一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法

一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种制备热稳定疫苗的方法，特别涉及一种联合使用基因工程和仿生矿化技术制备热稳定疫苗的方法。本发明提供一种利用基因工程技术在疫苗表面引入具有诱导无机物矿化能力的多肽的方法；(1)构建疫苗的基因克隆；(2)将多肽的核酸序列插入疫苗基因克隆中，得到重组克隆；(3)将重组克隆在细胞或大肠杆菌内表达，得到具有自矿化能力的疫苗。本发明还一种制备钙矿化上述制得的具有自矿化能力的疫苗的方法；(1)向有酸根的疫苗液加入Ca2+离子；(2)将体系进行孵育，获得磷酸钙包被疫苗。本发明通过疫苗矿化，高效地解决了疫苗运输和保存中的热失活现象，显著降低疫苗的财政支出，在新型热稳定疫苗生产中有很好的应用。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，具体涉及一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法，特别涉 及一种具有自矿化能力的疫苗及其制备方法，以及矿化该疫苗的方法。 一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法

【背景技术】
[0002] 传染性疾病对公共卫生安全造成严重的威胁，每年导致上百万人的死亡。疫苗接 种作为对抗传染病最有效的医疗手段，挽救了无数人的生命。特别地，减毒活疫苗（即病毒 的减毒毒株）成为最为重要的一种疫苗形式，在天花和脊髓灰质炎的消灭过程中发挥了巨 大作用。目前仍在临床使用的减毒活疫苗包括脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、 流感疫苗、黄热疫苗、风疹疫苗、轮状病毒疫苗、甲型肝炎疫苗以及腺病毒疫苗等。
[0003] 由于疫苗为典型的生物制品，具有温度敏感性，因此运输和保藏过程必须采用低 温环境（如冷冻）。据统计，由于储藏或运输不当，每年约有50%的疫苗被浪费。尤其在缺 乏可靠冷链基础设施的发展中国家和贫困地区，疫苗的低温保存仍然非常困难。疫苗的冷 链花费占据了大部分财政支出，每年超出2亿美元。尤其在发展中国家，冷链花费占全国疫 苗总财政支出的80%以上。因此，改善疫苗的热稳定性，制备热稳定的疫苗具有重大价值。
[0004] 现有的改善活疫苗稳定性的方法如下：（1)在液体或干粉状态的疫苗中添加稳定 齐[J，如重水、]\%(：1 2和非还原性糖；（2)在疫苗的冻干技术中，采用糖玻璃化干燥、喷雾干燥 等，以增强疫苗的稳定性；（3)借助蛋白质工程技术，通过增加亚单位之间的静电作用力， 衣壳-核酸的相互作用或者引入二硫键的方式等来增加疫苗粒子的热稳定性。（4)在液体 状态，利用矿化技术直接在疫苗表面形成磷酸钙矿化外壳的策略。以上策略在制定热稳定 疫苗应用上存在一些限制，例如方法（1) (2) (3) -般需要复杂的处理过程、方法（3)尚不能 产生良好的保护效果、方法（4)直接矿化的策略需要疫苗表面存在大量的对钙离子高吸附 性的基团，例如包膜病毒脂双层的磷脂分子，因此这一方法只能应用于某些特定包膜病毒 疫苗，而且该矿化需要高浓度的钙离子，可能对生物体或疫苗产生毒性。利用仿生矿化在疫 苗表面引入无机物外壳来提高疫苗的热稳定性是一种新型的、具有良好应用前景的策略。 为了提高该策略在制备热稳定疫苗领域的广泛应用性、实行方便性，本发明提出一种通过 基因工程技术或化学修饰技术在疫苗表面引入具有诱导无机物矿化能力的多肽，来实现疫 苗自矿化的策略。


【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有自矿化（self-biomineralization) 能力的疫苗；这种具有自矿化能力疫苗的制备方法，以及该疫苗的钙矿化方法。本发明制备 的钙矿化疫苗是一种具有核-壳结构的热稳定疫苗。按照本发明的方法制得的疫苗具有良 好的热稳定性，疫苗可以在25°C?37°C储存一周以上仍保持良好的疫苗活性，甚至在超过 37 °C的高温也能保持数天良好的疫苗活性。
[0006] 本发明提供了一种新型的、通过联合使用基因工程和仿生矿化技术制备热稳定性 疫苗的方法，本发明首先通过基因工程技术制得具有自矿化能力的疫苗，所述疫苗的表面 包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力；然后利用更为温和的仿生矿化手段制 得具有热稳定性的矿化疫苗，所述的矿化疫苗是具有核-壳结构的热稳定疫苗，其表面带 有无机物外壳，疫苗以及多肽被无机物外壳所包被（coated)，无机物外壳对疫苗有保护作 用，使疫苗能在常温或高温环境下保持活性。本发明的方法具有良好的生物相容性。由于 本发明在疫苗表面引入了具有诱导无机物矿化能力的多肽，使得疫苗的矿化能力不再依赖 于疫苗本身的性质，突破了利用矿化方法制备热稳定性疫苗的技术障碍，打破了疫苗本身 矿化能力的限制，可以适用于几乎所有的疫苗，大大拓宽了可矿化疫苗的范围，促进了利用 矿化方法制备具有热稳定性疫苗的应用，从而使疫苗的保存在很大程度上摆脱了对冷链的 依赖，具有非常好的经济效益和社会效益。
[0007] 本发明采用如下的技术方案： 一种具有自矿化能力的疫苗，所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物 矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程技术或化学修饰的方法引入。
[0008] 所述的基因工程技术，又称基因拼接技术、DNA重组技术，是指以分子遗传学为理 论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝 图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。例如，可以通过融合PCR技术或DNA重组技术将多肽的编码核酸序列导入疫 苗的核酸序列中。
[0009] 所述的化学修饰是指是用吸附、层层自组装、聚合、化学反应等方法将多肽引入疫 苗中。
[0010] 本发明所述的疫苗的自矿化能力是指疫苗具备了良好的矿化能力，能够在较宽泛 的无机离子浓度范围下实现矿化，即疫苗仅需孵育（incubation)在较宽浓度的无机离子的 溶液中，即可从周围溶液中富集无机离子到其表面，产生无机矿物相局部过饱和，进而发生 无机物在疫苗上的沉积矿化（如图1所示）。所述的自矿化能力是由于在疫苗表面引入了 (incorporated)具有诱导无机物矿化能力的多肽而产生的，多肽的引入导致疫苗矿化对无 机离子浓度的依赖性降低，使疫苗可以在较低的无机离子浓度实现矿化，从而避免了高浓 度的无机离子对生物体或疫苗产生毒性。
[0011] 本发明提供的自矿化疫苗是一种基因工程疫苗，是利用基因工程技术将具有诱导 无机物矿化能力的多肽引入到疫苗基因组克隆中而获得。
[0012] 所述诱导无机物矿化能力是指疫苗表面引入的多肽具有较强的螯合、吸附无机物 离子的能力，可以促使疫苗从溶液中富集无机物离子，导致无机物在疫苗表面的沉积矿化， 在疫苗表面形成包被疫苗的无机物外壳，从而实现疫苗的矿化。
[0013] 作为优选，所述的无机物可以是含钙矿物，所述的含钙矿物是指其主要的阳离子 成分是Ca 2+离子的矿物（mineral)，所述的含钙矿物可选自磷酸钙、碳酸钙、草酸钙中的任 意一种或任意多种。所述的无机物可以通过在疫苗溶液中加入Ca 2+离子(例如，加入可溶性 钙盐）和酸根离子(所述的酸根离子选自磷酸根离子、碳酸根离子、草酸根离子的任意一种 或任意多种，例如，可加入含有上述酸根离子的可溶性盐）形成矿物而获得。
[0014] 作为优选，本发明中涉及的疫苗自矿化能力是指疫苗在宽泛的Ca2+离子浓度下容 易实现矿化，获得磷酸钙矿化疫苗。所述的Ca 2+离子浓度可以是较低的浓度，例如Ca2+离 子浓度为4 mM以上，优选的Ca2+离子浓度为5. 5?20mM，更优选的Ca2+离子浓度为5. 5? 6. 5mM。所述的Ca2+离子浓度可以是较高的浓度，以疫苗不失活而且矿化疫苗中的无机物不 对生物体产生明显毒害为界。
[0015] 为了赋予疫苗自矿化能力，在疫苗表面通过基因工程或化学修饰的方法引入多 肽，所述的多肽具有较强的吸附无机离子能力，促使疫苗从周围溶液中富集无机离子，导致 疫苗表面无机矿物相过饱和，从而使疫苗具有自矿化能力，容易通过矿化的方法在疫苗表 面形成无机物外壳。
[0016] 当所述的无机物为含钙矿物，疫苗表面引入的多肽为含有羧基的多肽，多肽上的 羧基可以从周围溶液中富集Ca 2+离子，导致疫苗表面的钙矿物相过饱和，使疫苗具有自矿 化能力，容易通过矿化的方法在疫苗表面形成含钙矿物外壳。
[0017] 作为优选，所述含有羧基的多肽为含有天冬氨酸（Asp)和/或谷氨酸（Glu)的多 肽；更优选的，所述的含有羧基的多肽为富含天冬氨酸（Asp)和/或谷氨酸（Glu)的多肽， 所述的多肽中，天冬氨酸或者谷氨酸或者天冬氨酸和谷氨酸的组合占多肽全部氨基酸总数 的50%以上。
[0018] 更优选的，所述的多肽包含如下所示序列其中之一： X-X-Lys (X)-X-X-Pr〇-X-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-X-X-Lys-Phe-Leu-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-(X-X)n； Pro-(Phe-X) n-Pro ； 其中X为Asp或Glu，n为1-6。
[0019] 作为优选，本发明所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗，所述的单价疫苗是指由一 种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品，所述的多价疫苗是指由 一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以 是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
[0020] 所述的基因工程活载体疫苗是指用基因工程技术将病毒或细菌（常为疫苗弱毒 株）构建成一个载体，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。
[0021] 所述的多肽疫苗是指根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开 发设计的疫苗。
[0022] 所述的基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗，是指通过DNA重组技术，在受 体菌或细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因，制成的疫苗。该疫苗仅含有病原 体的部分抗原，使其免疫反应为单一蛋白质所诱导。
[0023] 作为优选，所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗，所述的病毒疫苗可以是脊髓 灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾 滋病疫苗等。
[0024] 本发明还提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含上述具有自矿化能力的疫 苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分，例如，可以包含缓冲剂、稳定剂以及医学上可 用的佐剂，尤其是A1 (0H) 3佐剂（Alum)。
[0025] 进一步地，本发明提供一种具有自矿化能力疫苗的制备方法，包括如下步骤： (1)构建疫苗的基因组克隆，得到疫苗核酸序列； (2) 将编码多肽的核酸序列插入步骤（1)获得的疫苗核酸序列的目的位置，得到疫苗 的重组克隆； (3) 将步骤（2)得到疫苗的重组克隆在细胞内表达，得到具有自矿化能力的疫苗。
[0026] 作为优选，所述的多肽为含有羧基的多肽。
[0027] 更优选的，所述含有羧基的多肽为含有天冬氨酸（Asp)和/或谷氨酸（Glu)的多 肽；进一步更优选的，所述的含有羧基的多肽为富含天冬氨酸（Asp)和/或谷氨酸（Glu) 的多肽，所述的多肽中，天冬氨酸或者谷氨酸或者天冬氨酸和谷氨酸的组合占多肽全部氨 基酸总数的50%以上。
[0028] 更优选的，所述的多肽包含如下所示序列其中之一： X-X-Lys (X)-X-X-Pr〇-X-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-X-X-Lys-Phe-Leu-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-(Χ-Χ)η ； Pro-(Phe-X)n-Pro ； 其中X为Asp或Glu，n为1-6。
