专利名称：用作预防猪囊虫病的基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)蛋白或基因作为载体，携带猪带绦虫保护性抗原表位，构建亚单位蛋白疫苗以及核酸疫苗。
背景技术：
囊虫病是由猪带绦虫的幼虫-猪囊尾蚴感染猪或人而引起的人畜共患寄生虫病，在我国有27个省、市自治区发现本病。猪是最主要的中间宿主，人不仅是中间宿主，而且是唯一的终末宿主。该病在我国流行广泛，对畜牧业和人类健康带来很大危害。因此加强猪囊虫病的防治在促进养猪业发展、改善公共卫生方面均具有重要意义。目前关于囊虫病的防治还未有成熟的手段，过去的化学药物治疗以及虫体抗原免疫都已经暴露了很大的局限性。免疫预防是一种有效途径。随着分子生物学技术的发展，寄生虫免疫学研究也取得较大进展，通过寻找相关基因，在体外克隆并表达该基因，用表达产物作为抗原进行免疫和诊断是解决其抗原来源的有效手段。
有关猪囊虫病的基因工程疫苗研制，国内外均有报道。Johnson等克隆出分子量为45kD的羊带绦虫六钩蚴抗原，用其制成的疫苗，对羊的保护率达94％。这一突破性成果提示，用基因工程的方法研制猪囊虫疫苗是可行的。Kalina等用酸性核糖体磷蛋白(简称arpP2)特异性引物从猪囊尾蚴的cDNA表达文库中分离出arpP2基因，并在大肠杆菌中表达了分子量为15kD的蛋白，他们预测arpP2抗原在自身免疫病尤其是脑囊虫病诊断和免疫预防中具有应用前景。巫雪艳等制备了以猪囊尾蚴全虫抗原和转移因子为主体的复合疫苗，经田间免疫试验表明，此复合疫苗能使猪产生较强的免疫保护力，保护率达90％，且保护时间达半年以上。核酸疫苗作为继减毒疫苗、基因工程疫苗后的第三代疫苗，以其全面诱导免疫应答，具有安全无毒，长效持久，表达稳定，生产简便，成本低廉，贮运方便等优点，已在细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病及肿瘤的预防和治疗领域中显示巨大潜力。但猪囊虫DNA疫苗方面的研究尚处于起步阶段，报道甚少。Harrison等成功研制出羊带绦虫DNA疫苗，对羊的保护率率达90％以上，证明DNA疫苗能成功控制细胞外寄生性蠕虫病。孙树汉等研制出了猪囊尾蚴保护性抗原cCI的DNA疫苗，后又用猪IL-4真核表达质粒与cCl DNA疫苗联合应用，初步显示IL-4具有良好的免疫佐剂性能。高荣等构建了猪囊尾蚴表达型cDNA文库，筛选出猪囊尾蚴的抗原基因TS21，构建了TS21的真核表达型载体VTS21，成功进行了体外真核表达研究，为进一步研制猪囊虫DNA疫苗提供了基础。
目前国内有关猪囊虫疫苗的研究有两个重点一是猪囊尾蚴细胞疫苗的研究，天津农科院首次采用了细胞工程技术，确定了细胞苗的制备方法，初步建立了生产工艺，生产的细胞苗具有良好的免疫保护力。存在问题是细胞株的稳定性较差。另一个是核酸疫苗。目前国内外尚无商品化的猪囊虫疫苗。
发明内容
本发明的目的就是为了研制一种效果持久、安全性好且成本低的用作预防猪囊虫病的疫苗及其制备方法。
本发明的技术解决方案一种用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗，它以乙肝病毒的核心蛋白或乙肝病毒的核心蛋白基因为载体，在该载体的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上用基因工程方法插入猪囊尾蚴保护性抗原，构成预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗。
一种用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗的制备方法，它以乙肝病毒核心蛋白为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至原核表达质粒上，转化宿主菌，构建成工程菌，通过对含此质粒的工程菌诱导表达，获得大量目的蛋白并对其进行纯化，即可得到预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗；或者，以乙肝病毒核心蛋白基因为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至真核表达质粒，转化宿主菌并大量培养，柱纯化质粒DNA，即获得核酸疫苗(又称DNA疫苗)。
本发明构建一种新型的预防猪囊虫病的疫苗，它是以HBc抗原为呈现载体的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗，小鼠和仔猪动物试验已经证明这种疫苗具有很好的免疫预防效果。
