专利名称：单剂基因工程乙肝疫苗缓释微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物和药物载体，可用于制备靶向控释疫苗或药物，属于生物医用高分子材料及靶向药物控释系统领域。
乙型肝炎(Hepatitis B，HB)是一种严重影响人类健康的世界性的传染性疾病，到目前为止，全世界约有三分之一的人口(约20亿)感染了乙肝病毒(HBV)，他们中约有3.5亿人为慢性携带者，其中又有四分之一的人最终死于乙肝病毒感染引起的肝硬化及原发性肝癌。中国是亚洲唯一的乙型肝炎高发流行区，约有2亿人口携带乙肝表面抗原(HBsAg)。迄今为止，尚无有效的治疗药物，所以预防接种尤为重要。安全、高效、价格低廉的疫苗是目前控制HBV感染的主要手段。1986年，通过基因工程获得了重组乙肝疫苗，该疫苗具有免疫效果好(达85％-95％)，副作用更小，可大量获得，价格低等优点。但是目前常用的基因重组乙肝疫苗均是以0、1、6月或0、1、2、12月的方式接种。接种费用高，次数多，所需时间长、造成操作不方便，儿童和老人不易接受，易导致漏种率高、整体免疫效果差等问题。疫苗在体内受到酸、碱及生物酶的作用，蛋白高级结构易受到破坏，发生降解或排除体外，因此常需加大剂量和增加接种次数。同时，某些人群，如年老、肥胖、吸烟及免疫力低下的人等对重组乙肝疫苗反应性较低。
本发明的目的是为了解决以上问题，开发新一代更方便可靠，免疫原性更强的长效控释疫苗制剂。口服缓释、控释制剂是近代国内外医药工业发展的重要方向，由于开发周期短，投入较少，经济风险低，且因产品技术含量增加而附加值显著提高等优点而被制药行业看好。微球技术已广泛用于药物、多肽和蛋白疫苗的研究与开发。基于可生物降解聚合物的疫苗微球控制释放体系不仅能提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作用，简化给药方式，而且药物的释放可通过聚合物的降解控制，进行缓慢释放或脉冲释放，药物释放完毕后，载体材料不需取出。本发明制备的单剂注射或口服的可生物降解基因工程乙肝疫苗微球剂型，将克服普通疫苗制剂需多剂注射方能凑效的缺点，具有重要的意义。完成单剂基因工程乙肝疫苗缓释微球制剂接种的费用只有完成目前使用的重组乙肝疫苗接种费用的三分之二，可大大地减轻人民群众免疫接种的经济负担，而且通过单剂注射或口服方式接种，儿童和老人更易接受，这可大大提高乙肝疫苗的普种率，从而可降低乙肝发病率，最终为中国乃至世界根治乙肝奠定基础。
基因工程药物和疫苗可生物降解聚合物缓释微球的优越性是十分明显的，对这类靶向控制释放体系的载体材料，国内外曾采用聚苯乙烯和白蛋白、脂质体等作为载体，前者不能生物降解，后者其生物降解周期短；显然，这些材料用于制备缓释靶向控释制剂是不合适的。近年来，国外已着手研究以可生物降解聚合物免疫佐剂材料，如聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)等，来制备靶向药物控制释放体系，取得了一些令人满意的结果。1984年，Allen(Am.J.Nat.1984，170，483-489)的研究证实用聚乳酸微粒作为抗原提呈系统的可能性；Eldridge(Molecular Immunology，1991，28，287-292)及O’Hagan(Immunology，1991，73，239)的研究证实口服具有特定粒径及分布和表面性质的微球，可通过消化道进入人体，对网状内皮系统达到良好的靶向性，同时具有缓释抗原和佐剂效应，能在较长时间内刺激机体产生较强的免疫效应；Singh(Vaccine，1997，15(5)，475)的研究证实用PLGA包裹乙肝病毒表面抗原(HBsAg)后，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹法检测微球中释放的抗原，发现抗原几乎没有改变；Chang(J.Pharm.Sci，1996，65，129)的研究采用复乳溶剂挥发法制备破伤风毒素(TT)PLGA微球，TT包封率超过90％，载药量为0.48-0.9％；Tabata(Biometerials，1988，9，356-362)用粒径分布窄、表面疏水的微球经注射后发现巨噬细胞对粒径为1.0-2.0微米的微球吞噬量大。