[0029] 作为优选，所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗，所述的单价疫苗是指由一种病原 生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品，所述的多价疫苗是指由一种病 原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以是基因 工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
[0030] 作为优选，所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗，所述的病毒疫苗可以是脊髓 灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾 滋病疫苗等。
[0031] 本发明还提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含按照上述制备方法制得的 具有自矿化能力的疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分，例如，可以包含缓冲剂、 稳定剂以及医学上可用的佐剂，尤其是A1 (0Η) 3佐剂（Alum)。
[0032] 进一步地，本发明提供一种具有热稳定性的矿化疫苗，所述的矿化疫苗包括矿化 的无机物外壳和具有自矿化能力的疫苗，所述的无机物外壳包被在所述的具有自矿化能力 的疫苗的表面，所述的具有自矿化能力的疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机 物矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程技术或化学修饰的方法引入（参见图1)。
[0033] 作为优选，所述的无机物外壳选自磷酸钙、碳酸钙、草酸钙。
[0034] 作为优选，所述的多肽为含有羧基的多肽。
[0035] 更优选的，所述的含有羧基的多肽为含有天冬氨酸和/或谷氨酸的多肽。
[0036] 进一步更优选的，所述的多肽包含如下所示序列其中之一： X-X-Lys (X)-X-X-Pr〇-X-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-X-X-Lys-Phe-Leu-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-(Χ-Χ)n； Pro-(Phe-X) n-Pro ； 其中X为Asp或Glu，n为1-6。
[0037] 作为优选，所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗，所述的单价疫苗是指由一种病原 生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品，所述的多价疫苗是指由一种病 原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以是基因 工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
[0038] 作为优选，所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗，所述的病毒疫苗可以是脊髓 灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾 滋病疫苗等。
[0039] 本发明还提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含上述具有热稳定性的矿化 疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分，例如，可以包含缓冲剂、稳定剂以及医学上 可用的佐剂，尤其是A1(0H)3佐剂（Alum)。
[0040] 进一步地，本发明提供一种具有自矿化能力的疫苗的矿化方法，包括如下步骤： ⑴配制初始体系：将具有自矿化能力的疫苗配制成疫苗溶液，向疫苗溶液中加入Ca2+ 离子和酸根离子，所述的酸根离子选自磷酸根离子、碳酸根离子、草酸根离子的任意一种或 任意多种； (2)将所述初始体系在20°C?37°C、pH > 6. 0条件下进行孵育0. 5h以上，制得具有热 稳定性的矿化疫苗。
[0041] 为了提供更具稳定性的矿化疫苗，所述步骤（2)中，还包括在孵育完成后加入含 钙矿物的高亲和性大分子（如聚丙烯酸）的步骤。所述含钙矿物的亲和性大分子在体系中 的浓度为1 μ g/mL?100 μ g/mL，优选为10 μ g/mL。高亲和性大分子吸附在矿化形成的含 钙矿物外壳上，可提高含钙矿物外壳的稳定性，同时阻止具有含钙矿物外壳的疫苗颗粒进 一步聚集。
[0042] 其中，所述的疫苗溶液是指疫苗的水溶液，可以包含其他的离子成分。
[0043] 作为优选，本发明所述的疫苗为单价疫苗或多价疫苗，所述的单价疫苗是指由一 种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品，所述的多价疫苗是指由 一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述的生物制品可以 是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗、基因工程亚单位疫苗。
[0044] 作为优选，所述的基因工程活载体疫苗为病毒疫苗，所述的病毒疫苗可以是脊髓 灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾 滋病疫苗等。
[0045] 更优选的，所述的疫苗溶液是病毒疫苗的水溶液，其制备方法可以包括如下步骤： 将病毒感染哺乳动物细胞（如人RD，猴Vero细胞），采用无血清低糖DMEM培养液进行细 胞培养，得到病毒疫苗溶液。所述病毒疫苗水溶液的制备方法中，还可以包括如下步骤：将 所述细胞培养后的体系离心（具体离心参数为16000g、10 min)，收集上清液并过滤（具体 可采用0. 22微米孔径的滤膜），收集滤液（即为病毒疫苗液）的步骤。
[0046] 所述步骤（1)的目的是使Ca2+充分在疫苗周围富集，并自发矿化形成含钙矿物外 壳。疫苗溶液中的Ca 2+离子与酸根离子相互作用，形成含钙矿物外壳。可以通过在疫苗溶 液中加入Ca2+离子(例如，加入可溶性钙盐）和酸根离子(所述的酸根离子选自磷酸根离子、 碳酸根离子、草酸根离子的任意一种或任意多种，例如，可加入含有上述酸根离子的可溶性 盐）使疫苗溶液具有Ca 2+离子和酸根离子，所述的可溶性钙盐可以是CaCl2、Ca(N03)2 ;所述 的含有酸根离子的可溶性盐可以是可溶性磷酸盐，例如NaH2P04、Na 2HP04、Na3P04 (提供磷酸 根离子)，也可以是可溶性碳酸盐，例如Na2C03、NaHC0 3 (提供碳酸根离子)，还可以是可溶性 草酸盐，例如Na2C204 (提供草酸根离子)，或者是它们的混合物。
[0047] 作为优选，所述初始体系中，所述Ca2+离子浓度为4 mM以上，优选的Ca2+离子浓度 为5. 5?20mM，更优选的Ca2+离子浓度为5. 5?6. 5mM。本发明的矿化方法可以让疫苗在 较低的Ca2+离子浓度下实现矿化。
[0048] 作为优选，所述初始体系中，所述酸根离子的浓度为0. 5?2. OmM，更优选的浓度 为 0· 9 ?1. 0 mM。
[0049] 作为优选，所述初始体系中，所述疫苗溶液的浓度为50mg?10g/L。
[0050] 更优选的，所述初始体系中，若选用病毒疫苗，所述病毒疫苗溶液的浓度为108? 10 15 PFU/L。
[0051] 更优选的，所述初始体系中，若为病毒疫苗-磷酸钙矿化体系，体系中病毒疫苗、 Ca2+离子和憐酸根离子的配比为108?1015 PFU : 4. 0?20mmol : 0. 5?1. 5mmol 〇
[0052] 步骤（2)中的孵育过程是完成疫苗的矿化，制得具有热稳定性的矿化疫苗。
[0053] 为了实现疫苗的矿化，需要在pH > 6. 0条件下进行孵育，pH值太低会无法形成含 钙矿物；作为优选，所述步骤（1)、步骤（2)中pH为6. 5?9. 5;更优选的，所述步骤（1)、步 骤⑵中pH为7. 2。
[0054] 作为优选，所述步骤（2)的孵育温度为25°C?37°C，更优选的，所述步骤（2)的孵 育温度为37°C。
[0055] 作为优选，所述步骤（2)的孵育时间为lh?12h ;更优选的，所述步骤（2)的孵育 时间为2h。
[0056] 制得的具有热稳定性的矿化疫苗可以通过离心的方式进行富集，离心的参数具体 为：10000g ?16000g、5 ?30min。
[0057] 本发明由于在疫苗表面引入了具有诱导无机物矿化能力的多肽，导致疫苗可以在 宽泛的Ca 2+离子浓度，甚至较低的Ca2+离子浓度下实现矿化，其优点在于可以降低外源物质 对疫苗的影响，降低无机物修饰对疫苗应用的影响、保持疫苗的活性。更重要的，这种多肽 引入的方法使得疫苗的矿化能力不再依赖于疫苗自身的性质，突破了疫苗难以矿化的的限 制，可以适用于几乎所有的疫苗，大大拓宽了可矿化疫苗的范围，促进了利用矿化方法制备 具有热稳定性疫苗的应用。
[0058] 本发明还提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含上述制得的具有热稳定性 的矿化疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分，例如，可以包含缓冲剂、稳定剂以及 医学上可用的佐剂，尤其是A1(0H) 3佐剂（Alum)。
[0059] 此前世界普遍适用的脊髓灰质炎口服疫苗（poliovirus Sabin type 2 0PV株）， 肠道病毒EV71型与脊髓灰质炎病毒具有非常相似的大小、结构和组成。肠道病毒对亚洲儿 童的生命健康造成重大威胁但临床尚无认可疫苗，减毒活疫苗株在这种疾病预防中具有很 大前景。本发明提供了一种新型的通过联合使用基因工程和仿生矿化技术制备具有良好热 稳定性疫苗的方法，该方法制备疫苗具有可以遗传的矿化性质，矿化可在疫苗溶液中直接 完成，简单方便，突破了疫苗本身矿化能力的限制，可以适用于几乎所有的疫苗，适用性强。 因此，本发明对于疫苗的研发和使用，特别是在热稳定性减毒活疫苗研发和使用具有非常 广阔的应用前景。
[0060] 本发明通过基因工程技术将具有诱导无机物矿化作用的多肽引入了疫苗表面，这 些矿化多肽在疫苗表面多次重复出现并相对均一的分布在疫苗表面，引入的矿化成核肽可 以从溶液中富集无机物离子进而诱导无机物矿化，在疫苗颗粒表面形成具有保护作用的无 机物外壳（无机物薄层）。由于本发明的疫苗表面包含诱导无机物矿化的多肽，使得本发明 的方法突破了疫苗本身矿化能力的限制，可以适用于几乎所有的疫苗，具有普适性。
[0061] 本发明提供的方法简单、快速，表面进行无机物修饰的疫苗作为疫苗的活性成分 具有如下优点：矿化提高了疫苗沉降性，使得疫苗能够在常速离心条件下快速高效的富集； 生物可逆的无机物矿化相能在细胞内溶解并且释放疫苗颗粒，无机物矿物相可辅助提高疫 苗的热稳定性，使疫苗在常温的稳定性大大增强；该修饰没有显著改变疫苗的生物学性质， 不影响疫苗本身的后续处理；其表面的无机物外壳能够相应提高疫苗的免疫原性，从而更 好的实现其作为热稳性疫苗的功能。本发明制得的具有热稳定性的矿化疫苗具有良好的热 稳定性和免疫原性，使疫苗可以在25°C?37°C储存一周以上仍保持良好的疫苗活性，甚至 在超过37°C的高温也能保持数天良好的疫苗活性。本发明通过疫苗表面的矿化修饰，能够 高效地解决疫苗运输和保存中的热失活现象，显著降低减毒活疫苗的财政支出。本发明在 新型热稳定疫苗生产和制备中有广泛的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0062] 图1为具有自矿化能力的基因工程疫苗构建与矿化后的示意图。
[0063] 图2中，图2A为肠道病毒EV71型全长cDNA克隆构建基因工程病毒的示意图；图 2B为基因工程病毒三维结构的预测图以及钙矿化后的结构示意图。
[0064] 图3为实施例1中检测基因工程病毒表达EV71抗原和插入多肽；图3A为间接免 疫荧光（IFA)结果，图3B为基因测序结果。
[0065] 图4为实施例2中基因工程病毒的生物学特性表征结果：图4A为空斑形态；图4B 为一步生长曲线。
[0066] 图5为实施例3中原位斑点杂交实验的结果和矿化效率的结果：图5A为斑点杂交 实验检测磷酸钙矿化程度；图5B为通过病毒RNA评价矿化效率的结果；图5C为通过空斑 试验检测到的病毒滴度评价矿化效率的结果。
[0067] 图6为实施例3中EV71-W6_CaP疫苗液在透射电子显微镜和扫描显微镜下的照 片：图6A的大图为不经过负染的EV71-W6-CaP疫苗液在透射电子显微镜下的照片，右上角 为经过磷钨酸负染后的EV71-W6-CaP疫苗液照片；图6B为EV71-W6-CaP疫苗颗粒在扫描电 子显微镜下的照片。其中CaP代表磷酸钙，本发明中出现的CaP如无特殊说明，一律为磷酸 钙。
[0068] 图7为实施例3中EV71-W6_CaP疫苗液中对磷酸钙矿化外壳的分析：图7A为X射 线能谱分析图；图7B为X射线粉末衍射仪检测图。
[0069] 图8为实施例4中EV71-W6_CaP疫苗液的生物学特征实验结果：图8A为空斑形 态；图8B为一步生长曲线结果；图8C为荧光显微镜下的观察结果。