单独用猪囊虫抗原表位直接免疫动物，发现其保护性抗体产生的水平都很低，体液免疫反应不强。乙肝病毒(HBV)的核心抗原(HBcAg)所具有的特殊结构特点，使其成为理想的构建疫苗的载体。HBc分子全长为183个氨基酸，可装配成大小两种颗粒，以大颗粒为主，分别为240和180个HBcAg单体，表面分别有120和90个刺突。用单克隆抗体对HBV核壳行免疫电镜观察，发现第78-83位氨基酸残基位于刺突的尖部。HBc大致可分为装配区(1-149)和核酸结合区(150-183)。有研究表明，在刺突部位插入外源片段，不影响颗粒形成，将149位后的氨基酸切除或切除后加上外源片段，也能保持形成颗粒的能力，其产物能在细胞内正确折叠和装配，且在真核和原核细胞内均能高效表达。假如能在HBc表面规则地排列所需要的多肽表位，就能作为免疫分子的载体，这样每个颗粒携有高密度的所需肽段，对产生免疫反应、结合受体等功能起重要作用。从免疫学角度看，HBc颗粒能显著刺激T、B细胞产生免疫反应。若免疫分子插入刺突区，能以其多拷贝、天然构象方式呈现于HBc颗粒表面，有利于依赖空间构象的表位的识别与提呈，另插入外源序列能使HBc自身抗原性降低，可避免HBc过高的抗原性对外源抗原的不利影响，从而使刺突区插入的外源序列免疫原性得到显著增强。除刺突外，C端α螺旋尾部也能在核壳表面形成小突出部位，是另一个B细胞识别位点。此外，HBc蛋白无传染性，作为应用载体，十分安全可靠。
HBc颗粒用作免疫分子的载体有许多优点HBc抗原可由180或240个单体组成病毒样颗粒，目的抗原表位被展示在HBc颗粒的表面可呈现天然结构；被免疫动物体内可检测到Th1和Th2型细胞因子；重组抗原产生的特异行抗体滴度可大于1.3×106，而抗HBcAg抗体滴度要低于完整抗原诱导的抗HBcAg抗体滴度，诱导的免疫反应倾向于Th2细胞反应；缺乏载体的多肽表位不能引起记忆性免疫性反应，而采用HBc颗粒作为载体的疫苗保护时间长；对人细胞没有直接毒性。在HBc基因的适当位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，构建出原核表达载体，通过对含此质粒的工程菌诱导表达，获得大量目的蛋白并对其进行纯化，即可得到蛋白疫苗。以此免疫动物，可刺激机体产生高滴度的保护性抗体。在此基础上构建真核表达载体，即核酸疫苗，直接用于免疫动物，可刺激机体产生全面、持久、有效的保护性抗体。用两种疫苗免疫的动物(小鼠、仔猪)对于绦虫卵的攻击均具有较高的保护率。故本发明对于预防猪囊虫病具有重要价值。
本发明首次将HBc载体用于猪囊虫病疫苗的研制方面。本发明将猪囊尾蚴保护性抗原表位或GST(谷胱甘肽还原酶)表位插入HBc的合适部位，经HBc的自我装配后，表位将呈现在核心蛋白(HBc)颗粒表面，从而加强抗原呈递能力，高水平地诱导T、B细胞的免疫反应，最终提高免疫猪对绦虫卵的抵抗力。
图1是一个杂合的携带了外源表位的HBcAg分子示意图。
图2是各猪囊尾蚴保护性抗原表位插入HBc的不同位置的构建结构示意图。
如图所示，图1中，A代表HBcAg的1-78位氨基酸，B代表插入的猪囊尾蚴保护性抗原表位，C代表HBcAg的79-149位氨基酸，D代表另一个猪囊尾蚴保护性抗原表位或GST表位。其中，B和D可以是一个单独的表位，也可以是两个融合的表位。
具体实施例方式
本发明的用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗是以乙肝病毒的核心蛋白或乙肝病毒的核心蛋白基因为载体，在该载体的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上用基因工程方法插入猪囊尾蚴保护性抗原，构成预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗。其中猪囊尾蚴保护性抗原优选插入在乙肝病毒的核心蛋白或核心蛋白基因第78-79位氨基酸之间或接在其第149位氨基酸处。所述的猪囊尾蚴保护性抗原最好采用猪囊尾蚴保护性抗原表位，如KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK；DD1IYCNRRTGKCQRMSAM；DD2FETLPNNVWYPVHAPNLG；DD3RSTLEDPSTMDLPIIPKQN；DD4TARQVSRLESGQA；DD5LRSLMFCDFVEPKG；DD6ANARGEAVCVLGAL；DD7KLLSAHNSTQHTSRKHK；DD8ERITISHRKQLA；DD9AKTNYPNERFKPIIRMNG；DD10HRKQLADNNFTQETAMTMI；DD11AHNSTQHTSRKHKVSLG；DD12AMPAQTAAKTNYPNERFKPI。