但是，研究表明目前用于制备微球的可生物降解聚合物载体仍存在一些不足，如蛋白包裹量低(约1％左右)，口服后持续作用时间短，且免疫效果增强不明显等。为了提高聚合物与抗原的亲合性，本发明将亲水性的聚乙二醇引入疏水性的聚乳酸链段中，制备出了双亲性聚-D，L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)。该材料已经四川省工业卫生研究所进行生物医学评价，证明其具有无毒、安全和良好的生物相容性。邓先模(J.Control.Release，1999，58，123-131)及李孝红(J.Int.Pharm.1999，178，245-255)用PELA制备的微球蛋白包裹量可达3～5％，包裹效率在80％左右。
国内外文献报道的用聚乳酸及其共聚物制备的微球，主要存在以下不足(1)作为药物载体材料的聚乳酸及其共聚物是疏水性材料，对亲水性的疫苗或药物亲合性不强，导致包裹量和包裹效率低；(2)工艺条件不稳定；(3)具有生物活性的疫苗或药物经包裹后易丧失活性；(4)微球制备技术不稳定，难于放大。
本发明的目的在于提供一种以双亲性的聚-DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)为载体材料，粒径在5微米以下，表面光滑无粘连，疫苗携载量为3％以上，不但能诱导比铝佐剂乙肝疫苗持续时间更长，抗体水平更高的免疫效果，而且能诱导淋巴T细胞增殖的缓释乙肝疫苗微球的制备方法。
本发明的技术内容(1)聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)载体材料的合成摒弃了以辛酸亚锡为催化剂制备PELA的传统方法，而采用无毒的非锡催化剂，通过常压溶液聚合法制备医用PELA，载体材料的国产化可大大降低微球制剂的生产成本；(2)微球的制备采用乳液溶剂抽提法制备出了包裹量3～5％，包裹效率80％左右，动物免疫增强效果明显且具有良好靶向性基因工程乙肝疫苗缓释制剂。
本发明微球基质材料选用粘均分子量40,000，聚乙二醇(PEG)嵌段为10％(W/W)的PELA共聚物。与目前的其它可生物降解聚合物载体相比，它有更多优点可提高微球中蛋白疫苗包裹量及包裹效率，提高微球中包裹蛋白的比活性及制备过程蛋白活性收率等。此方法对其它乳酸类共聚物也适用。但对本发明，选择的乳酸类共聚物分子量应在8×103～9×104范围内。
本发明的水相分散介质，采用水解度为80％～95％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，PVA的重均分子量为10,000～100,000，其浓度范围是1％～50％。
作为本发明基质材料的有机溶剂是丙酮，甲醇和二氯甲烷或它们的混合溶剂。
作为本发明的功能输入装置采用电子恒速搅拌器，其搅拌速度为200～2000转/分。
作为本发明的前期乳化时间为1～30分钟。
采用本发明可制得具有良好生物相容性，可生物降解，疫苗结构保持完整，通过单剂注射或口服就能获得良好免疫效果，且在一定程度上还能治疗乙肝的缓释高分子微球。该微球粒径在5微米以下，表面光滑无粘连(
图1)，粒径分布在0.5～5微米(图2)，符合口服或注射靶向给药的要求。
本发明的积极效果是本发明由于采用双亲性的聚乳酸-聚醚嵌段共聚物(PELA)作为基因工程乙肝疫苗的载体，保证了载体中抗原的活性。采用改进性双乳液体系溶剂挥发法制备出了包裹量3～5％，包裹效率80％左右，动物免疫增强效果明显且具有良好靶向性基因工程乙肝疫苗缓释微球制剂。本发明的微球势必成为新一代给药更方便，预防接种费用更低，儿童和老人更易接受，免疫性更强的药物制剂。它将对我国医药行业的发展起到巨大的推动作用，将促进我国化学合成药物、激素、疫苗、多肽和基因控制释放剂型的研究开发。
下面为