[0070] 图9为实施例5中EV71-W6_CaP疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能 力结果：图9A为血清IgG抗体滴度结果；图9B为血清中和抗体滴度结果。
[0071] 图10为实施例6中EV71-W6-CaP疫苗液在不同温度下的稳定性实验结果：图10A 为 26°C ;图 10B 为 37°C ;图 10C 为 42°C。
[0072] 图11为实施例7中热处理后EV71-W6_CaP疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细 胞免疫的能力：图11A为血清IgG抗体滴度结果；图11B为血清中和抗体滴度结果；图11C 为刺激细胞产生Y干扰素能力结果。
[0073] 图12为实施例8中获得口蹄疫基因工程多肽疫苗FUF1-W6和F1-DE纯化后的蛋 白电泳（SDS-PAGE)结果。
[0074] 图13为实施例9中具有自矿化能力多肽疫苗的矿化效率结果。
[0075] 图14为实施例10中磷酸钙矿化的多肽疫苗在小鼠体内诱导体液免疫的能力分析 结果：图14A为血清IgG抗体滴度结果，图14B为血清中和抗体滴度结果。
[0076] 图15为实施例11中热处理后磷酸钙矿化的多肽疫苗Fl-DE-CaP在小鼠体内诱导 体液免疫的能力分析结果：图15A为血清IgG抗体滴度结果，图15B为血清中和抗体滴度结 果。
[0077] 图16为实施例14中热处理后的碳酸钙矿化疫苗Fl-DE-CaC03和草酸钙矿化疫苗 Fl-DE-CaC204在小鼠体内诱导体液免疫能力分析结果：图16A为血清IgG抗体滴度结果，图 16B为血清中和抗体滴度结果。其中CaC0 3为碳酸钙；CaC204为草酸钙。

【具体实施方式】
[0078] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本发明以蛋白疫苗和 病毒疫苗为例，将具有诱导磷酸钙矿化能力的多肽引入蛋白疫苗或病毒疫苗的基因组中， 使其展示（displayed)在疫苗表面，实现疫苗的自矿化。这种引入多肽实现疫苗矿化的方 法，使得疫苗的矿化能力不再依赖于疫苗自身的性质，突破了疫苗难以矿化的的限制，可以 适用于几乎所有的疫苗，具有普适性。因此可以通过此类基因改造的方式引入具有矿化能 力的多肽，实现疫苗的矿化，制备具有热稳定性的疫苗。
[0079] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实 验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，采用TBS缓冲液（pH6. 5?9. 5，10mM Tris-Cl，150mM NaCl)调节和稀释多肽疫苗或磷酸钙矿化多肽疫苗的浓度；采用低糖DMEM 培养液调节疫苗液或磷酸钙矿化疫苗液的病毒浓度（在实际应用中，也可采用PBS缓冲液 调节疫苗液的浓度）。
[0080] 人RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)、猴Vero细胞(非洲绿猴肾细胞）：购自ATCC，产 品目录号为别为CCL-136、CCL-81。聚丙烯酸（平均相对分子量为1800):购自sigma公 司，货号323667。低糖DMEM培养基干粉、液体OPTI-MEM Medium、转染试剂Lipofactamine 2000 :购自 lifetechnologies 公司，货号分别为 31600-034、31985070、11668019。RNA提取 试剂盒RNeasy Mini Kit:购自QIAGEN公司，货号74104。大肠杆菌ToplO感受态、DH5a 感受态、BL21(DE3)感受态、质粒提取试剂盒TIANpr印Mini Plasmid Kit、TMB底物、异丙 基硫代半乳糖苷（IPTG):购自天根生化科技(北京）有限公司，货号分别为CB104、CB101、 CB105、DP103、PA107、RT108-01。Mouse IFN-γ ELISP0T Set:购自 BD 公司，产品目录号为 551083。0嫩凝胶回收和纯化试剂盒Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、体外转录试 剂盒RiboMAX? Large Scale RNA Production System、01igo d(T) 15 premier、dNTP mix、 反转录酶M-MLV、DTT、RNA酶抑制剂：购自Promega公司，货号分别为A9281、P1280、C1101、 U1515、M1701、P1171、N2111。Phusion 超保真 DNA 聚合酶 Master Mix 和限制性内切酶包 括及丽71、他?Ι、5^Ι内切酶：购自NEB有限公司，货号分别为R0130、R1098S、 R1036L、R0138L。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG :购自Jackson，货号，515-055-003,名 称 Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)〇 辣 根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG :购自中杉金桥，货号ZB-2305。BCIP/NBT(染液）：购 自Sigma，货号B1911-100ML。BALB/c雌性小鼠：购自北京军事医学科学院实验动物中心。 Ni-Sepharose蛋白纯化试剂盒：购自Amersham Bioscience公司。低糖DMEM培养基干粉 按说明书配制，得到低糖DMEM培养液。BCA试剂盒：购自碧云天生物技术有限公司。EV71 减毒株A12为EV71 AH/08/06株（Genbank登录号：HQ611148. 1)，北京军事医学科学院微 生物与流行病学研究病毒实验室2008年于安徽省手足口病疫区所采集的咽拭子标本中分 离。本发明所用所有核酸序列均由Invitrogen公司合成。克隆载体pEV为日本国立传染 病研究所（NIID) Prof. H. Shimizu 惠赠。
[0081] 实施例1、制备具有自矿化能力的基因工程病毒疫苗 该实施例以EV71减毒株A12为模型骨架，首先以pEV质粒（由pBR32质粒改造而成)为 载体构建出EV71减毒株A12的全长基因组克隆，然后在EV71结构蛋白VP1的β - (BC) -loop 区域的100?101位氨基酸之间插入目标多肽的编码序列，即在其全长基因组克隆的 2737?2738位核苷酸之间引入对应的核苷酸序列。鉴于脊髓灰质炎疫苗与肠道病毒EV71 型具有相似的三维结构和基因组构成，以下实施例以EV71减毒株A12为模型。
[0082] 步骤一、EV71减毒株A12全长克隆构建 (1) EV71病毒RNA的提取 将EV71 AH/08/06株接种单层人RD细胞，待细胞病变（CPE)达到（90?100%)后冻融 一次，10,000印111离心31^11收集病毒上清后用8他387]^11丨1(行（0^^^沁提取病毒1?隱。
[0083] 反转录：10 μ L viral RNA， 1 μ L Oligo d(T)， 1 μ L 10 mM dNTP mix, 4μ L 5XM-MLV 缓冲液， 2μ L 0· 1 M DTT, 1 μ L RNA酶抑制剂， 混勻65°C，10 min打开RNA高级结构，迅速冰浴2 min。
[0084] 加入1 μ L M-MLV反转录酶。
[0085] 上述体系置于37°C反应60 min后70°C，15 min热失活酶即获得病毒cDNA。
[0086] (2)全长克隆PCR EV71基因组全长约为7. 4kb，采用超保真Phusion PCR Master Mix进行扩增以保证保 真性。其中全长cDNA克隆的上游引物（序列1) :gcgctacgtatatttaggtgacactataggttaaa acagcctgtgggttgcacc cactc ;下游引物（序列 2) :cgccggcgcgcacgcgtttttttttttttttttttttttttgctattctg g。PCR反应体系如下： 3 μ L cDNA 模板， 2yL上游引物， 2μ L下游引物， 25yL 2XPhusion PCR Master Mix (HF 缓冲液）， 20 μ L去离子水。
[0087] 反应条件：预变性98°C 30 s ;35个循环98°C 10 s，60°C 10 s，72°C 4 min ;72°C 7 min。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System按试剂盒 说明书切胶回收，具体步骤如下：配置8%的回收胶，上样后100 V电泳1 h，将目的条带切 下，加入一倍体积的膜结合液，50°C作用15 min，待胶完全融化后平衡至室温，加入吸附柱， 13,000 rpm离心1 min，加洗膜液I 750 μ L离心洗漆一次，洗膜液II 500 μ L离心洗漆两 次，13, 000 rpm甩干2 min后于室温放置1 min,加入50 μ L无核酸酶水，13, 000 rpm离心 2min收集产物。
[0088] (3)酶切、连接与克隆构建 将pEV载体和PCR产物分别用和i/Ζ?/Ι双酶切： 10 μ g pEV质粒或PCR产物， 3 μ L SnaBl, 3 μ L Mlul, 10 μ L 10 X缓冲液，加水至100 μ L， 37°C反应 3 h。
[0089] 酶切后利用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 将 DNA 片段进行纯化（步 骤同上）。纯化后将载体和基因组全长PCR产物进行连接：载体约20 ng，目的片段200 ng， 2yL T4 DNA连接酶（200U)，2 yL 10X连接酶缓冲液，用ddH20补足体积至20yL，4°C连 接过夜后将连接产物转化大肠杆菌ToplO/DH5 α感受态。将20 μ L连接产物加入100 μ L 感受态细胞，轻轻混匀置于冰浴中30 min，42°C热激90s后迅速冰浴3min，加入900 μ L无 抗生素 LB培养基，37°C摇床培养45min。然后取菌液涂氨苄青霉素 （Amp +)的LB平板，37°C 倒置培养16 h。
[0090] (4)线性化与体外转录 挑取酶切鉴定正确的阳性克隆，扩大培养后用TIANpr印Mini Plasmid Kit按照试剂 盒的说明书制备质粒。将制备好的质粒用酶切线性化： 10 μ g质粒， 2 μ L #7?/(2〇υ), 10 μ L 10 X缓冲液，补水至100 μ L， 37°C水浴酶切3 h。
[0091] 获得的线性化质粒经1:1的酚氯仿抽提纯化。取2 μ g作为体外转录模板，用SP6 体外转录试剂盒进行体外转录（20yL) :5XSP6缓冲液4 yL，rNTPs Mix (25 mM ATP、 CTP、UTP、GTP) 6yL，Enzyme Mix (SP6) 2yL，linear plasmid 2yg，补水至 20yL。37°C 水浴反应3 h后用DNaseI消化15 min去除DNA模板。
[0092] (5)病毒在细胞上的恢复 人RD细胞接种6孔板培养至90%汇聚率。取6 μ L脂质体2000与125 μ L OPTI-MEM 混匀静置5 min，同时将20 μ L体外转录RNA与125 μ L 0ΡΤΙ-ΜΕΜ混匀5min ;然后将上述两 种混合物充分混匀，静置20 min ;用0PTI-MEM/PBS洗涤细胞两次后加入800 μ L OPTI-MEM 培养基并加入上述混合物摇匀；37°C孵箱中培养6 h后弃去上清，加入2 ml DMEM维持培养 基培养，待细胞病变后收集上清即为EV71减毒株A12溶液，以下称之为"EV71疫苗液"。
[0093] 步骤二、携带具有诱导无机物矿化能力多肽的基因工程病毒疫苗构建 经过生物信息学分析和一系列实验，EV71全长克隆2737?2738核苷酸之间的VP1蛋 白的β-(Β-〇-1οορ区域（100?101位氨基酸之间）被证明是一个有效的多肽插入位点 (图2Α)。利用融合PCR技术将具有诱导磷酸钙矿化能力的多肽编码DNA序列，例如多肽 NWp (序列 14:Asp-Ser-Ser-Glu-Glu-Lys-Phe-Lys-Arg-Arg-Ile-Arg-Phe-Gly)、W6p (序 列 15 :Asp-Asp-Lys-Glu-Glu-Pr〇-Glu-Ser- Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly)的核苷 酸序列被引入到EV71减毒株的全长克隆中，以同样的方式引入不含羧基的多肽N6p (序列 16 iSer-Val-Lys-Arg-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro)作为对照 实验。用 Phyre2 (Protein Homology/Analogy Recognition Engine 2)服务器对重组的 基因工程病毒疫苗三维结构进行分析，结果显示插入的具有诱导磷酸钙矿化能力的多肽在 疫苗表面重复出现60此，并相对均一地展示在了病毒疫苗的表面，而且没有影响病毒原来 的结构（图2B)。
