专利名称：基因工程乙肝预防、治疗疫苗的细胞株及菌株的构建方法
乙型肝炎病毒(HBV)是引起人类肝脏疾病的主要病毒。许多人被HBV感染都要经历一个急性的阶段，慢性阶段或恢复。然而，许多人不能完全被治愈，成为慢性乙型肝炎病毒携带者。HBV感染在世界的许多地区是具有地方性的，所以分不同的亚型。在围产期由慢性感染的母亲传染给她们的新生儿有很高的感染发生率。全世界的慢性乙型肝炎病毒携带者大约四亿人。在携带者中，每年约有10-20％可能发展成为肝硬化以至转为肝癌。肝炎疾病的预防与治疗引起全世界的关注。
目前，国际上应用的乙型肝炎疫苗主要是用酵母或CHO细胞表达的S蛋白作为预防疫苗，但都没有治疗作用。而且基因酵母疫苗是因为合成的抗原蛋白未经过糖基化，故对人体的免疫效果较差；而基因CHO细胞产生的疫苗抗原蛋白经过糖基化修饰，免疫源性虽好，但产量很低，尚难满足市场需要。总之，现用的基因工程乙肝疫苗是S小蛋白疫苗，不能保护由于S基因变异株的感染或抗体应答迟缓。虽然现有的乙肝疫苗为预防乙型肝炎做出了巨大贡献，但现在用基因工程乙肝疫苗人群接种后，仍有大约15％人群无或低(3IU/ml)抗体应答，而成为易感人群。
1971年/Krugman等人最先使用乙肝表面抗原(HB3Ag)阳性血清制备乙肝疫苗预防乙肝病毒感染，开创了病毒尚不能在实验室繁殖的情况下制备疫苗的先例。但这种血源疫苗存在一些问题，如血源有限，成本较高，带有一定的潜在性危险等，特别是近年来艾滋病流行，血液制品易受艾滋病毒污染，致使乙肝血源疫苗的使用在一些国家受到限制。一直延用至1998年6月。然而，乙肝血源疫苗的生产和使用，提供了HBsAg的主蛋白，可以诱生良好的保护性抗体，使人免受HBV侵袭，这一事实为研制乙肝第二代疫苗奠定了良好基础。随着基因工程技术的飞速发展，使基因工程乙肝疫苗的研制成为可能。
80年代以来科技工作者应用基因工程技术试图在原核细胞(如E、coli)真核细胞(如酵母)和哺乳动物细胞中表达HBsAg，相继开发了酵母乙肝疫苗和CHO细胞产生的疫苗。由于现在开发的基因工程乙肝疫苗存在免疫效果差和产量低，只有预防作用又无治疗作用。所以我们研究开发了新的第三代基因工程乙肝预防和治疗疫苗。三个表达质粒携带三个不同的乙肝病毒的基因亚型；即adw、adr、ayw亚型。采用三个表达质粒转入同一个表达细胞是独家首创。
本发明创造的目的是提供一利基因工程乙肝预防、治疗疫苗的细胞株及菌株的构建方法，用于制备该疫苗的基因重组细胞株内的目的基因分别由前S1、前S2、S(adw)、S(sdr)、S(ayw)五部分组成，分别为亚洲亚型和欧美亚型，这五部分目的基因分别由于三个质粒携带，一个质粒携带前S1/S(adw/adw)，第二个质粒携带前S2/S(ayw)，第三个质粒携带S(adr)，每个质粒的启动子后加一个分泌肽与目的基因相连接，三个质粒转入同宿主细胞(CHO)内表达，然后表达产物自动整合为均匀含有五部分多肽的球型颗粒蛋白分泌到宿主细胞外。
基因工程乙肝预防、治疗疫苗的细胞株及菌株的构建方法，携带前S1/S(adw/adw)的质粒，携带前S2/S(ayw)质粒和携带S(adr)质粒转入同一个CHO细胞中，构建成基因工程细胞株，用于制备乙型肝炎病毒预防、治疗疫苗或诊型肝炎细胞株。
为了降低前S1/S粒子的分子量，将S基因不影响抗原性的前32个氨基酸切去，与前S1的26个氨基酸连结，得到220个氨基酸的抗原。前S2的55个氨基酸与S(ayw)完整分子结合，构成前S2/S抗原由281个氨基酸组成。
选用CHO细胞作为表达宿主细胞可以满足糖基化的要求，该细胞已被医药管理部门批准，用于基因工程乙肝疫苗生产多年，对其特征了解较多，可连续培养，适于大批量生产。
