滤脱糖不同洗滤体积效果比较
[0074] 表5结果显示，滤过液EV71(或CA16或CA10)抗原含量检测结果均小于检测下限，表 明三种膜包均能有效截留目的病毒。BSA为各病毒液中的主要杂质，考虑到疫苗的质量，结 合抗原回收率和蛋白去除率，确定EV71病毒超滤脱糖工艺为等体积超滤8次，CA16病毒超滤 脱糖工艺为3倍体积超滤8次，CAlO病毒超滤脱糖工艺为等体积超滤8次。
[0075] (3)除菌过滤各病毒脱糖液经0.22μπι孔径滤膜除菌过滤，即获得各病毒疫苗原 液。
[0076]实施例4动物模型的确定
[0077] (1)免疫原性动物模型的确定用0.85%生理盐水将铝佐剂稀释至1.0mg/ml，用 0.01M PBS将EV71(或CA16或CAlO)抗原稀释至1600U/ml，室温下将稀释后的铝佐剂滴加入 稀释后的EV71(或CA16或CAlO)抗原中，使二者等体积进行吸附，边加边搅拌，完毕后继续室 温混合30分钟，获得EV71(或CA16或CAlO)铝吸附疫苗。
[0078] EV71(或CA16或CAlO)疫苗以相同剂量，分别一针(Od免28d采血）、两针(0d、14d免 28d采血)腹腔免疫小鼠和肌肉免疫大鼠。测定血清中和抗体滴度，结果见表6。
[0079] 表6 EV71(或CA16或CA10)疫苗免疫原性结果
[0081 ] 通过表6研究结果显示，EV71疫苗免疫大鼠、小鼠均可以产生相当滴度的抗体，为 了方便以后操作，考虑到成本，选择小鼠为EV71疫苗动物免疫模型。CAl 6疫苗(或CAlO疫苗） 免疫大鼠可以产生相当滴度的抗体，但小鼠抗体滴度低，选择大鼠为CA16疫苗（或CAlO疫 苗)动物免疫模型。
[0082] (2)攻毒保护动物模型建立了EV71疫苗(或CA16苗或CAlO疫苗）的攻毒保护模型， 具体方法如下：
[0083] 疫苗免疫与攻毒程序：将疫苗分别稀释至200U、50U、12 · 5U、3 · 12U、0 · 78U/0 · 5ml， 采用腹腔免疫亲本雌鼠，每个剂量免疫10只雌鼠，〇.5ml/只，每组雌鼠均与雄鼠同笼I~2天 后分笼，初免第一针，14天后免疫第二针，21天左右(二免后约1周)产乳鼠，待乳鼠长至5~7 日龄时，用鼠适应性攻毒株分别对每窝乳鼠进行腹腔攻毒，0.1ml/只，攻毒量为IOLD 5q/只。 乳鼠攻毒后观察14天，记录乳鼠发病、死亡数量，统计各剂量下乳鼠发病及死亡保护率 [0084] 试验对照：如上方法两针免疫亲本母鼠0.0 lM I3BSJ . 5ml/只，用鼠适应性攻毒株 分别对每窝乳鼠进行攻毒，腹腔0.1ml/只，攻毒量为IOLD5q/只。
[0085] 试验成立条件:对照组乳鼠应全部死亡。
[0086] 试验过程控制:在每只笼子上标明实验数量、组别、免疫日期。
[0087] 临床观察项目与频率:攻毒后每天观察动物有无肢体麻痹、皮疹症状及死亡情况。 在整个试验期内，所有动物的健康情况、行为变化等都详细记录，结果见实施例8。
[0088] 实施例5免疫剂量与免疫程序的确定
[0089] (1)免疫剂量的确定
[0090] 为控制每剂疫苗的蛋白质含量(各组分蛋白质含量<4yg/人份，根据多批疫苗原 液纯化结果统计，每剂EV71/CA16/CA10联合疫苗中EV71抗原含量不应高于1000U/人份， CA16抗原含量不应高于1000U/人份，CAlO抗原含量不应高于1000U/人份。
[0091] 联苗剂量选择参照以下原则进行设计比较，并确定，即：A.根据现在已上市EV71疫 苗的剂量(400U/人份），每剂联苗中EV71疫苗剂量选择设计剂量25U、100U、400U、1000U;B. 根据CA16单苗免疫剂量确定实验，拟用临床免疫剂量为400U/人份，每剂联苗中CA16疫苗剂 量选择设计剂量251]、1001]、4001]、10001];(：.根据0410单苗免疫剂量确定实验，拟用临床免疫 剂量为400U/人份，每剂联苗中CAlO疫苗剂量选择设计剂量251]、1001]、4001]、10001];0.联苗 各组分配比原则，按上述每个组分的设计剂量，第一个配比为选择各组分临床用剂量进行 配比，即EV71、CA16、CA10抗原含量分别为4001]、4001]、4001]，第二个配比考虑到各组分之间 可能的相互抑制作用选择最高剂量进行配比，即EV71、CA16、CA10抗原含量分别为1000U、 1000U、1000U，另一配比方式为考虑到各组分之间可能的相互增强作用选择低剂量进行配 比，即 EV71、CA16、CA10抗原含量分别为（100U、100U、100U)S(25U、25U、25U)。