[0094] 按照全长克隆构建相似的步骤进行疫苗的重组克隆构建，利用融合PCR技术在 EV71衣壳蛋白VP1的100?101位氨基酸之间引入上述多肽NWp、W6p和N6p，并将对应的 重组病毒命名为EV71-NW、EV71-W6和EV71-N6。多肽NWp、W6p和N6p对应的融合PCR引物 序列分别为： EV71 上游引物（序列 3) :gtctcaagcaggatccagacaagt EV71 下游引物（序列 4) :gggtaatactcgctagcctctacatagat NWp_ 下游引物（序列 5)_ :tattcttctcaagaacttctcctcactactgtctgtgccttcaagaggga gat NWp-上游引物（序列 6) ：gaagttcttgagaagaataggaagactaggaactaacccaaatggttatgc c W6p-下游引物（序列 7) ：cctattcttctttgactttctggctcctccttatcgtctgtgccttcaaga gggagat W6p_ 上游 弓丨 物（序列 8) ：aggagccagaaagtcaaagaagaataggaagattcgga actaacccaaatggttatgcc N6p-下游引物（序列 9) :cttggcttcattccgacactggtccccctctttacgcttgtgccttcaaga gggagat N6p_ 上游 弓丨 物（序列 10) ：gggggaccagtgtcggaatgaagccaagtccacgacca actaacccaaatggttatgcc 以EV71-NW为例，构建重组克隆时以EV71全长cDNA为模板，分别用引物EV71上游引 物：gtctcaagcaggatccagacaagt与多肽对应的下游引物如NWp下游引物做PCR制备出一段 核酸序列NWp-Ι(长度约为1900个核苷酸);同时以多肽的下游引物如NWp下游引物与EV71 800个核苷酸)。将上述两段PCR序列NWp-l、NWp-2进行纯化后，以摩尔比1:1加入作为模 板来进行融合PCR，反应步骤如下： NWp-1 ：200ng Nffp-2 ：100ng 25yL 2XPhusion PCR Master Mix (HF 缓冲液）， 补去离子水至50 μ L。
[0095] 反应条件：预变性98°C 30 s ;10个循环98°C 10 s，55 °C 10 s，72°C 1 min，然后 分别加入1 μ L EV71上游下游引物继续进行PCR反应。反应条件：30个循环98°C 10 s， 55 °C 10 s，72°C 1 min，72°C 7 min。反应结束后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System按试剂盒说明书切胶回收。将此融合PCR产物和步骤一 制备的EV71全长克隆分别用及_7 I和I进行双酶切，体系如下： 10 μ g PCR产物或步骤一制备的EV71全长克隆， 5 μ LBamH I, 5 μ L Nru I, 10 μ L 10 X缓冲液，加水至100 μ L， 37°C反应 3 h。
[0096] 酶切后利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System将DNA片段进行切胶回收 纯化（步骤同上）。纯化后将载体和基因组全长PCR产物进行连接：载体约20 ng，目的片 段200 ng，2yL T4 DNA连接酶（200U)，2 yL 10X连接酶缓冲液，用ddH20补足体积至 20 μ L，4°C连接过夜后将连接产物转化大肠杆菌ToplO或DH5 α感受态中。将20 μ L连接产 物加入l〇〇yL感受态细胞，轻轻混匀置于冰浴中30 min，42°C热激90s后迅速冰浴3min，力口 入900 μ L无抗生素 LB培养基，37°C摇床培养45min。然后取菌液涂氨苄青霉素 （Amp + )的 LB平板，37°C倒置培养16 h。挑取酶切鉴定正确的阳性克隆，扩大培养后用TIANpr印Mini Plasmid Kit按照试剂盒的说明书制备质粒。将制备好的质粒用#Λ/Ι酶切线性化： 10 μ g质粒， 2 μ L Mlul(20U), 10 μ L 10 X缓冲液，补水至100 μ L， 37°C水浴酶切3 h。
[0097] 获得的线性化质粒经1:1的酚氯仿抽提纯化。以相同的方式构建出克隆EV71-W6 和EV71-N6。取2 μ g作为体外转录模板，用Promega公司的RIboMAX Large Scale Production System进行体外转录（同步骤一）。体外转录RNA样品经非变性琼脂糖电泳 鉴定后，用脂质体Lipofectamine 2000将约5 μ g (约20 μ L)体外转录样品转染到人RD细 胞上（同步骤一）。待有明显CPE现象后，一般为3-5天，收集病毒上清液，并低速离心弃细 胞碎片。收集的病毒上清液进一步在人RD细胞上传代。间接免疫光和RT-PCR技术来鉴定 EV71基因工程疫苗的获得及目的多肽序列的成功表达。
[0098] (1)间接免疫荧光鉴定EV71基因工程疫苗的获得和目的多肽的表达： 多克隆抗体的制备：将实施例1制备的EV71疫苗液或交联了 KLH的人工合成多肽溶液 (用生理盐水稀释，然后1:1与完全弗氏佐剂乳化）免疫6周龄BALB/c雌性小鼠（采用皮 下多点注射进行免疫），免疫过程如下：初次免疫，每只小鼠免疫200 μ L EV71疫苗液（病 毒疫苗量为2 X 106PFU)或50 μ g多肽；每2周加强免疫1次，总共加强免疫2次；完成第三 次加强免疫两周后，尾静脉采血并分离血清，即为多克隆抗体。
[0099] 将EV71与恢复所得的EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 以感染复数（multiplicity of infection, MOI)约为0.01接种铺于抗原片中的 BHK-21细胞，37°C孵育12h后用丙酮-20°C固定细胞；然后加入实施例3的步骤二的（1) 制备的EV71插入多肽的多克隆抗体，与抗原片中的BHK-21细胞在37°C孵育1-2 h，用PBS 缓冲液（10mM K2HP04,2mM KH2P04，135mM NaCl，2.7mM KC1，pH 7.4)振荡洗涤 3 次（每次 lOmin)，室温晾干；在抗原片上加入FITC标记的羊抗鼠 IgG抗体，37°C孵育60min，然后放 入PBS缓冲液振荡洗涤3次（每次lOmin)，室温晾干；荧光显微镜下观察结果。
[0100] 结果见图3A。EV71、EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗液均能与EV71的多克隆 抗体结合，而且恢复所得的EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6均能与对应的插入多肽的抗体结 合，即成功获得表达目的多肽的基因工程病毒。
[0101] (2) RT-PCR鉴定目的多肽 将恢复所得的EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗液接种单层人RD细胞，待细胞病变 (CPE)达到（90-100%)后冻融一次，10,000 rpm离心3min收集病毒上清后用RNeasyMini Kit提取病毒RNA。然后按照实施例1的步骤一的（1)和（2)进行RT-PCR后，将PCR片段 进行测序分析。
[0102] 结果见图3B，基因工程疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6具有相应多肽的编码核 苷酸序列，说明具有诱导磷酸钙矿化能力的多肽已被成功引入基因工程疫苗中。
[0103] 实施例2、制备EV71、EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗溶液及其生物特性分析 步骤一、EV71、EV71-N6、EV71-NW 和 EV71-W6 病毒液的制备 (1)肠道病毒毒EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6分别感染人RD 细胞（采用低糖DMEM培养液），37°C孵育36-72小时待细胞完全病变后收集病毒疫苗。
[0104] (2)将步骤（1)得到的培养体系进行离心（16000g、10 min)，收集上清液并过滤 (采用0. 22微米孔径的滤膜），收集滤液，即为病毒疫苗液（经检测，pH为7. 2)，将其命名 为EV71、EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗液。
[0105] 步骤二、空斑特征的表征 将EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6分别进行如下实验： 以1〇倍体积比稀释（1〇_1、1〇_2、1〇_3、1〇_4，1〇_ 5、1〇_6和1〇_7)，然后以30(^17孔接种于 铺于12孔板的单层人RD细胞，置于37°C、5% C02的培养箱中孵育l-2h ;然后弃去病毒液， 在细胞上覆盖琼脂盖（即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液），置于37°C、5% C02的 培养箱中孵育3d ;然后用4%甲醛水溶液室温固定lh，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色lOmin ; 观察空斑形态并拍照，计算空斑形成单位（PFU);疫苗滴度=(空斑形成单位X稀释倍数）/ 原液的体积，单位为PFU/mL。
[0106] 空斑形态见图4A。基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗与母本 EV71病毒疫苗具有相似的空斑形态特征，结果表明，表面多肽的引入没有明显改变病毒疫 苗的空斑特征。
[0107] 步骤三、自矿化获得的病毒疫苗在细胞上的增殖特征的表征 将EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6分别进行如下实验： 以感染复数（multiplicity of infection，M0I)约为0.1接种铺于24孔板中的人RD 细胞，置于37°C、5% C02的培养箱中孵育lh ;然后弃去病毒液，补加含2% FBS的低糖DMEM 培养液，置于37°C、5% C02的培养箱中培养，分别于接种后第12小时、第24小时、第36小 时、第48小时、第72小时和第96小时，收取细胞培养上清，进行空斑试验（方法参见步骤 二）。
[0108] 病毒疫苗的一步生长曲线（滴度取10的对数）见图4B (三次重复实验的平均值）， 空斑形态见图4A。基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6疫苗与母本EV71病毒 疫苗具有相似的生长曲线，结果表明，表面多肽的引入没有明显改变病毒疫苗的生长特性。
[0109] 实施例3、实施例2制备的EV71、EV71-N6、EV71-NW和EV71-W6病毒疫苗液的磷酸 钙自矿化： 步骤一、EV71-CaP、EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP、EV71-W6-CaP 疫苗液-甲的制备 在EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW或EV71-W6溶液（病毒疫苗滴度为 IX 107 PFU/mL，也就是IX 101° PFU/L)中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到5. 5 mM(包括 新加入的Ca2+离子和疫苗溶液中原来存在的Ca2+离子；疫苗溶液中的Ca 2+离子理论上等 于低糖DMEM培养液中的Ca2+离子，即浓度为1.8 mM)，即为初始体系；将初始体系37°C 孵育2小时，即为终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到10μ g/mL，即为 EV71-CaP、EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP 或 EV71-W6-CaP 疫苗液-甲-I ;将其进行离心 (16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低糖DMEM培养液重悬沉淀，即为EV71-CaP、 EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP 或 EV71-W6-CaP 疫苗液-甲-II。
[0110] 上述制备过程中，初始体系中病毒疫苗、Ca2+离子和磷酸根离子的配比为 ： 1 X 101° (PFU) :5. 5 (mmol) :0. 9 (mmol)。其中，磷酸根离子没有新加，所以浓度等于低糖DMEM 培养液中磷酸根离子浓度，即〇. 9 mM。