HBV DNA:1确诊乙型肝炎患者adw亚型血清200ml经过20000rpm离心，收集沉淀溶于200ul生理盐水中，加入400ulGSL溶液(4.0mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，PH7.0,0.5％n-K-Lauroyl sarcosiue),400ul用Tris-HCI PH8.0饱和酚及100ul水饱和的氯份/异戎醇，摇30秒，10.000rpm离心15分钟，取水层，加20ul tRNA及1/10体积3mol/L NaAc pH4.7，加2.5倍体积无水乙醇，-20℃度1小时，同上离心收DNA干燥后溶于75ul蒸馏水中备用。2)乙型肝炎患者(ayw)肝检标本，放液氮中保存，取出碾碎，加0.2mlTEN淡冲(10mmol/Ltis-HCL pH8.0,1mmol/LEPTA,10mmol/LNaCL),4ul蛋白K(10ng/ml)和5m120％SDS混均，55℃反应4小时，加等体积酚/氯仿，摇10分钟，收水相，反复用酚/氯仿抽提三次，至水相清亮透明，加1/10体积的3mol/LnaAc及2.5倍体积无水乙醇，-20℃过夜，离心回收DNA备用3)用相同的方法得到HBVadr亚型DNA备用。
PCR引物，P1,P2用于合成前S1区段，编码26个氨基酸的84个碱基对，P1的5’端插入一个蛋白质白质转录起始密码ATG及S蛋白的前二个氨基酸，联接表达载体所需的ACC，和下一步克隆所需的HindⅢ酶切位点。P2与前S1序列相同。
P3、P4用于合成编码adw亚型的S区段33-226位的氨基酸的碱基对，P3与此段S基因33-35位氨基酸的碱基相同，P4引物中加入NotⅠ酶切位点。P130bp5’-AAG CTT ACC ATG GAG ACC AAT CCT CTG GGA 3’P218bp5’-GGG ATT GAA GTC CCA ATC-3’P318bp5’-AGT CTA GAC TCG TGG TGG-3’P424bp5’-GCG GCC GCT CAA ATG TAT ACC CAA-3’PCR操作前S1和S扩增，分别进行，操作相同，(ⅰ)0.5ml小塑料管，加引物(前S1为P1,P2；S为P3、P4)各100pmol,10倍PCR缓冲液(500mmol/kcl,100mmol/L Tris-HClpH8.4,25mmol/L MgCl2,0.1％明胶)5ul,TagDNA聚合酶1个单位，4种dNTP各200ul mol/L，加水25ul,(ⅱ)加入25ulHBVDNA摇数秒，(ⅲ)离心5秒，加入25ul矿物油，(ⅰⅲ)扩增30个循环，95℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，完成后，72℃延伸9分钟。扩增产物前S1及S分别用琼脂糖电泳进行纯化。纯化的前S1及S片段，用klenow酶处理，切成前头末端。前S1与S的PCR融合，以纯化的平端前S1及S基因为模板，用P1及P4引物进行PCR扩增，得到前S1/S融合PCR产物，大约为699bp，用琼脂糖电泳提纯。用HindⅢ/NotⅠ双酶水解后得到692bps S1/S DNA片段。表达质粒构建表达载体pcDNA3/Hygro购自Invitrogen前S1/S基因与带有分泌肽Igk的pcDNA3.1/Hygro连接，纯化的前S1/S基因用HindⅢ及NotⅠ双酶切，与事前用HindⅢ及NotⅠ双酶切的pcDNA3.1/Hygro载体连结，用常规方法转化于大肠菌JM109，利用抗氨苄青霉素特征，纯化克隆菌株，增殖，提取质粒DNA，酶切，测序结果与设计一致，成功构建了pCMV/H3/HS1-S质粒。
