抗家畜亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法

专利名称：：抗家畜亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属免疫学及遗传工程
技术领域：
，具体涉及一种抗AsiaI(亚洲I型)型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法。
背景技术：
：国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。近几年，Asial型口蹄疫在我国呈蔓延之势，在全国多个省市爆发，对畜牧业和畜产品出口造成很大的经济损失，日益引起人们的关注。因此，构建有效的亚洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗对我国的畜牧业及国家经济发展有着重大的意义。预防接种疫苗是控制该病毒的主要手段之一。在各种预防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果稳定等优点具有广阔的应用前景。与口蹄疫病毒(foot一and—mouthdiseasevirus,FMDV)免疫原性密切相关的是其外壳蛋白VP1基因，该蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。在已有的口蹄疫基因工程多肽疫苗的研究中，主要是研究抗0型、A型的口蹄疫病毒，以VP1蛋白中的几个不同抗原决定簇位点结合,构建重组多肽疫苗。发明人前期的实验研究中，进行AsiaI型口蹄疫病毒抗原表位筛选，筛选到在AsiaI型口蹄疫病毒VPl结构蛋白中，存在一个诱导中和抗体的抗原表位位点，即为VP1蛋白的133-163氨基酸片段，同时筛选到在VP2结构蛋白中存在一个抗原表位位点，即VP2蛋白1-33氨基酸片段，该肽段能明显增强动物产生中和抗体的能力。在此基础上，构建一种有效的对抗Asial型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗，组建成VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原表位的重复串联结构，将该口蹄疫病毒主要抗原表位重复串联结构与一大分子载体蛋白相连，构成一融合蛋白，能有效地诱发动物产生免疫应答。
发明内容本发明的目的在于提供一种能有效的抗家畜Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法。本发明已筛选到AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸多肽(SEQIDNO.1,记为VP1(133-163))，VP2蛋白1-33位氨基酸多肽(SEQIDN0.2,记为VP2(1-33))，均为抗原表位，将这两种抗原组成重复的串联结构，实施例中为4VP1(133-163)-VP2(卜33)-VP1(133-163)重复串联结构(SEQIDNO.3)，用化学合成的方法合成该不同抗原表位组成的重复串联结构的DNA序列片段。并将该口蹄疫病毒主要抗原表位重复串联结构与一大分子载体蛋白相连，构成一融合蛋白，即得本发明的抗亚洲I型口蹄疫病毒的基因工程多肽疫苗。该多肽疫苗中两种抗原多肽的重复串联结构可采用如下结构的任一种方式X—Y—X、X_X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，其中，同一个串联结构的"X"、"Y"肽段来源于Asial型口蹄疫病毒VPl或VP2蛋白序列，并且"X"肽段代表AsiaI型口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸肽段(即VP1(133-163)),"Y"肽段代表VP2蛋白1-33位氨基酸肽段(即VP2(1-63))，"X"、"Y"肽段还可以分别是VP1(133-163)、VP2(1-33))前后浮动适当个数的氨基酸残基，如VP1蛋白130-170、VP2蛋白1-40位氨基酸肽段；"X"、"Y"肽段中的氨基酸可因预防不同的口蹄疫病毒变异毒株的需要进行调整，即"X"肽段可以是VP1(133-163)中有1一6个氨基酸可被置换，"Y"肽段可以是VP2(1-33)中有1一5个氨基酸可被置换。上述VP1(133-163)、VP2(l-33)的重复串联基因片段与载体蛋白基因相连，融合蛋白的载体蛋白可以是家畜IgG重链恒定区氨基酸序列的同源序列，长度可以是250-329个氨基酸；或者是P—半乳糖苷酶从第一个氨基酸开始共250-590个氨基酸肽段的同源序列。