[0111] 步骤二、EV71-W6-CaP疫苗液-乙的制备 在EV71-W6疫苗液（病毒疫苗滴度为lX105PFU/mL，即11X108 PFU/L)中加入CaCl2、 使Ca2+离子浓度达到9. 3 mM，即为初始体系；将初始体系37°C孵育2小时，即为终止体系； 在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到10 μ g/mL，即为EV71-W6_CaP疫苗液-乙-I ; 将EV71-W6-CaP疫苗液-乙-I进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低 糖DMEM培养液重悬沉淀，即为EV71-W6-CaP疫苗液-乙-II。
[0112] 上述制备过程中，初始体系中病毒疫苗、Ca2+离子和磷酸根离子的配比为 ： 1X108(PFU) :9. 3 (mmol) :0.9 (mmol)。
[0113] 步骤三、EV71-W6_CaP疫苗液-丙的制备 在EV71-W6疫苗液（病毒疫苗滴度为1 X 1012 PFU/mL，S卩1 X 1015 PFU/L)中加入CaCl2、 使Ca2+离子浓度达到20. 0 mM，即为初始体系；将初始体系37°C孵育2小时，即为终止体系； 在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到10 μ g/mL，即为EV71-W6_CaP疫苗液-丁 - I ; 将EV71-W6-CaP疫苗液-丁 - I进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低 糖DMEM培养液重悬沉淀，即为EV71-W6-CaP疫苗液-丁 - II。
[0114] 上述制备过程中，初始体系中病毒疫苗、Ca2+离子和磷酸根离子的配比为 ： 1X1015(PFU) :20.0 (mmol) :0.9 (mmol)。
[0115] 步骤四、EV71-W6_CaP疫苗液-丁的制备 在EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW或EV71-W6溶液（病毒疫苗滴度为1X107 PFU/mL，也就是1 X 101° PFU/L)中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到5. 5 mM(包括新加入的 Ca2+离子和疫苗溶液中原来存在的Ca2+离子；疫苗溶液中的Ca2+离子理论上等于低糖DMEM 培养液中的Ca2+离子，即浓度为1. 8 mM)，并额外加入0. 6 mM Na2HP04使磷酸根离子浓度 至IJ 1. 5mM，调节溶液pH为6. 5即为初始体系；将初始体系37°C孵育0. 5小时，即为终止体 系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到1〇μ g/mL，即为EV71-CaP、EV71-N6-CaP、 EV71-NW-CaP或EV71-W6-CaP疫苗液-甲-I ;将其进行离心（16000g、10min)，分别收集上 清液和沉淀。
[0116] 上述制备过程中，初始体系中pH为6. 5,其中的病毒疫苗、Ca2+离子和磷酸根离子 的配比为：1父101°(--仍 ：5.5(臟〇1):1.5(臟〇1)，孵育时间为0.5小时。
[0117] 步骤五、EV71-W6_CaP疫苗液-戊的制备 在EV71、基因工程病毒疫苗EV71-N6、EV71-NW或EV71-W6溶液（病毒疫苗滴度为1X107 PFU/mL，也就是1 X 101° PFU/L)中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到5. 5 mM(包括新加入的 Ca2+离子和疫苗溶液中原来存在的Ca2+离子；疫苗溶液中的Ca2+离子理论上等于低糖DMEM 培养液中的Ca2+离子，即浓度为1. 8 mM)，调节溶液pH为9. 5即为初始体系；将初始体系 20°C孵育12小时，即为终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到10 μ g/mL，即 为 EV71-CaP、EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP 或 EV71-W6-CaP 疫苗液-甲-I ;将其进行离心 (16000g、lOmin)，分别收集上清液和沉淀。
[0118] 上述制备过程中，初始体系中的pH为9. 5,其中病毒疫苗、Ca2+离子和磷酸根离子 的配比为：1X101Q(PFU) :5. 5(mmol) :0. 9(mmol)，所述体系是在20°C孵育12小时完成矿 化。
[0119] 步骤六、磷酸钙矿化疫苗液EV71-W6_CaP的初步性能分析 原位斑点杂交实验：为确认EV71-W6-CaP疫苗液中病毒疫苗表面磷酸钙的掩蔽效果， 采用原位斑点杂交对病毒疫苗的衣壳蛋白进行检测，具体步骤如下（各步骤依次进行）： ①将20 μ L步骤一中EV71-W6-CaP疫苗液-甲-I滴加在硝酸纤维素酯膜上，形成直 径约为0. 5cm的斑点，常温晾干。
[0120] ②将硝酸纤维素酯膜置于封闭液（含10%脱脂奶粉的TBST缓冲液）中室温封闭 lh〇
[0121] ③洗去封闭液，加入1:1000倍稀释的多克隆抗体，37°C孵育lh。
[0122] ④用TBST缓冲液洗膜3次，每次10miη。
[0123] ⑤加入1:2000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG，37°C孵育30min。
[0124] ⑥用TBST缓冲液洗膜3次，每次10miη。
[0125] ⑦加入BCIP/NBT (染液）进行显色。
[0126] 结果见图5A，EV71或EV71-W6疫苗液作为阳性对照显示很强的斑点。 EV71-NW-CaP、EV71-W6-CaP疫苗液-甲斑点颜色明显减弱。而低pH处理以后EV71-W6-CaP 疫苗液显示出跟EV71-W6疫苗液类似的强色斑点。结果表明，原位磷酸钙矿化形成的矿物 层对病毒疫苗表面的大部分蛋白具有掩蔽效果，而低pH处理以后会导致磷酸钙矿化层的 破坏，进而将病毒疫苗的蛋白暴露出来。
[0127] 步骤七、基因工程病毒疫苗的矿化效率分析 1、实时定量PCR检测病毒疫苗RNA的方法检测矿化效率 将步骤一中 EV71-CaP、EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP、EV71-W6-CaP 疫苗液-甲-I 离心 得到的沉淀与上清分别进行如下检测： 用RNA提取试剂盒（lifetochnologies公司）提取总RNA，RNA样品通过针对肠道病毒 病毒EV71株的特异引物和探针，采用一步法实时定量试剂盒（Takara公司，产品目录号为 DRR064A)进行实时定量PCR分析。
[0128] 特异引物对和探针的序列如下： 上游引物（序列 11) :5'-ggccatttatgtgggtaactttaga_3' ； 下游引物（序列 12) :5'-cgggcaatcgtgtcacaac_3' ； 探针（序列 13) :5' FAM-aagacagctctcgcgacttgctcgtg-BQHl 3' ； 矿化效率=沉淀中的病毒RNA含量+ (沉淀中的病毒RNA含量+上清中的病毒RNA含 量）X100%。
[0129] 效率见图5B (三次重复实验的平均值），显示90%以上EV71-W6,即绝大多数基因 工程病毒疫苗EV71-W6表面已成功被磷酸钙矿化，但仅有不到10%的普通病毒疫苗EV71 或EV71-N6被离心下来，即基本没有被矿化。
[0130] 2、空斑定量技术检测矿化效率 将步骤一中 EV71-CaP、EV71-N6-CaP、EV71-NW-CaP、EV71-W6-CaP 疫苗液-甲-I 离心 得到的沉淀与上清分别进行空斑试验（方法参见实施例3的步骤一）。
[0131] 矿化效率=沉淀中的病毒滴度+(沉淀中的病毒滴度+上清中的病毒滴 度）X100%。
[0132] 矿化效率见图5C (三次重复实验的平均值）显示90%以上EV71-W6,即绝大多数基 因修饰病毒EV71-W6已成功进行了表面磷酸钙矿化修饰，而仅有10%以下的普通EV71或 EV71-N6被离心下来，即基本没有矿化修饰。
[0133] 类似的对 EV71 -CaP、EV71 -N6_CaP、EV71 -NW-CaP、EV71 -W6_CaP 疫苗液-乙、丙、丁、 戊的矿化效率进行了分析，得到了与疫苗液-甲相似的结果。因此，病毒疫苗的矿化反应 可以在pH为6. 5?9. 5,优选为7. 2 ;病毒疫苗浓度为108?1015PFU/mL，优选为101QPFU/ mL ;Ca2+离子浓度为5. 5?20mM，优选为5. 5mM ;磷酸根离子浓度为0. 5?1. 5 mM，优选为 0. 9mM ;孵育时间为0. 5?12小时，优选为2小时。
[0134] 步骤八、自矿化获得的EV71-W6_CaP疫苗液的理化性质分析 将步骤一得到的EV71-W6-CaP疫苗液-甲-II进行透射电子显微镜和扫描显微镜观 察、X射线能谱分析、和X射线衍射分析。EV71-W6-CaP疫苗液-甲-II在投射显微镜下的 照片见图6A，扫描电子显微镜下的照片见图6B，得到的样品不经过任何染色处理即能够通 过透射电子显微镜进行观察，说明表面矿物增加了病毒颗粒表面的电子密度。X射线能谱分 析图见图7A，其表面含有磷酸钙矿物相。EV71-W6-CaP疫苗液-甲-II的X射线衍射分析 结果见图7B，表明原位矿化形成的磷酸钙外壳是无定形态的。
[0135] 实施例4、自矿化获得的EV71-W6_CaP病毒疫苗液的生物学特征实验 步骤一、空斑特征 将EV71-W6-CaP疫苗液和EV7UEV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 以1〇倍体积比稀释（1〇_1、1〇_2、1〇_3、1〇_4，1〇_ 5、1〇_6和1〇_7)，然后以30(^17孔接种于 铺于12孔板的单层人RD细胞，置于37°C、5% C02的培养箱中孵育l-2h ;然后弃去病毒液， 在细胞上覆盖琼脂盖（即含1%琼脂和2%FBS的低糖DMEM培养液），置于37°C、5% C02的 培养箱中孵育3d ;然后用4%甲醛水溶液室温固定lh，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色lOmin ; 观察空斑形态并拍照，计算空斑形成单位（PFU);疫苗滴度=(空斑形成单位X稀释倍数）/ 原液的体积，单位为PFU/mL。
[0136] 照片见图8A，自矿化后的EV71-W6-CaP疫苗液与未矿化的EV71和EV71-W6疫苗液 具有相似的空斑形态特征，结果表明，表面的磷酸钙自矿化修饰没有明显改变病毒疫苗的 空斑特征。
[0137] 步骤二、自矿化获得的病毒疫苗在细胞上的增殖特征 将EV71-W6-CaP疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 以感染复数（multiplicity of infection，M0I)约为0.1接种铺于24孔板中的人RD 细胞，置于37°C、5% C02的培养箱中孵育lh ;然后弃去病毒液，补加含2% FBS的低糖DMEM 培养液，置于37°C、5% C02的培养箱中培养，分别于接种后第12小时、第24小时、第36小 时、第48小时、第72小时和第96小时，收取细胞培养上清，进行空斑试验（方法参见实施 例4的步骤一）。
[0138] 病毒疫苗的一步生长曲线（滴度取10的对数）见图8B (三次重复实验的平均值）。 EV71-W6-CaP疫苗液和EV71-W6疫苗液相似，在接种后第48h之间达到复制高峰，滴度约为 107PFU/mL，表明进行磷酸钙自矿化修饰后的病毒疫苗仍可在敏感细胞中进行有效复制。
[0139] 步骤三、自矿化获得的病毒疫苗的抗原特征 将EV71-W6-CaP疫苗液与EV7UEV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 以感染复数（multiplicity of infection，M0I)约为0.1接种铺于抗原片中的猴Vero 细胞，37°C孵育12h后用丙酮-20°C固定细胞；然后加入实施例2的步骤二的（1)制备的多 克隆抗体，与抗原片中的猴Vero细胞在37°C孵育1-2 h，用PBS缓冲液（10mM K2HP04,2mM KH2P04,135mM NaCl，2. 7mM KC1，pH 7. 4)振荡洗涤3次（每次10min)，室温晾干；在抗原片 上加入FITC标记的羊抗鼠 IgG抗体，37°C孵育60min，然后放入PBS缓冲液振荡洗涤3次 (每次l〇min)，室温瞭干；突光显微镜下观察结果。
[0140] 结果见图8C。EV71-W6-CaP疫苗液和EV71、EV71-W6疫苗液均能与多克隆抗体结 合，即进行矿化修饰后的病毒颗粒没有改变病毒本身的感染以及抗原特征。
[0141] 实施例5、自矿化获得的EV71-W6_CaP在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的能 力检测 为考察磷酸钙矿化修饰对病毒疫苗免疫原性的影响，将相同初始滴度的自矿化病毒疫 苗EV71-W6-CaP、未矿化EV71和EV71-W6以皮下多点注射的方式免疫6周龄BALB/c小鼠， 分别于免疫后2周和4周以断尾取血的方式采集小鼠血清或小鼠脾细胞，检测小鼠血清中 EV71特异性的IgG抗体，中和抗体水平和脾细胞分泌的细胞因子水平。