其中优选的猪囊尾蚴保护性抗原表位为KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；
GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK。
本发明基因工程疫苗的制备方法是以乙肝病毒核心蛋白为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至原核表达质粒上(该原核表达质粒可以是pET28a，pET18，pET32，pQE32)，转化宿主菌，构建成工程菌，通过对含此质粒的工程菌诱导表达，获得大量目的蛋白并对其进行纯化，即可得到预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗；或者，以乙肝病毒核心蛋白基因为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至真核表达质粒(该真核表达质粒可以是pcDNA3.1，pcDNA3.0，pVAX，Bacmid)，转化宿主菌并大量培养，柱纯化质粒DNA，即获得核酸疫苗(又称DNA疫苗)。
本发明亚单位蛋白疫苗(PCCE)的具体制备方法是，利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位氨基酸序列之间，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位氨基酸处，构建成原核表达质粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及测序证明其序列正确后，得到生产预防猪囊虫病疫苗的基因工程菌，再大规模培养基因工程菌并诱导表达，经纯化后获得亚单位蛋白疫苗(PCCE)。
本发明核酸疫苗的具体制备方法是，利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位氨基酸序列之间，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位氨基酸处，得到亚单位蛋白疫苗(PCCE)的基因序列，再将人IL-2的信号肽序列加到该基因序列的5’端，并克隆至真核表达质粒pVAX3.0上，构建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n，测序正确后，大量培养核酸疫苗工程菌，碱裂解法提取质粒DNA，过柱纯化，紫外分光光度计定量，即获得核酸疫苗。
下面根据实施例进一步描述本发明的技术方案。
本发明将猪囊尾蚴保护性抗原表位或GST表位插入HBc基因的合适部位，构建出原核表达质粒和真核表达质粒，从而获得预防猪囊虫病的蛋白疫苗和核酸疫苗。
根据文献报道的三个猪囊虫抗原表位，由上海生工合成引物。含有HBc抗原基因序列的质粒pHBc由本实验室保存，根据HBc序列合成一对引物。利用引物扩增HBc的1-149位氨基酸的DNA片段，并在78-79位之间引入酶切位点，在78-79间可插入猪囊虫保护性抗原表位，在149位之后也可接猪囊虫表位或GST表位。添加GST表位，能够调节Th1和Th2细胞间的平衡。据资料显示，GST表位能促进宿主细胞分泌高水平的IgG1、IgG2a和IgE，因此可认为该表位既刺激了Th1细胞又刺激了Th2细胞的功能，以致增强了保护性抗原诱导的保护性免疫应答效率。将含有保护性表位的HBc149基因片段克隆至原核表达载体上，测序正确后诱导表达并纯化出目标蛋白，即制成亚单位蛋白疫苗，可用于免疫动物。若将测序正确后的含有保护性抗原表位的基因片段克隆至可用作核酸疫苗的真核表达载体上，经序列鉴定正确后，可利用工程菌大量扩增质粒，用碱裂解法提取质粒并纯化，即制成核酸疫苗，用于免疫动物。
实施例1如图1所示，利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc149的78和79位氨基酸序列之间，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到第149位氨基酸处，构建成原核表达质粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及测序证明其序列正确后，再大规模培养工程菌并诱导表达，经纯化后获得亚单位蛋白疫苗，将此重组蛋白命名为PCCE，并用紫外分光光度计对其进行定量。
以肌肉注射法对小鼠进行免疫接种，辅以福氏不完全佐剂，3周后加强免疫一次，4周后再加强免疫一次，共注射三次。分别在免疫后第1、3、5、7、9周采集试验组和对照组小鼠的血清，ELISA法检测小鼠血清抗PCCE IgG，IgG2a和IgG1，取各组平均值作图。另免疫接种4周后，分别取试验组和对照组各10只小鼠，每只小鼠尾静脉注射新鲜猪绦虫卵10000枚，2月后放血处死，解剖观察肌肉组织病理改变，计算保护率。