[0092] 用上述四种配比剂量组分别两针(0d、14d免28d采血)腹腔免疫小鼠和肌肉免疫大 鼠，同时设立单苗对照和阴性对照。重复三次。中和抗体效价结果见表7。联和疫苗中各病毒 组份免疫原性分别与相对应单价苗进行统计学分析，统计分析结果见表7。
[0093] 表7单价苗与联合疫苗各病毒组份免疫中和抗体结果
[0095]注:表中数据为三次实验结果的平均值
[0096] 联苗 14￥71、0416、0410抗原含量分别为251]、251]、251]
[0097] 联苗 2 4￥71、0416、0410抗原含量分别为1001]、1001]、1001]
[0098] 联苗 3 4￥71、0416、0410抗原含量分别为4001]、4001]、4001]
[0099] 联苗 44￥71、0416、0410抗原含量分别为10001]、10001]、10001]
[0100] 通过表7研究结果显示，4种联苗的免疫中和抗体与单苗比均无显著性差异（P> 0.05)，表明联苗各组分之间无免疫干扰。同时对此四种联苗各组分免疫原性进行两两比较 可知，联苗2、3、4各组分免疫中和抗体水品两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。联苗2、 3、4各组分免疫中和抗体水平与联苗1比较，差异具有统计学意义(P〈0.05)。根据以上结果， 结合单苗评价中EV71、CA16、CA10的拟用临床剂量，确定每剂联苗中EV71、CA16、CA10抗原组 分最优组合为400U、400U、400U。
[0101] (2)免疫程序的确定
[0102] 根据实施例4(1)中确定的免疫原性动物模型，EV71/CA16/CA10联合疫苗以相同剂 量400U/400U/400U/人份，分别一针(Od免28d采血）、两针(Od、14d免28d采血)腹腔免疫小鼠 和肌肉免疫大鼠。测定血清中和抗体滴度，结果见表8。
[0103] 表8不同免疫程序联苗免疫中和抗体结果
[0105] 通过表8研究结果显示，EV71/CA16/CA10联合疫苗以相同剂量400U/400U/400U/人 份，分别一针(Od免28d采血）、两针(0d、14d免28d采血)腹腔免疫小鼠和肌肉免疫大鼠，测得 每个组分的免疫动物抗中和抗体水平均有显著性差异(？〈0.05)3￥71/^416/^410联合疫苗 2针免疫中和抗体滴度高于1针免疫中和抗体滴度。
[0106] 根据EV71/CA16/CA10联合疫苗不同剂量、不同免疫程序免疫原性研究结果，初步 确定EV71/CA16/CA10联合疫苗免疫剂量为400U/400U/400U/人份，免疫程序为两针免疫。
[0107] 实施例6制剂工艺
[0108] (1)制剂处方
[0109] 错吸附疫苗的制备：用0.85%生理盐水将错佐剂(丹麦Brenntag Biosector公司 生产的氢氧化铝)稀释至I. 〇mg/ml，用0.0 lM PBS将EV71 (或CA16或CA10)抗原稀释至1600U/ ml，室温下将稀释后的铝佐剂滴加入稀释后的EV71(或CA16或CA10)抗原中，使二者等体积 进行吸附，边加边搅拌，完毕后继续室温混合30分钟，获得EV71(或CA16或CA10)铝吸附疫 苗。
[0110] EV71(或CA16或CA10)无铝吸附疫苗的制备：用0.01M PBS将EV71(或CA16或CA10) 抗原稀释至800U/ml。
[0111] 两种不同制剂处方制备的EV71(或CA16或CA10)疫苗以相同剂量，分别两针腹腔免 疫小鼠和肌肉免疫大鼠。测定血清中和抗体滴度，结果见表9。
[0112] 表9铝吸附疫苗与无铝苗免疫原性结果