[0142] 步骤一、测定血清的IgG抗体滴度、中和抗体效价 将自矿化获得的EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实 验： 1、取6周龄BALB/c雌性小鼠，采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠，每只小鼠 免疫200 μ L (病毒含量为2 X 106PFU)。
[0143] 2、分别于免疫两周（2W)和免疫四周（4W)后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定IgG 效价。
[0144] IgG效价的检测方法：在微量酶联板中加入100 μ L EV71疫苗液（用碳酸盐缓冲液 1:100稀释，病毒含量约为106 PFU)，4°C过夜；弃上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3 次（30s/次），拍干；加入100 μ L封闭液（含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液），37°C孵育lh， 弃上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干；加入100 μ L梯度稀释的 小鼠血清，37°C孵育lh，弃上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干； 加入100 μ L工作浓度的HRP标记的山羊抗鼠 IgG，37°C孵育30min，弃上清，用洗涤液（PBST 缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干；加入100 μ L TMB底物，37°C避光显色10_20min， 加入50 μ L 2M H2S04终止显色，测定波长452nm的光吸收值，并将0D值大于阴性对照2. 1 倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下，血清的最大稀释倍数即为血清的IgG抗体 滴度。
[0145] 将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清的IgG抗体滴度结果见图9A(采用5只小鼠进 行试验）。结果表明，磷酸钙矿化修饰后的病毒颗粒没有改变原始病毒疫苗诱发小鼠产生 IgG的能力。
[0146] 3、分别于免疫两周（2W)和免疫四周（4W)后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定中 和抗体效价。
[0147] 中和抗体效价的检测方法：将血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释 的悬液，与等体积EV71疫苗液（病毒含量为100 PFU)混合，37°C孵育1. 5 h ;将混合液进 行空斑试验（方法参见实施例4的步骤一）。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗 粒进行计数，用Reed-Mueuch计算血清中的中和抗体效价。
[0148] 血清的中和抗体滴度结果见图9B (采用5只小鼠进行试验）。结果表明，表面疫苗 的磷酸钙矿化修饰没有改变其诱发小鼠产生的中和抗体的能力，而且产生的中和抗体水平 没有下降。
[0149] 步骤二、细胞因子分泌细胞水平测定 将自矿化获得的EV71-W6-CaP疫苗液和EV71疫苗液分别进行如下实验： 1、取6周龄BALB/c雌性小鼠，采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠，每只小鼠 免疫200 μ L (病毒含量为2 X 106PFU)。
[0150] 2、免疫两周后取小鼠脾细胞，采用斑点杂交试剂盒（Mouse IFN-Y ELISPOT Set， BD公司，产品目录号为551083)并按照试剂盒说明书通过ELISP0T测定EV71特异的γ干扰 素表达水平。具体步骤如下：在96孔ELISP0T板中加入其捕捉单克隆抗体，4°C孵育过夜后 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液清洗一遍后用其在室温封闭板2h ;加入100 μ L用含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释的脾细胞（5Χ 105个细胞/孔），随后加入100ulEV71 疫苗液（病毒含量为l〇5PFU)作为刺激原，在37°C，5% C02的培养箱培养20h ;收集沉淀 用去离子水洗一遍后用PBST洗三遍，加生物素标记的γ干扰素检测抗体室温赋予2h;用 PBST缓冲液洗三遍，加辣根过氧化物酶标记的亲和素室温孵育lh ;用PBST缓冲液洗三遍， 去离子水洗两遍后加入AEC底物，室温10-60min检测斑点形成情况，并用清水清洗终止反 应进行。用免疫斑点仪计数。
[0151] 免疫后，每106个小鼠脾细胞中含Y干扰素斑点形成细胞个数的统计结果见图 11C (三次重复实验的平均值）。结果表明，表面磷酸钙矿化修饰未改变病毒疫苗诱发小鼠 产生的Y干扰素因子的能力，即此修饰后的病毒疫苗仍可有效诱发小鼠产生良好的细胞 免疫。
[0152] 实施例6、自矿化获得的EV71-W6_CaP疫苗液在不同温度下的稳定性实验 步骤一、自矿化获得的EV71-W6-CaP疫苗液在室温下的稳定性 将EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 1、将疫苗液存放于室温金属浴中，温度显示26°C，分别于特定时间后取出。
[0153] 2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释，进行空斑试验（方法参见实施例4的步骤 一）。
[0154] 疫苗液的滴度损失=-Log1(l(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度）， 见图10A。结果表明，表面磷酸钙修饰的病毒颗粒在室温条件下的稳定性显著高于未进行碳 酸钙修饰的病毒颗粒，证明磷酸钙矿化修饰能够显著加强病毒颗粒的稳定性。
[0155] 步骤二、自矿化获得的EV71-W6_CaP疫苗液在37°C或42°C下的热加速失活实验 将EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： 1、将疫苗液存放于室温金属浴中，温度显示37°C (或42°C)，分别于数小时或数天后取 出。
[0156] 2、将完成步骤1的疫苗液梯度稀释，进行空斑试验（方法参见实施例4的步骤 一）。
[0157] 疫苗液的滴度损失=-Log1(l(疫苗液热处理后的滴度/疫苗液热处理前的滴度）， 37°C放置不同时间后，疫苗液滴度损失见图10B。42°C放置不同时间后，疫苗液滴度损失见 图10C。结果表明，磷酸钙矿化修饰的病毒疫苗在高温条件下的稳定性显著高于未修饰的病 毒疫苗，证明磷酸钙矿化修饰在较宽的温度范围内都能够显著加强病毒疫苗的稳定性。
[0158] 实施例7、热处理后EV71-W6_CaP疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫的 能力检测 步骤一、室温处理后EV71-W6-CaP疫苗液诱导体液免疫的能力 实验组：将EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： (1)在37°C放置7天；（2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例5步骤一中的实验。
[0159] 对照组：将EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行实施例 5步骤一中的实验。
[0160] 将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清IgG抗体滴度（取2的对数）见图11A (采用 5只小鼠进行试验）。
[0161] 血清中和抗体滴度结果见图11B(采用5只小鼠进行试验）。
[0162] 经过高温处理以后，磷酸钙矿化修饰的病毒疫苗仍能诱发小鼠产生良好的抗体效 价。与未经高温处理过的相应疫苗液相比，室温放置过的EV71-W6-CaP疫苗液诱导小鼠产 生抗体的能力未见明显下降。然而，与未经高温处理的对应疫苗液相比，高温处理的EV71 疫苗液和EV71-W6疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明，经过37°C处理5 天后，磷酸钙矿化疫苗液仍保持了良好的体液免疫原性。
[0163] 步骤二、室温处理后EV71-W6_CaP疫苗液诱导细胞免疫的能力 实验组：将EV71-W6-CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行如下实验： (1)在37°C放置7天；（2)将完成步骤（1)的疫苗液分别进行实施例5步骤一中的实验。
[0164] 对照组：将EV71-W6_CaP疫苗液、EV71疫苗液和EV71-W6疫苗液分别进行实施例 5步骤一中的实验。
[0165] 免疫后，每106个小鼠脾细胞中含分泌Y干扰素斑点形成个数的统计结果见图 11C (三只以上小鼠的平均值）。
[0166] 经过高温处理以后，磷酸钙矿化的病毒颗粒仍能诱发小鼠产生良好的细胞免疫。 与未经高温处理过的相应疫苗液相比，室温处理后的EV71-W6-CaP疫苗液诱导小鼠产生细 胞免疫的能力基本没有下降。与未经高温处理的对应疫苗液相比，高温处理的EV71疫苗液 诱导小鼠产生抗体的能力显著下降。结果表明，经过37°C，7天处理以后，磷酸钙矿化疫苗 液仍保持了良好的细胞免疫原性。
[0167] 实施例8、制备具有自矿化能力的基因工程多肽疫苗 该实施例以常用的口蹄疫多肽疫苗为模型骨架，首先以PET28a质粒为载体构建出编 码口蹄疫多肽疫苗的全长基因组克隆。经过生物信息学分析，在该基因组克隆的无规卷曲 (loop)区域插入目的多肽的编码序列，获得重组疫苗克隆。
[0168] 步骤一、多肽疫苗全长基因克隆构建 口蹄疫多肽疫苗的编码DNA序列，即VP1 ( 21AA?40AA)?VP1 ( 133AA?163AA)? VP2( 1AA?33AA)?VP1( 133AA?163AA)串联重复抗原表位DNA片段由上海杰瑞生物 技术有限公司合成，全长约400bp，经克隆到PET28a载体BamH I及Sal I酶切位之间，构 建得到重组表达质粒PET28a-Fl。经过双向测序确认插入序列。
[0169] 步骤二、携带具有诱导无机物矿化能力多肽的基因工程疫苗的构建 利用融合PCR技术将编码具有诱导磷酸钙矿化能力的成核肽的核苷酸序列，例如W6p (序列 15 :Asp-Asp-Lys-Glu-Glu-Pr〇-Glu-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly)，DEI (序列 17:Asp-Asp-Ser-Ser-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu)的编码 DNA 序列引入 到口蹄疫多肽疫苗克隆的N末端；或者直接将W6P或DE的编码DNA序列合成，通过BamH I 单酶切连接，将其克隆到多肽疫苗表达质粒PET28a-Fl中。获得的重组多肽疫苗表达质粒 PET28a-Fl-W6或PET28a-Fl-DE，具有同时表达口蹄疫多肽疫苗和具有诱导磷酸钙矿化能 力的多肽W6p或DE。
[0170] 步骤三、基因工程疫苗的获得及多肽的表达 将重组表达质粒PET28a-Fl，PET28a-F2-W6, PET28a-F2-DE分别转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞.在含有卡那霉素（SOyg/ mL)的LB液体培养基中培养.用1 mmol/ L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导菌体合成重组蛋白，该蛋白集中在包涵体 内。约3h后4 000 r/ min，25 min离心收集菌体，按菌体湿重：破壁液=1 : 6的比 例加入破壁液·超声破壁2~ 3次，每次约5 min. 10 000 r/ min离心20 min，收集包涵 体。
[0171] 重组质粒的载体pET28a具有6个His标签，因此表达的融合蛋白可用Ni_NTA( 镍-氨三乙酸）金属螯合层析柱进行纯化.菌体经超声破壁后收集包涵体，按每克包涵 体湿重加3 mL裂解液比例加入8 mol/ L尿素裂解液，充分悬浮，4°C搅拌过夜使包涵 体变性.加复性液4 °C复性12 h配制成疫苗。用Ni-Sepharose蛋白纯化试剂盒纯化重 组多肽疫苗。
[0172] 将基因工程多肽疫苗纯化后，蛋白电泳结果见图12,结果显示携带具有诱导无机 物矿化能力多肽的基因工程疫苗F1-W6、F1-DE比母本F1的分子量略大，证明具有诱导无机 物矿化能力的多肽已被成功引入到基因工程疫苗中。