具体实施例方式实施例1粒径小于5微米的共聚物微球的制备。准确称量PELA10g，溶于100ml二氯甲烷中。量取PVA水溶液(12％)150ml，装入500ml的三颈瓶。开动电子恒速搅拌，转速150转/分。将完全溶解的PELA溶液慢慢滴加入水相分散介质。加料完毕后，转速增至800转/分，维持此搅拌速度25分钟，然后将转速降至200转/分，持续搅拌8小时。待溶剂挥发完毕，将乳液离心分离，离心速度7000转/分，时间10分钟，倒去上层清液，用蒸馏水洗涤沉淀。重复四次，收集白色沉淀，冷冻干燥，产率95％。
实施例2包裹量为3％，粒径小于5微米的基因工程乙肝疫苗缓释微球的制备。准确量取4ml乙肝疫苗水溶液(3.0mg/ml)。准确称量PELA0.8g，溶于8ml二氯甲烷中。将共聚物有机溶液放入超声分散装置中，在超声分散条件下，慢慢加入乙肝疫苗水溶液，超声分散20分钟得到油包水乳液。量取PVA水溶液(12％)15ml，装入100ml的三颈瓶。开动电子恒速搅拌，转速150转/分。按实施例1将油包水乳液滴加入水相分散介质，转速增至800转/分，维持此搅拌速度25分钟，然后将转速降至200转/分，持续搅拌8小时，然后按实施例1洗涤处理。冷冻干燥，产率95％。
附图及说明图1.采用本发明制备的PELA微球的扫描电子显微镜照片。用扫描电子显微镜(SEM美国AMRAY)观察表面形态。图2.采用本发明制备的PELA微球的粒径分布图。用激光粒度散射仪(岛津SALD-2009)测定粒径大小及分布。
权利要求
1.一种单剂基因工程乙肝疫苗缓释微球的制备方法，其特征在于微球基质为新型的聚-DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)，PELA的粘均分子量为8×103～9×104，基因工程乙肝疫苗为包裹对象，包裹量可达3％以上，包裹效率在80％左右，微球粒径分布在5微米以下，微球作为携载疫苗的载体，可用于对生物的靶向给药及控制释放。
2.根据权利要求1的微球制备方法，其特征按以下步骤制备(1)PELA共聚物溶于有机溶剂中形成有机溶液；(2)在搅拌下将乙肝疫苗加入有机溶液；(3)在搅拌下将上溶液加入到水相分散介质中；(4)在搅拌下待有机溶剂挥发完；(5)用水在离心条件下洗去水相分散介质；(6)冷冻干燥得到基因工程乙肝疫苗缓释微球粉末。
3.根据权利要求1的微球，其特征是聚乙二醇(PEG)在微球基质中的重量百分比为5％～50％，PEG的分子量为4×102～2×104。
4.根据权利要求2的方法，其特征是有机溶剂为丙酮，甲醇和二氯甲烷或它们的混合溶剂。
5.根据权利要求2的方法，其特征是PELA有机溶液的浓度为1％～50％(W/W)。
6.根据权利要求2的方法，其特征是水相分散介质为聚乙烯醇(PVA)水溶液，PVA的水解度为80～95％，重均分子量为10,000～100,000，浓度为1％～50％。
7.根据权利要求2的方法，其特征是搅拌速度为200～2000RPM。
8.根据权利要求1制备的微球，其特征是通过单剂注射或口服该乙肝疫苗缓释微球不但能获得良好的免疫效果，且在一定程度上能达到治疗乙肝的效果。
9.根据权利要求1制备的微球，其特征是该微球剂型具有能降低铝佐剂的毒副作用，简化给药方式，提高疫苗的生物利用度。
10.根据权利要求1制备的微球，其特征是该乙肝疫苗微球体系可用于多肽药物、其它疫苗和基因药物等控制释放剂型的制备。
全文摘要
本发明用可生物降解的聚－DL－乳酸－聚乙二醇嵌段共聚物(Poly－dl－lactide－b－polyethylene glycol,PELA)作为疫苗载体材料。以双乳液体系溶剂抽提法,在机械搅拌下制备微球。微球外观规整、光滑,粒径大小和分布可控。抗原包裹量可达3%以上,包裹效率在80%左右。该发明可提供给药方便,安全,接种一次就能奏效的长效缓释乙肝疫苗微球剂型。
文档编号A61K47/32GK1370601SQ01107158
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月22日 优先权日2001年2月22日
发明者周绍兵, 李孝红, 邓先模 申请人:中国科学院成都有机化学研究所