[0114] 表9结果显示，EV71疫苗相同免疫剂量及免疫程序下，含铝佐剂疫苗与不含铝佐剂 疫苗在大鼠中和抗体水平显著高于无铝疫苗(P〈〇.05);在小鼠水平上两组中和抗体无显著 差异(P>0.05)，分析原因可能与此剂量经过两针免疫，相对于小鼠可能已经达到免疫耐受 剂量范围有关;CA16疫苗相同免疫剂量及免疫程序下，含铝佐剂疫苗无论在大鼠水平还是 小鼠水平上均显著高于无铝疫苗(P〈〇.05) ;CA10疫苗相同免疫剂量及免疫程序下，含铝佐 剂疫苗无论在大鼠水平还是小鼠水平上均显著高于无铝疫苗(P〈〇.05)。
[0115] 综合考虑大鼠、小鼠中和抗体结果，以及抗原的缓释和抗体的持续水平需要，确定 EV71 (或CAl 6或CA10)疫苗制剂处方为:疫苗原液经稀释后添加铝佐剂。
[0116] (2)铝佐剂对EV71 (或CAl 6或CAl 0)抗原的吸附载量
[0117] 用0.85%生理盐水将铝佐剂稀释至氢氧化铝含量为2.89mg/ml，用0.OlM PBS分别 将EV71、CA16和CAlO抗原稀释至120001]、80001]、40001]，室温下将稀释后的铝佐剂滴加入稀 释后的各病毒抗原中，使二者等体积进行吸附，边加边搅拌，完毕后继续室温混合30分钟。 检测上清抗原含量和解离后抗原含量，计算吸附率及解离率，看铝佐剂对EV71(或CA16S CA10)抗原的吸附载量。结果见表10。
[0118] 吸附率=(1-上清抗原含量+理论吸附抗原量）X 100%
[0119] 解离率=解离抗原含量+理论吸附抗原量X 100 %
[0120] 表10铝佐剂对EV71 (或CA16或CAlO)抗原的吸附载量
[0122] 通过表10研究结果显示，每毫升铝佐剂对EV71抗原的吸附载量为8000U/ml，铝佐 剂对CA16抗原的吸附载量为12000U/ml，铝佐剂对CAlO抗原的吸附载量为8000U/ml。
[0123] (3)铝佐剂对EV71 /CAl 6/CA10混合抗原的吸附载量
[0124] 用0.85%生理盐水将铝佐剂稀释至氢氧化铝含量为2.89mg/ml，用0.OlM PBS分别 将EV7UCA16和CAlO抗原稀释混合，使EV71/CA16/CA10混合抗原分别为8000U/8000U/ 8000U、4000U/4000U/4000U、1000U/1000U/1000U，室温下将稀释后的铝佐剂滴加入混合后 的各病毒抗原中，使二者等体积进行吸附（与佐剂等体积吸附后，抗原含量即为表中对应的 4000、2000、1000 )，边加边搅拌，完毕后继续室温混合30分钟。检测上清抗原含量和解离后 抗原含量，计算吸附率及解离率，看铝佐剂对EV71/CA16/CA10混合抗原的吸附载量(吸附载 量即本次实验可以吸附上的最大抗原含量所对应的蛋白量）。结果见表11。
[0125] 表11铝佐剂对EV71/CA16/CA10混合抗原的吸附载量
[0127] 通过表 11 结果显示，EV71、CA16、CA10 抗原按抗原含量8000U/8000U/8000U、4000U/ 4000U/4000U、1000U/1000U/1000U混合后，均能与氢氧化铝含量为2.89mg/ml的铝佐剂吸 附。
[0128] (4)疫苗的铝吸附工艺
[0129] 根据疫苗原液的抗原含量，用0.OlM PBS(pH 7.2)溶液和氢氧化铝溶液适当稀释， 使半成品中氢氧化铝含量终浓度为1.44mg/ml，半成品的EV71、CA16、CA10抗原含量分别为 800U/ml、800U/ml、1200U/ml，室温搅拌吸附30 ± 5分钟，即为疫苗半成品。
[0130] (5)灌装对得到的疫苗半成品进行注射器灌装，疫苗成品剂量为0.5ml/人份。联合 疫苗各病毒组分蛋白质含量彡4yg/人份。各组分蛋白浓度(μg/ml) =【各组分总蛋白含量(μ g/ml) X目标抗原含量(U/ml)】+各病毒原液抗原含量(U/ml)。
[0131] 实施例7三批疫苗一致性检验
[0132] (1)连续三批EV71、CA16、CA10疫苗原液制备