[0173] 实施例9、实施例8获得的基因工程多肽疫苗的自矿化 取实施例8纯化获得的具有自矿化能力的基因工程多肽疫苗，用TBS将其稀释目标浓 度，0. 5g/L 10g/L 备用。
[0174] 步骤一、自矿化多肽疫苗液-甲的制备 在50mg/L的多肽疫苗FI、F1-W6、F1-DE体系中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到4 mM，加入NaH2P04使磷酸根离子的浓度为1 mM，即为初始体系；将初始体系37°C孵育2小 时，即为终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到1μ g/mL，即为Fl-CaP、 Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP疫苗液-甲-I ;将其进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和 沉淀；用TBS缓冲液重悬沉淀，即为Fl-CaP、Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP疫苗液-甲-II。
[0175] 步骤二、自矿化多肽疫苗液-乙的制备 在2g/L的多肽疫苗FI、F1-W6、F1-DE体系中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到10 mM，力口 入NaH2P04使磷酸根离子的浓度为1 mM，即为初始体系；将初始体系37°C孵育2小时，即为 终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到1〇μ g/mL，即为Fl-CaP、Fl-W6_CaP、 Fl-DE-CaP疫苗液-乙-I ;将其进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用TBS 缓冲液重悬沉淀，即为Fl-CaP、Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP疫苗液-乙-II。
[0176] 步骤三、自矿化多肽疫苗液-丙的制备 在2g/L的多肽疫苗FI、F1-W6、F1-DE体系中加入CaCl2、使Ca2+离子浓度达到20禮，力口 入NaH2P04使磷酸根离子的浓度为1 mM，即为初始体系；将初始体系37°C孵育2小时，即为 终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到1〇μ g/mL，即为Fl-CaP、Fl-W6_CaP、 Fl-DE-CaP疫苗液-丙-I ;将其进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用TBS 缓冲液重悬沉淀，即为Fl-CaP、Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP疫苗液-丙-II 步骤四、基因工程多肽疫苗的矿化效率分析 将步骤二中 Fl-CaP、Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP 疫苗液-乙-I 离心（16000g, 5-30min) 得到的沉淀与上清。用含有2. 5%EDTA的pH为6. 0的TBS溶解沉淀（EDTA和弱酸性会导致 磷酸钙的溶解，释放出内部的多肽疫苗)。用BCA试剂盒分别检测上清与沉淀中的蛋白含量， 因为该疫苗已经过纯化，所以其中的蛋白可以认为是多肽疫苗： BCA试剂盒测定蛋白含量方法：首先，完全溶解蛋白标准品，取10 μ L稀释用TBS缓冲 液至lOOyL，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20yL加到96 孔板的标准品孔中，加 TBS补足到20 μ L。同时，将待测样品，上清和沉淀中溶液进行适当稀 释后，将其加入96孔板中。然后，往各孔加入200 μ L G250染色液，室温放置3-5分钟。最 后，用酶标仪测定Α590,或560-610nm之间的其它波长的吸光度，根据标准曲线计算出样品 中的蛋白浓度。
[0177] 矿化效率=沉淀中的疫苗浓度+(沉淀中的疫苗滴度+上清中的疫苗滴 度）X100%。
[0178] 矿化效率见图13(三次重复实验的平均值）显示95%以上的F1_DE，80%以上的 F1-W6都可以已经被磷酸钙矿化，可以被常速离心收集，即绝大多数携带具有无机物矿化能 力的多肽的疫苗已成功进行了表面磷酸钙矿化修饰，而仅有10%以下的普通F1被离心下 来，即基本没有被矿化修饰。
[0179] 实施例10、自矿化多肽疫苗的免疫原性分析 取实施例8制备基因工程多肽疫苗F1、F1-W6、F1-DE和实施例9获得的自矿化的基因 工程多肽疫苗Fl-CaP、Fl-W6-CaP、Fl-DE-CaP疫苗液-乙-I免疫6周龄BALB/c雌性小鼠 (采用皮下多点注射进行免疫），免疫过程如下：初次免疫，每只小鼠免疫50 μ g基因工程多 肽疫苗；2周后加强免疫1次，尾静脉采血并分离血清，检测小鼠血清中口蹄疫病毒特异性 的IgG抗体和中和抗体水平。
[0180] 步骤一、测定血清的IgG抗体滴度 将自矿化获得的Fl-DE-CaP疫苗液、F1疫苗液和F1-DE疫苗液分别进行如下实验： 1、取6周龄BALB/c雌性小鼠，采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠，每只小鼠 免疫两次，每次50 μ g。
[0181] 2、分别于免疫两周（2W)和免疫四周（4W)后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定IgG 效价。
[0182] IgG效价的检测方法：在微量酶联板中加入100 μ L 5 μ g/mL多肽疫苗液（用碳酸 盐缓冲液1:100稀释，多肽含量），4°c过夜；弃上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3次 (30s/次），拍干；加入100 μ L封闭液（含10%脱脂奶粉的PBST缓冲液），37°C孵育lh，弃 上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干；加入100 μ L梯度稀释的小 鼠血清，37°C孵育lh，弃上清，用洗涤液（PBST缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干；力口 入lOOyL工作浓度的HRP标记的山羊抗鼠 IgG，37°C孵育30min，弃上清，用洗涤液（PBST 缓冲液）重复洗板3次（30s/次），拍干；加入100 μ L TMB底物，37°C避光显色10_20min， 加入50 μ L 2M H2S04终止显色，测定波长452nm的光吸收值，并将0D值大于阴性对照2. 1 倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下，血清的最大稀释倍数即为血清的IgG抗体 滴度。
[0183] 将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清的IgG抗体滴度结果见图14A(采用5只小鼠进 行试验）。结果表明，磷酸钙矿化修饰后的病毒颗粒没有改变原始病毒疫苗诱发小鼠产生 IgG的能力，而且有一定程度的增强效果，因为磷酸钙本身就是一种疫苗佐剂。
[0184] 步骤二、测定血清中和抗体效价 1、取6周龄BALB/c雌性小鼠，采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠，每只小鼠 免疫两次，每次50 μ g。
[0185] 2、分别于免疫两周（2W)和免疫四周（4W)后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定中 和抗体效价。
[0186] 中和抗体效价的检测方法：将血清制备成1:20、1:40、1:80、1:160和1:320倍稀释 的悬液，与等体积口蹄疫病毒溶液（FMDV，病毒含量为100 PFU)混合，37°C孵育1. 5 h ;将 混合液进行空斑试验（方法参见实施例4的步骤一）。通过空斑试验对血清病毒混合液中 的病毒颗粒进行计数，用Reed-Mueuch计算血清中的中和抗体效价。
[0187] 血清的中和抗体滴度结果见图14B(采用5只小鼠进行试验）。结果表明，表面疫 苗的磷酸钙矿化修饰没有改变其诱发小鼠产生的中和抗体的能力，而且产生的中和抗体水 平不但没有下降，反而被增强了，这是由于磷酸钙外壳是一种佐剂，而且矿化以后可以达到 缓释疫苗，持续刺激的效果。
[0188] 实施例11、自矿化多肽疫苗的热稳定性分析 实验组：将Fl-DE-CaP疫苗液、F1疫苗液和F1-DE疫苗液分别进行如下实验：（1)在 37°C处理15天；（2)将完成步骤（1)的疫苗液分别进行实施例10中的各个实验。
[0189] 对照组：将Fl-DE-CaP疫苗液、F1疫苗液和F1-DE疫苗液分别进行实施例10的各 个实验。
[0190] 将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清IgG抗体滴度（取2的对数）见图15A (采用 5只小鼠进行试验）。
[0191] 血清中和抗体滴度结果见图15B (采用5只小鼠进行试验）。
[0192] 经过高温处理以后，磷酸钙矿化修饰的多肽疫苗仍能诱发小鼠产生良好的抗体效 价。与未高温处理过的对应多肽疫苗液相比，室温放置过的Fl-DE-CaP疫苗液诱导小鼠产 生抗体的能力未见明显下降。但是，与未高温放处理的对应多肽疫苗液相比，高温处理过的 F1疫苗液和F1-DE疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力显著下降，IgG抗体滴度下降到原来的 20%以下，中和抗体滴度下降了到原来的50%左右。结果表明，经过37°C处理15天后，磷酸 钙矿化多肽疫苗液仍保持了良好的体液免疫效能。
[0193] 以上结果表明，表明磷酸钙矿化修饰能够很好的提高疫苗的热稳定性（温带和热 带）。
[0194] 实施例12、自矿化多肽疫苗的碳酸钙矿化 步骤一、碳酸钙矿化疫苗液-甲的制备 在50mg/L的实施例8获得的基因工程多肽疫苗F1、F1-W6、F1-DE体系中加入Ca(N03)2、 使Ca2+离子浓度达到4mM，加入Na2C03使碳酸根离子的浓度为1. 5 mM，即为初始体系；将 初始体系20°C孵育12小时，即为终止体系；将获得的矿化疫苗命名为FI- CaC03、F1-W6-CaC03、Fl-DE- CaC03疫苗液-甲-I ;将其进行离心（10000g、10min)，分别收集上清液和沉 淀；用TBS缓冲液重悬沉淀，即为Fl-CaC03、F1-W6- CaC03、Fl-DE- CaC03疫苗液-甲-II。 其中CaC03为碳酸钙，文中如无特殊说明，CaC0 3 -律为碳酸钙。
[0195] 步骤二、碳酸钙矿化疫苗液-乙的制备 在l〇g/L的实施例8获得的基因工程多肽疫苗F1、F1-W6、F1-DE体系中加入Ca(N03)2、 使Ca2+离子浓度达到20mM，加入NaHC03使碳酸根离子的浓度为0. 5 mM，即为初始体系； 将初始体系37°C孵育0. 5小时，即为终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度 达到100μ g/mL，将获得的矿化疫苗命名为FI- CaC03、F1-W6- CaC03、Fl-DE- CaC03疫苗 液-乙-I ;将其进行离心（l〇〇〇〇g、l〇min)，分别收集上清液和沉淀；用TBS缓冲液重悬沉 淀，即为 Fl-CaC03、F1-W6- CaC03、Fl-DE- CaC03 疫苗液-乙-II。
[0196] 实施例13、自矿化多肽疫苗的草酸钙矿化 步骤一、草酸钙矿化疫苗液-甲的制备 在2g/L的实施例8获得的基因工程多肽疫苗FI、F1-W6、F1-DE体系中加入Ca(N03)2、 使Ca2+离子浓度达到5mM，加入Na2C204使草酸根离子的浓度为2mM，即为初始体系；将初始 体系37°C孵育2小时，即为终止体系；将获得的矿化疫苗命名为Fl-CaC 204、Fl-W6-CaC204、 Fl-DE- CaC204疫苗液-甲-I ;将其进行离心（16000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用 TBS 缓冲液重悬沉淀，即为 FI- CaC204、F1-W6- CaC204、Fl-DE- CaC204 疫苗液-甲-II。
[0197] 步骤二、草酸钙矿化疫苗液-乙的制备 在2g/L的实施例8获得的基因工程多肽疫苗FI、F1-W6、F1-DE体系中加入Ca(N03)2、 使Ca2+离子浓度达到20mM，加入似2(：204使草酸根离子的浓度为ImM，即为初始体系；将初始 体系25°C孵育12小时，即为终止体系；在终止体系中加入聚丙烯酸、使其浓度达到1 μ g/ mL，为 Fl-CaC204、Fl-W6-CaC204、Fl-DE- CaC204 疫苗液-甲-I ;将其进行离心（16000g、 lOmin)，分别收集上清液和沉淀；用TBS缓冲液重悬沉淀，即为FI- CaC204、F1-W6- CaC204、 Fl-DE- CaC204 疫苗液-甲-II。