ELISA结果显示，血清抗PCCE IgG阳性率为100％，随着免疫次数增加，抗体滴度不断升高，在第七周达最高值(约1∶106)，到第九周有所回落。抗体亚型IgG1和IgG2a也有同样规律，两者变化趋势一致，但总体IgG1稍高于IgG2a。小鼠保护性试验结果表明，PCCE对免疫组小鼠的相对保护率为89％。
实施例2在上例基础上，利用分子生物学技术和方法，将人IL-2的信号肽基因序列加到PCCE蛋白基因序列的5’端，并克隆至真核表达质粒pVAX3.0上，构建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n。测序正确后大量培养工程菌，提取质粒，过柱纯化，紫外分光光度计定量，即获得核酸疫苗。
用核酸疫苗免疫一月龄仔猪，三周后加强免疫一次。加强免疫两周后，每头猪灌胃20,000枚新鲜的感染性绦虫虫卵，三个月后放血处死，解剖观察肌肉组织病理改变，计算保护率。
实验结果表明，核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n对免疫仔猪的相对保护率为83％。
实施例3利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位氨基酸序列之间，表位GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK融合到149位氨基酸处，构建成原核表达质粒pET28a-Δc-n1n2G1，用SDS-PAGE以及测序证明其序列正确后，将含有保护性抗原表位的HBc149片段亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.0上，构建成核酸疫苗pcDNA-Δc-n1n2G1，测序正确后大量培养工程菌，提取质粒，过柱纯化，紫外分光光度计定量，即获得核酸疫苗。
用核酸疫苗免疫一月龄仔猪，三周后加强免疫一次。加强免疫两周后，每头猪灌胃20,000枚新鲜的感染性绦虫虫卵，三个月后放血处死，解剖观察肌肉组织病理改变，计算保护率。
实验结果表明，核酸疫苗pcDNA-Δc-n1n2G1对免疫仔猪的相对保护率为86％。
其它亚单位蛋白疫苗实施例利用分子生物学技术和方法，将多个不同的表位插入HBc的不同位置，克隆至原核表达质粒上，构建成多个不同的亚单位蛋白疫苗工程菌，具体构建结构如图2所示，其它条件同实施例2。再大规模培养工程菌并诱导表达，将经纯化后获得亚单位蛋白疫苗用于免疫仔猪。结果表明对于绦虫卵的攻击均具有40-80％的保护率。
其它核酸疫苗实施例利用分子生物学技术和方法，将不同的表位插入HBc的不同位置，再克隆至真核表达质粒上，构建成不同的真核表达质粒，具体构建结构亦如图2所示，其它条件同实施例3。测序证明其序列正确后，构建成核酸疫苗。大量培养工程菌，柱纯化质粒DNA，用于免疫仔猪。结果表明对于绦虫卵的攻击均具有40-80％的保护率。
权利要求
1.一种用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗，其特征在于它以乙肝病毒的核心蛋白或乙肝病毒的核心蛋白基因为载体，在该载体的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上用基因工程方法插入猪囊尾蚴保护性抗原，构建成预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗。
2.按权利要求1所述的用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗，其特征在于所述的猪囊尾蚴保护性抗原插入在乙肝病毒的核心蛋白或核心蛋白基因第75-92位氨基酸之间或接在其第143-183位氨基酸之间。
3.按权利要求1所述的用于预防猪囊虫病的基因工程疫苗，其特征在于所述的猪囊尾蚴保护性抗原采用猪囊尾蚴保护性抗原表位。
4.按权利要求3所述的用于预防猪囊虫病的疫苗，其特征在于所述猪囊尾蚴保护性抗原表位是指KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK；DD1IYCNRRTGKCQRMSAM；DD2FETLPNNVWYPVHAPNLG；DD3RSTLEDPSTMDLPIIPKQN；DD4TARQVSRLESGQA；DD5LRSLMFCDFVEPKG；DD6ANARGEAVCVLGAL；DD7KLLSAHNSTQHTSRKHK；DD8ERITISHRKQLA；DD9AKTNYPNERFKPIIRMNG；DD10HRKQLADNNFTQETAMTMI；DD11AHNSTQHTSRKHKVSLG；DD12AMPAQTAAKTNYPNERFKPI。