[0133] 按照实施例1~3确定的工艺，进行连续三批大规模EV71疫苗原液的生产，对各疫 苗原液进行抗原含量、蛋白质含量、BSA含量、纯度(HPLC法)检测，并对各批次病毒灭活液和 疫苗原液进行灭活效果验证，计算总抗原回收率和总蛋白质去除率。结果见表12。并对EV71 病毒收获液和原液进行电镜观察。
[0134] 表12连续三批EV71疫苗纯化效果
[0136] 按照实施例1~3确定的工艺，进行连续三批大规模CA16疫苗原液的生产，对各疫 苗原液进行抗原含量、蛋白质含量、BSA含量、纯度(HPLC法)检测，并对各批次病毒灭活液和 疫苗原液进行灭活效果验证，计算总抗原回收率和总蛋白质去除率。结果见表13。并对CA16 病毒收获液和原液进行电镜观察，结果见图2A和图2B。
[0137] 表13连续三批CA16疫苗纯化效果
[0139] 按照实施例1~3确定的工艺，进行连续三批大规模CAlO疫苗原液的生产，对各疫 苗原液进行抗原含量、蛋白质含量、BSA含量、纯度(HPLC法)检测，并对各批次病毒灭活液和 疫苗原液进行灭活效果验证，计算总抗原回收率和总蛋白质去除率。结果见表14。并对CAlO 病毒收获液和原液进行电镜观察。
[0140] 表14连续三批CAlO疫苗纯化效果
[0142] 通过表12-14研究结果显示，显示灭活工艺安全可靠、纯化工艺稳定可控，可线性 放大用于规模化生产。
[0143] (2)连续三批联合疫苗的制备
[0144] 利用实施例7(1)中制备的三批原液按实施例6确定的制剂工艺进行连续三批联合 疫苗的制备化￥71目标量4001]/人份、0416目标量4001]/人份、0410目标量4001]/人份 ;0.51111/ 人份）。检测EV71/CA16/CA10联苗成品中的氢氧化铝含量、上清抗原含量、解离后抗原含量， 计算吸附率及解离率，结果见表15。
[0145] 表15联苗成品检测结果
[0147] (3)免疫原性采用三批联苗按实施例4(1)确定的动物模型，分别两针免疫大鼠和 小鼠，检测血清中的中和抗体滴度。同时设立单价苗对照和阴性对照。重复三次。用微量细 胞病变法检测中和抗体效价。检定用细胞为RD细胞，中和实验在37 °C培养7天，观察细胞病 变。中和抗体效价及阳转率结果见表16。联和疫苗中各病毒组份免疫原性分别与相对应单 价苗进行统计学分析，结果见表17。根据统计分析，联苗与单苗的中和抗体GMT值均无显著 差异(P值均大于0.05)。
[0148] 表16单价苗与联合疫苗各病毒组份免疫中和抗体效价
[0150]注:表中数据为三次实验结果的平均值。
[0151 ]表17联合疫苗各病毒组份免疫中和抗体效价与单价苗比较(P值）
[0153] (4)攻毒保护采用三批联苗按实施例4(2)的攻毒保护方法进行攻毒，计算半数死 亡保护剂量和半数发病保护剂量，结果见表18。
[0154] 表18联苗攻毒保护结果
[0156] 实施例8联合疫苗安全性评价
[0157] (1)在评估各联合疫苗免疫原性的整个实验期内，所有动物均健康存活，临床表现 无异常。
[0158] (2)对实施例7的三批EV71/CA16/CA10联合疫苗并进行了动物安全性评价，包括异 常毒性试验、小鼠急性毒性试验及豚鼠主动过敏试验。
[0159] 异常毒性试验包括小鼠试验和豚鼠试验。小鼠试验中，EV71/CA16/CA10联合疫苗 注射18~22g小鼠5只，0.5ml/只，观察7d。观察期内，小鼠全部健存，且无异常反应，到期时 小鼠体重增加。豚鼠试验中，EV71/CA16/CA10联合疫苗注射250~350g豚鼠2只，5ml/只，观 察7d。观察期内，豚鼠全部健存，且无异常反应，到期时豚鼠体重增加。
[0160] 小鼠急性毒性试验中，EV71/CA16/CA10联合疫苗采用最大给药量法肌肉注射给予 昆明小鼠，剂量为8000U/kg体重(相当于体重0.5岁儿童临床使用剂量的约120倍），给药动 物未出现异常临床症状和死亡。
[0161 ]豚鼠主动过敏试验中，Hart I ey豚鼠经肌肉注射致敏给予联合疫苗3次，致敏剂量 0.5ml/只/次，隔天给药。在末次致敏给药后第14天经静脉注射激发给药，激发剂量1.0 ml/ 只/次，给药1次。试验动物在激发给药后连续观察过敏反应，试验结果显示EV71/CA16/CA10 联合疫苗在豚鼠全身主动过敏试验中过敏反应为阴性。