[0198] 实施例14、碳酸钙矿化疫苗、草酸钙矿化疫苗的热稳定实验 将实施例12中制备的Fl-DE- CaC03疫苗液-乙-I、实施例13中制备的Fl-DE- CaC204 疫苗液-甲-I、F1疫苗液和Fl-DE疫苗液分别进行如下实验（1)在37°C处理15天；以 相应的未处理疫苗做对照（2)将完成步骤1的疫苗液分别进行实施例10中的各个实验。。
[0199] 将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清IgG抗体滴度（取2的对数）见图16A (采用 5只小鼠进行试验）。
[0200] 血清中和抗体滴度结果见图16B (采用5只小鼠进行试验）。
[0201] 与磷酸钙矿化疫苗获得的结果相类似的。经过高温处理以后，碳酸钙或草酸钙矿 化修饰的多肽疫苗仍能诱发小鼠产生良好的抗体效价。与未高温处理过的对应多肽疫苗液 相比，室温放置过的碳酸钙或草酸钙矿化疫苗液诱导小鼠产生抗体的能力未见明显下降。 然而，与未高温放处理的对应多肽疫苗液相比，高温处理过的未矿化疫苗液诱导小鼠产生 抗体的能力显著下降，IgG抗体滴度下降到原来的20%以下，中和抗体滴度下降了到原来的 50%左右。结果表明，经过37°C处理15天后，磷酸钙矿化多肽疫苗液仍保持了良好的体液 免疫效能。
[0202] 以上结果表明，表明碳酸钙或草酸钙的矿化修饰能够很好的提高疫苗的热稳定 性。
[0203] 需要说明的是，上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外 应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 SEQUENCE LISTING 〈11〇>浙江大学 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 〈120> -种基因工程热稳定疫苗及其制备方法 <130> - <160> 17 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 59 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 gcgctacgta tatttaggtg acactatagg ttaaaacagc ctgtgggttg cacccactc 59 〈210〉 2 〈211〉 51 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 2 cgccggcgcg cacgcgtttt tttttttttt tttttttttt tgctattctg g 51 〈210〉 3 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 3 gtctcaagca ggatccagac aagt 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 4 gggtaatact cgctagcctc tacatagat 29 <210> 5 <211> 53 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 5 tattcttctc aagaacttct cctcactact gtctgtgcct tcaagaggga gat 53 〈210〉 6 〈211〉 52 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 6 gaagttcttg agaagaatag gaagactagg aactaaccca aatggttatg cc 52 〈210〉 7 〈211〉 58 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 7 cctattcttc tttgactttc tggctcctcc ttatcgtctg tgccttcaag agggagat 58 〈210〉 8 <211> 59 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 8 aggagccaga aagtcaaaga agaataggaa gattcggaac taacccaaat ggttatgcc 59 〈210〉 9 〈211〉 58 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 9 cttggcttca ttccgacact ggtccccctc tttacgcttg tgccttcaag agggagat 58 〈210〉 10 〈211〉 59 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 10 gggggaccag tgtcggaatg aagccaagtc cacgaccaac taacccaaat ggttatgcc 59 〈210〉 11 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 11 ggccatttat gtgggtaact ttaga 25 〈210〉 12 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 12 cgggcaatcg tgtcacaac 19 <210> 13 〈211〉 26 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400> 13 aagacagctc tcgcgacttg ctcgtg 26 <210> 14 〈211〉 15 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 14 Asp Ser Ser Glu Glu Lys Phe Leu Arg Arg lie Gly Arg Phe Gly 15 10 15 〈210〉 15 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <400> 15 Asp Asp Lys Glu Glu Pro Glu Ser Gin Arg Arg lie Gly Arg Phe Gly 15 10 15 〈210〉 16 〈211〉 16 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 <400> 16 Ser Val Lys Arg Gly Thr Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro 15 10 15 〈210〉 17 〈211〉 12 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈400> 17 Asp Asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10
【权利要求】
1. 一种具有自矿化能力的疫苗，其特征在于：所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽 具有诱导无机物矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程手段或化学修饰的方法引入。
2. 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的无机物为含钙矿物。
3. 根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述的含钙矿物选自磷酸钙、碳酸钙、草 酸钙中的任意一种或任意多种。
4. 根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述的多肽为含有羧基的多肽。
5. 根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的含有羧基的多肽为含有天冬氨酸 和/或谷氨酸的多肽。
6. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：所述的多肽包含如下所示序列其中之 X-X-Lys(X)-X-X-Pr〇-X-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-X-X-Lys-Phe-Leu-Gly-Arg-Phe-Gly ； X-X-Ser-Ser-(X-X)n ； Pro-(Phe-X) n-Pro ； 其中X为Asp或Glu，n为1-6。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为单价疫苗、多价疫苗 或。
8. 根据权利要求1-6任一项所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为病毒疫苗。
9. 根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠 道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、黄热疫 苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗。
10. -种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求1-9任一项所述的 具有自矿化能力的疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。
11. 权利要求1-9任一项所述的具有自矿化能力疫苗的制备方法，包括如下步骤： (1) 构建疫苗的基因组克隆，得到疫苗核酸序列； (2) 将编码多肽的核酸序列插入步骤（1)获得的疫苗核酸序列的目的位置，得到疫苗 的重组克隆； (3) 将步骤（2)得到疫苗的重组克隆在细胞内表达，得到具有自矿化能力的疫苗。
12. -种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求11所述的方法制 得的具有自矿化能力的疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。
13. -种具有热稳定性的矿化疫苗，其特征在于：所述的矿化疫苗包括矿化的无机物 外壳和权利要求1-9任一项所述的具有自矿化能力的疫苗，所述的无机物外壳包被在所述 的具有自矿化能力的疫苗的表面。
14. 根据权利要求13所述的矿化疫苗，其特征在于：所述的无机物外壳选自磷酸钙、碳 酸钙、草酸钙。
15. -种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求13或14所述的矿 化疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。
16. 权利要求1-9任一项所述的具有自矿化能力的疫苗的矿化方法，其特征在于包括 如下步骤： (1) 配制初始体系：将具有自矿化能力的疫苗配制成疫苗溶液，向疫苗溶液中加入 Ca2+离子和酸根离子，所述的酸根离子选自磷酸根离子、碳酸根离子、草酸根离子的任意一 种或任意多种； (2) 将所述初始体系在20°C?37°C、pH彡6. 0条件下进行孵育0. 5h以上，制得具有 热稳定性的矿化疫苗。
17. 根据权利要求16所述的矿化方法，其特征在于：所述步骤（1)、步骤⑵中pH为 6. 5?9. 5,优选的pH为7. 2。
18. 根据权利要求16所述的矿化方法，其特征在于：所述步骤（2)的孵育时间为lh? 12h，优选的孵育时间为2h。
19. 根据权利要求16所述的矿化方法，其特征在于：所述初始体系中，所述Ca2+离子 浓度为4 mM以上，优选的Ca2+离子浓度为5. 5?20mM，更优选的Ca2+离子浓度为5. 5? 6. 5mM〇
20. 根据权利要求16所述的矿化方法，其特征在于：所述初始体系中，所述酸根离子的 浓度为〇. 5?2. OmM，更优选的浓度为0. 9?1. 0 mM。
21. 根据权利要求16所述的矿化方法，其特征在于：所述初始体系中，所述疫苗溶液的 浓度为50mg?10g/L。
22. -种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求16-21任一项所述 的矿化方法制得的具有热稳定性的矿化疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。
【文档编号】A61K9/00GK104096235SQ201310278495
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年4月10日
【发明者】王广川, 秦成峰, 唐睿康, 李晓峰, 徐旭荣, 秦鄂德 申请人:浙江大学, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所