HBV DNA选ayw根据前S2/S基因DNA序列合成引物P5,P4,P5插入HindⅢ断制剂A、在前S1/S(adw/adw)质粒表达的多肽中，前S1部的表达产物仍存在21-47部位的26个氨基酸的残基，S(adw)部分缺失前32个氨基酸的残基；B、前S2/S(ayw)质粒内含完整的前S2和完整的S(ayw)基因；C、S(adr)质粒内含完整的S(adr)基因；D、启动子的特点是应用CMV启动子，在启动子后目的基因前加一个分泌肽，三个质粒分别加入不同的抗性基因。
乙型肝炎抗原由前S1/前S2和S三个区段组成，S区段为主蛋白，接种后产生抗乙型肝炎抗体，为当前乙型肝炎疫苗的有效成分。但人群接种S抗原疫苗后，抗体还不能全部阳转。前S部分能提高S抗原的免疫原性，增加抗体阳转率。前S1有肝细胞结合位点，前S2有白蛋白结合位点，通过白蛋白也能与肝细胞结合，前S区段还能激活接种者的细胞免疫和分泌r-干扰素，白细胞介素-Ⅱ等细胞因子，因而除提高S抗原的预防效果外，尚有治疗乙型肝炎病的作用。本研究目的即为研制带前S的前S1/前S2/S疫苗，用于乙型肝炎的预防与治疗。
乙型肝炎有四个血型，即adr、adw、ayr、ayw，亚洲流行的乙型肝炎为adr和adw，二者主要抗原部分相似，可以交叉保护。从全球流行病看以adw、ayw为主，制备adw和ayw亚型疫苗可以涵盖世界大部分地区。
乙型肝炎抗原有含前S1/前S2/S的大分子抗原，含前S2/S的中分子抗原，及只含S的小分子抗原。含前S1/前S2/S区段的最佳，但分子量太大，构建的质粒在哺育动物细胞中表达困难，因此，我们将三个区段分别重组，组建成三个质粒Sadr，前S1/S(adw/adw)，前S2/S(ayw)，共转染于CHO细胞中，产生含前S1(adw)/前S2/S(ayw)和Sadr抗原粒子。构建成一个完满的重组乙切点，P4插入NotⅠ切点P55’-ATC AAG CTT ATG CAG TGG AAT TCC ACA ACC-3’P45’-GCG GCC GCT CAA ATG TAT ACC CAA-3’构建带有分泌肽Igk的pCDNA 3.1/zeo前S2-S质粒，以HBVDNA(ayw)模板，P5及P4引物进行PCR扩增，得到864bps的前S2/S DNA片段，琼脂糖纯化后，与载体pcDNA 3.1/zeo连结，方法同三节。转化于大肠菌JM109，利用抗氨苄青霉素特征纯化克隆菌株，扩增后提DNA，酶切、测序结果与设计一致，确认获得了pCMV/H3/ZS2-S质粒。
根据adr基因的DNA序列合成DNA引物P6,P4。在P6的引物中人为的插入HindⅢ的酶切位点。引物P630bp5’-ATC AAG CTT ACC ATG AGC ACA ACA TCA-3’P4同上。
用PCR的方法，将S(adr)基因扩增并加以修饰，在N′端带有HindⅢ的酶切位点。C′端带有NotⅠ的酶切位点。S(adr)的扩增产物，用脂糖电泳进行纯化。所得到692bps HindⅢ./NotⅠ片段并连接于用HindⅢ/NotⅠ双酶水解的带分泌肽Igk的pcDNA3.1/Neo表达载体。转入大肠菌JMl09中，通过氨苄青霉素的筛选纯化得到pCMV/H3/NS质粒。该DNA通过酶切，测序的结果与设计一致。
实施例1应用磷酸钙介导转染法，先将pCMV/H3/NS质粒转染CHO细胞株中，方法同上，转染后12-24小时内，加入G418(1mg/ml)，进行抗药性筛选纯化。待CHO细胞长成单层，用胰蛋白酶消化，计数，再将细胞悬液稀释成每100ul内含一个细胞，取96孔培养板，每孔加稀释的细胞悬液100ul，令每孔只有一个细胞，长成单层后，进行传代，不断扩增，由96孔-24孔-6孔，转入25cm2培养瓶，对获得的所有克隆株，测培养液中的S抗原含量，选出高表达细胞株，一般40-50个克隆中，可选出1-2株高表达细胞株。称为CHO-S细胞株(图3)。