[0162] 实施例9联合疫苗稳定性评价
[0163] 将实施例6制得的联苗成品1、成品2和成品3储存在2_8°C环境下，按时间点取样检 测抗原含量、外观、装量、PH值、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、甲醛含量等。记录数据至12个 月，并在12月检测疫苗的异常毒性及免疫原性。联苗成品2-8°C放置12个月，各项检测指标 均未见明显下降。结果见表19和表20。
[0164] 表19 2~8°C联苗成品抗原含量检测结果(标示量的百分比）
[0166]表20 2~8°C联苗成品检测结果
[0169] 注：表示未进行此项检测。
[0170]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种预防手足口病的联合疫苗，其特征在于，其含有灭活的EV71抗原、灭活的CA16抗 原和灭活的CA10抗原。2. 根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗EV71、CA16、CA10的抗原 含量分别为100-1000U/人份、100-1000U/人份、100-1000U/人份。3. 如权利要求2所述的联合疫苗，其特征在于，EV71、CA16、CA10的抗原含量分别为200-800U/人份、200-800U/人份、200-800U/人份。4. 权利要求1-3任一所述的联合疫苗，其特征在于，其病毒纯化液通过以下步骤制备得 到： ⑴分别将EV71、CA16、CA10病毒液灭活，超滤浓缩； (2) 分别对上述三种病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心； (3) 收集合并离心液。5. 如权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，步骤(1)中， EV71病毒液的制备方法为:EV71病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为:0.0001 -0.001，培 养用血清浓度:2%牛血清，培养温度:36 ± 1°C，收获时间为7-9d; CA16病毒液的制备方法为:CA16病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为:0.001-0.01，培养 用血清浓度：1 %牛血清，培养温度:35 ± 1°C，收获时间为8-10d; CA10病毒液的制备方法为:CA10病毒接种人二倍体细胞，接种MOI为:0.001-0.01，培养 温度:35±1°C，收获时间为7-9d。6. 如权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，步骤（1)中，灭活方法为甲醛灭活，甲醛 灭活的终浓度为67-200μg/ml。7. 如权利要求6所述的联合疫苗，其特征在于，甲醛灭活时间为：37±1°C条件下，灭活 2.7-5.4d〇8. 如权利要求5-7任一所述的联合疫苗，其特征在于，步骤（1)超滤浓缩采用孔径为 300kD的超滤膜包，EV71病毒灭活液等体积超滤8次，CA16病毒灭活液3倍体积超滤8次，CA10 病毒灭活液等体积超滤8次。9. 权利要求1-3任一所述的联合疫苗，其特征在于，还含有铝佐剂。10. 权利要求9所述的联合疫苗，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝，其在联合疫苗中 的氢氧化铝含量终浓度为〇. 36~1.73mg/ml。
【文档编号】A61K39/125GK105963692SQ201610465798
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】刘可心, 刘兆梅, 王巍巍, 张燕, 张星星, 李雅静, 高强, 尹卫东
【申请人】北京科兴生物制品有限公司