本发明分别以家畜igG重链恒定区蛋白或e—半乳糖苷酶蛋白为载体蛋白，将合成的VP1(133-163)、VP2(l-33)抗原多肽重复串联结构的DNA序列片段分别插入到上述两种载体蛋白基因的C端，构建两种不同的重组蛋白表达质粒，分别为pTl和pT2。抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，可以是用化学合成方法分别合成编码Asial口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白1_33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法将这些基因以多拷贝的方式串联，组建成AsiaI型口蹄疫病毒抗原多肽基因长片段。口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组及融合蛋白的表达，其特征在于具体步骤如下(1)用化学合成方法合成编码由VP1(133-163)、VP2(l-33)组成的重复串联结构DNA序列，将此基因与igG重链恒定区基因或者e—半乳糖苷酶基因c末端相连，构成融合基因；(2)将上述融合基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株；(3)将阳性菌株在3(TC到37'C之间诱导培养8到25小时，然后收集菌体；(4)将菌体破碎收集表达的融合蛋白乳化，配制成本发明多肽疫苗。该抗Asial型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，也可以是融合基因插入到表达载体以后，转入表达宿主中表达出融合蛋白，用HiTrap亲和层析柱纯化回收融合蛋白，再乳化配制成本发明有关的多肽疫苗。免疫佐剂可以是任何一种有效的免疫佐剂。包括矿物质佐剂和油类佐剂、微生物类佐剂或细胞因子佐剂等。将本发明制备的有效抗家畜AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，经免疫豚鼠后检测到豚鼠产生较高的中和抗体，另外经过动物攻毒实验表明该疫苗在豚鼠上的抗病毒保护效果达到100%，免疫豚鼠能全部抵抗剂量为100ID5Asial型口蹄疫病毒得攻击。本发明的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，同样适用于动物如牛、羊、猪以及偶蹄类经济动物或野生动物的免疫接种。具体实施例方式实施例1:以牛IgG重链恒定区肽段为载体蛋白构建口蹄疫AsiaI型口蹄疫多肽疫苗pTl。合成AsiaI口蹄疫病毒VPl基因中编码133-163位氨基酸肽段的DNA序列，VP2基因中编码1-33位氨基酸肽段的DNA序列，将其组建成VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)结构(SEQIDNO.3),其中VPl蛋白133-163氨基酸抗原片段重复一次，中间连接VP2蛋白1-33氨基酸片段。各个抗原表位间以含有几个氨基酸的接头连接，氨基酸接头分别为PG和QFELEFMVPSR。通过化学合成的方法合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)串联目的基因片段。通过限制性内切酶酶切目的基因片段，将该片段与表达载体连接，构建以牛的IgG重链恒定区氨基酸为载体蛋白的重组表达质粒(记为SEQIDNO.4)。在T4ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37'C倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切鉴定，DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计相符。将此克隆命名为pTl。将pTl以含50ug/ml卡拉霉素的LB培养液为发酵液，37'C搅拌速度6000rpui通气培养2小时，加入IPTG诱导IO小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟，观察超声效果可重复超声几次，超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。用含8mol/L尿素的变性液处理包涵体，待包涵体完全变性后经过HiTrap亲和纯化柱纯化包涵体，收集目的蛋白，将纯化后的包涵体与ISA206油配成油乳剂，即可获得一种新型的AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。