用同样方法将pCMV/H3/HS1/S质粒DNA转入CHO-S细胞株中，转染后12-24小时内，加入Hygromycin(100ug/ml)，继续培养24小时，对生存细胞进行传代扩增，传代培养液中均需加Hygromycin，进一步筛选纯化，测定培养液中前S1/S和前S的表达，选出CHO-S1/S高表达细胞株(
图1)。
用同样方法将pCMV/H3/ZS2/S质粒DNA转染CHO-S1/S细胞中，加Zeocin(200ug/ml)筛选，细胞传代增殖后，用ELISA法测培养液中前S1/S2/S蛋白，选取表达S1/S2/S蛋白的细胞株，进一步克隆纯化，同时在培养液中加入G418和Hygromycin己防止先期的二个质粒DNA丢失或质粒拷贝数减少。进一步筛选纯化，测定培养液中Sadr，前S1/S和前S2/S的表达，通过进一步稀释克隆筛选出S1/S2/S高表达细胞株，进行全面检定(图2)。
重组CHO-S1-S2-S细胞株，收集CHO-S1-S2-S细胞株培养液，提纯抗原蛋白。供制备疫苗和诊断试剂。
实施例2将所得到的S1/S(adw/adw)、S2/S(ayw)和S(adr)三个基因分别与酵母菌株的高表达载体连接，得到三个不同的质粒DNA。通过酶切、测序证明连接正确以后，分别转化到同一个酵母菌体内。通过菌株克隆，抗药性筛选。选出表达特异蛋白最高的菌株，用该菌株生产乙肝基因工程疫苗。该疫苗可以用于对乙型肝炎的预防和治疗。
实施例3
用分泌肽IgK基因连接到表达载体pcDNA3的CMV启动子后面，表达前S1/前S2/S。pcDNA3质粒具有一个单一的HindⅢ克隆位点。将pcDNA3用HindⅢ消化后，利用琼脂糖凝胶电泳质从pcDNA3质粒中除去切除部分。然后与带有HindⅢ末端IgK基因连接到载体，再与前S1/S、前S2/S、S三基因分别连接，转到宿主细胞中。用这种方式制备，高表达的基因工程细胞株。
重组前S1/前S2/S-CHO工程细胞。经过克隆筛选后所得到高表达细胞目的蛋白表达量能比不加分泌肽Igk的高5-10倍。
权利要求
1.基因工程乙肝预防、治疗疫苗的细胞株及菌株的构建方法，携带前S1/S(adw/adw)的质粒，携带前S2/S(ayw)质粒和携带S(adr)质粒转入同一个CHO细胞中，构建成基因工程细胞株，用于制备乙型肝炎病毒预防、治疗疫苗或诊断制剂A、在前S1/S(adw/adw)质粒表达的多肽中，前S1部的表达产物仍存在21-47部位的26个氨基酸的残基，S(adw)部分缺失前32个氨基酸的残基；B、前S2/S(ayw)质粒内含完整的前S2和完整的S(ayw)基因；C、S(adr)质粒内含完整的S(adr)基因；D、启动子的特点是应用CMV启动子，在启动子后目的基因前加一个分泌肽，三个质粒分别加入不同的抗性基因。
2.根据权利要求1所述的细胞株及菌株构建方法，携带前S1/S(adw/adw)的质粒，携带前S2/S(ayw)质粒和携带S(adr)质粒转入同一个CHO细胞中，构建成基因工程细胞株转入同一个酵母细胞内构建成的基因工程菌株，用于制备乙型肝炎病毒预防、治疗疫苗或诊断制剂。
3.根据权利要求1或2所述的细胞株及菌株的构建方法，所述的细胞株或菌株，经过培养产生的具有用于预防、治疗、诊断作用的，均含有S亚型和前S1、前S2部分多肽，并分泌于宿主细胞外的球型颗粒蛋白质。
全文摘要
本发明创造的目的是提供一种基因工程乙肝预防、治疗疫苗的细胞株及菌株的构建方法，用于制备该疫苗的基因重组细胞株内的目的基因分别由前S
文档编号A61K39/00GK1317571SQ01103990
公开日2001年10月17日 申请日期2001年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者刘柱, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所