5.按权利要求4所述的用于预防猪囊虫病的疫苗，其特征在于所述猪囊尾蚴保护性抗原表位是指KETc1(n1)APMSTPSATSVRG；KETc12(n2)GNLLLSCLG；GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA；GST(epi1)LVAAGVDYEDERISFQDWPK；GST(epi2)KPQEEKEKITKEILNGK。
6.权利要求1所述的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于它以乙肝病毒核心蛋白为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入多个猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至原核表达质粒上，转化宿主菌，构建成工程菌，通过对含此质粒的工程菌诱导表达，获得大量目的蛋白并对其进行纯化，即可得到预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗；或者，以乙肝病毒核心蛋白基因为载体，利用分子生物学技术和方法，在乙肝病毒核心蛋白基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至真核表达质粒，转化宿主菌并大量培养，柱纯化质粒DNA，即获得核酸疫苗。
7.按权利要求6所述的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于所述的原核表达质粒是指pET28a，pET18，pET32，pQE32；所述的真核表达质粒是指pcDNA3.1，pcDNA3.0，pVAX，Bacmid。
8.按权利要求6所述的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位氨基酸序列之间，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位氨基酸处，构建成原核表达质粒pET28a-Δc-3n，用SDS-PAGE以及测序证明其序列正确后，得到生产预防猪囊虫病疫苗的工程菌，再大规模培养工程菌并诱导表达，经纯化后获得亚单位蛋白疫苗。
9.按权利要求6所述的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于利用分子生物学技术和方法，将表位KETc1(n1)APMSTPSATSVRG和KETc12(n2)GNLLLSCLG插入HBc的78和79位氨基酸序列之间，表位GK-1(n3)GYYYPSDPNTFYAPPYSA融合到149位氨基酸处，得到亚单位蛋白疫苗的基因片段，再将人IL-2的信号肽序列加到该基因片段的5’端，并克隆至真核表达质粒pVAX3.0上，构建成核酸疫苗pVAX-S-Δc-3n，测序正确后大量培养核酸疫苗基因工程菌，碱裂解法提取质粒DNA，过柱纯化，紫外分光光度计定量，即获得核酸疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种用作预防猪囊虫病的基因工程疫苗及其制备方法，该疫苗是以乙肝病毒的核心蛋白或乙肝病毒的核心蛋白基因为载体，在该载体的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上用基因工程方法插入猪囊尾蚴保护性抗原，构成预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗。其制备方法是以乙肝病毒核心蛋白为载体，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第1位氨基酸至第183位氨基酸之间的多个位置上插入猪囊尾蚴保护性抗原基因，克隆至原核表达质粒或真核表达质粒上，转化宿主菌，经诱导目的基因表达、获得目的蛋白或柱纯化真核表达质粒DNA，即可得到预防猪囊虫病的亚单位蛋白疫苗或核酸疫苗。
文档编号A61P33/00GK1634596SQ20041006567
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者邓小昭, 刁振宇, 吴 琳, 周宗安, 陶开华, 刘玉, 王元伦, 高键, 王永山, 郑纪山 申请人:中国人民解放军南京军区联勤部军事医学研究所