实施例2:以e—半乳糖苷酶从第一个氨基酸开始共280个氨基酸肽段为载体蛋白构建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗pT2。实施例1中，已合成得到VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)抗原表位的重复串联结构的DNA片段，通过PCR特异性扩增反应改变该DNA片段两末端的酶切位点，PCR反应产物回收后经限制性内切酶酶切后与e—半乳糖苷酶基因的C末端相连接。构建AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗表达载体pT2。以实施例1中同样的方法，用pT2制备得AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后中和抗体的消长分别用基因工程苗pTl和pT2免疫豚鼠，结果见表1和表2。表1中的结果是基因工程苗pTl和pT2经过2次免疫豚鼠6只后，豚鼠的中和抗体消长结果，A组为两次免疫IgG为载体蛋白苗，B组为两次免疫pTl苗，C组为两次免疫e一半乳糖苷酶空白载体蛋白，D组为两次免疫pT2苗，免疫剂量为各组分蛋白单次免疫500第一次免疫14天后进行第二次免疫，第二次免疫21天后心脏采血测定豚鼠血清中和抗体效价；CK组为阴性对照组，不免疫任何蛋白；从表l的结果中说明，用pTl和pT2这两种苗去免疫豚鼠后，中和抗体均见明显的增长，而以igG为载体蛋白的pTi比以e_半乳糖苷酶作为载体蛋白的pT2所引起的中和抗体水平要稍高。表2中的结果是比较基因工程苗pTl和pT2分别经过一次免疫和二次免疫豚鼠后，豚鼠的中和抗体消长结果。实验分别设定免疫豚鼠组为1-5组及ck组，l组为两次免疫IgG为载体蛋白苗，2组为两次免疫pTl苗，3组为两次免疫e—半乳糖苷酶空白载体蛋白，4组为两次免疫pT2苗，免疫剂量为各组分蛋白单次免疫500ug，第一次免疫14天后进行第二次免疫，第二次免疫21天后心脏采血测定豚鼠血清中和抗体效价；5组为一次免疫pTl苗，免疫剂量为单次免疫lmg目的蛋白，1次免疫28天后采血测定中和抗体水平。ck组为不免疫任何疫苗空白对照组。从表2的结果中说明，基因工程苗pTl苗分别经过l次免疫和2次免疫豚鼠后，中和抗体均有明显的增长。表1.二次免疫豚鼠中和抗体效价测定每组各只豚鼠血清中和抗体效价<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2.比较一次免疫和二次免疫豚鼠产生中和抗体水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1和表2的说明血清中和抗体效价测定采用微量血清中和试验，将灭活的血清样品用MEM培基进行连续倍比稀释(1/2-1/512)，每个稀释度接4个孔，每孔50yl，并按同样方法设立阴阳血清对照。每个孔中加入100TCID5。/50yl的口蹄疫病毒。充分混匀后，37。C中和lh。加入分散好的细胞悬液体100y1(每孔细胞数量在l(T数量级)微量板加盖，平放于37t:，5%0)2培养箱内静置培养3天。培养终止时，甩去微量培养板内液体，每孔加入50ul细胞染色液，染色lh,自来水冲洗。当细胞对照、病毒对照，标准阴阳性血清对照都成立时，进行结果的判读。采用Reedmuench法计算中和抗体效价，效价采用PDs。表示，即半数细胞保护时血清稀释度。用上述基因工程疫苗免疫豚鼠后AsiaI型口蹄疫病毒攻毒结果为了证明两种基因工程苗对豚鼠的保护效果，分别用lmg的抗原融合蛋白免疫豚鼠。用两种疫苗免疫豚鼠，免疫组号与表2的免疫豚鼠组号相同(具体见表2)。一定时间后以Asial口蹄疫病毒进行攻击，攻毒剂量为100ID5。，结果显示该两种不同疫苗经一次免疫豚鼠后，28天后攻毒，豚鼠的抗病毒保护效果有70%，而经两次免疫豚鼠后21天攻毒，豚鼠的抗病毒保护效果均有100%。说明这两种疫苗在豚鼠上都有很好的抗病毒保护结果，是一种有效的抗AsiaI型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗。(见表3)表3融合蛋白对豚鼠的免疫保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表SEQIDNO.1KTTYGETTARRG薩ALAQRLSGRLPTSFNYSEQIDNO.2DKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTSEQIDNO.3SRKTTYGETTARRG腿ALAQRLSGRLPTS丽SEQIDNO.4IgG-VPl(133-163)-VP2(1-33)-VPl(133-163)SEQIDNO.5LacZ-VPl(133-163)_VP2(1-33)-VPl(133-163)权利要求1、一种抗家畜亚洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，其特征在于以亚洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸，VP2蛋白中1-33位氨基酸为抗原表位，前者记为VP1(133-163)，序列为SEQIDNO1，前者记为VP2(1-33)，序列为SEQIDNO2，将这两个抗原表位组成重复串联结构，化学合成该重复串联结构的基因片段；将该重复串联结构的基因片段与载体蛋白基因相连，该载体蛋白是家畜自体IgG或细菌的β—半乳糖苷酶，口蹄疫病毒重复串联抗原表位基因连接在载体蛋白基因的C末端，构成一融合蛋白；其中所述抗原表位的重复串联结构形式为X—Y—X、X—X—Y、X-Y-Y、Y-X-Y、Y—X—X或者Y-Y-X，同一个串联结构的“X”、“Y”肽段分别来源于AsiaI型口蹄疫病毒VP1和VP2蛋白序列，并且“X”肽段代表VP1(133-163)，“Y”肽段代表VP2(1-33)；或者“X”、“Y”肽段分别是VP1(133-163)和VP2(1-33)中前后浮动适当个数的氨基酸残基的肽段。2、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的载体蛋白是家畜IgG重链恒定区氨基酸序列的同源序列，长度是250-329个氨基酸；或者是e—半乳糖苷酶从第一个氨基酸开始共250-590个氨基酸肽段的同源序列。3、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于"X"、"Y"肽段中的氨基酸进行如下调整"X"肽段中有1一6个氨基酸被置换，"Y"肽段中有1一5个氨基酸被置换。4、根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于所述抗原表位的重复串联结构形式为VP1(133-163)-VP2(1-33)-VP1(133-163)，该重复串联片段基因序列编码的重复抗原多肽氨基酸序列为SEQIDNO.3,载体蛋白为动物自体IgG重链恒定区蛋白，其构建的串联基因结构序列为SEQIDNO.4;载体蛋白为e—半乳糖苷酶，其构建的串联基因结构序列为SEQIDNO.5。5、根据权利要求1中所述的多肽疫苗，其特征在于所用免疫佐剂为矿物质佐剂、油类佐剂、微生物类佐剂或细胞因子佐剂。6、如权利要求1所述的亚洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，其特征在于是用化学合成方法或PCR体外特异性扩增方法合成编码亚洲I口蹄疫病毒VP1蛋白133-163位氨基酸序列的核苷酸序列，VP2蛋白l-33位氨基酸的核苷酸序列，然后用基因工程克隆方法将这些基因以多拷贝的方式串联，组建成亚洲I型口蹄疫病毒抗原多肽基因长片段。7、根据权利要求6所述的亚洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组及融合蛋白的表达，其特征在于具体步骤如下(1)用化学合成方法合成编码由VP1(133-163)和VP2(1-33)组成的重复串联结构DNA序列，将此基因与IgG重链恒定区基因或者e—半乳糖苷酶基因相连，构成融合基因；(2)将上述融合基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株；(3)将阳性菌株在3(TC到37'C之间培养8到25小时，然后收集菌体；(4)将菌体破碎收集表达的融合蛋白；(5)将融合蛋白纯化，并乳化配制成本发明有关的多肽疫苗。全文摘要本发明属于免疫学与遗传工程
技术领域：
，具体为一种抗家畜亚洲I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法。本疫苗利用亚洲I型口蹄疫病毒VP1蛋白中133-163位氨基酸这一B细胞表位，以及VP2蛋白中1-33位氨基酸的T细胞表位，用化学方法合成编码这两种抗原表位基因组成的重复串联基因序列，将这一串联重复基因序列分别插入牛IgG重链恒定区基因的C末端，或β-半乳糖苷酶基因的C末端构建两种表达载体，经发酵后分别表达两种融合蛋白，超声并纯化后制备成疫苗，检测该两种疫苗的安全性及对动物的免疫保护作用，经动物攻毒实验证明两种疫苗对豚鼠有良好的保护效果，免疫豚鼠100％抵抗100ID₅₀剂量的AsiaI型口蹄疫病毒攻击。文档编号A61K47/48GK101422606SQ20081003656公开日2009年5月6日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者严维耀,刘明秋,王加龙,郑兆鑫,姬韩申请人:复旦大学