专利名称：抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术：
弧菌病是海水养殖动物中常见的流行病，在现有的技术中，目前只有鳗弧菌菌体疫苗的生产和应用，尚未见弧菌基因工程疫苗的生产和应用。鳗弧菌菌体疫苗在水产养殖生产中具有较专一的抗弧菌特异性，对抗鳗弧菌引起的疾病具有较高的抗性，但正是由于其作用专一，对其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用较差，在生产应用中存在非常明显的局限性。此外，传统的细菌疫苗的生产工序上在最后环节加入灭活用药物，残留于疫苗中，导致存在副作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗，该疫苗适合作多种海水养殖动物提高养殖产量的抗弧菌病的免疫剂，外毒素基因的表达产物经福尔马林灭活后制成，产生菌种为最小弧菌，其特性能完全为作用动物所接受。本发明所述的抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗的制备通过以下步骤实现的1，外毒素氨基酸序列的测定及目的基因探针的设计对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针，用以筛选及检测外毒素基因。
2，外毒素基因的克隆及表达利用凝胶电泳分离等方法分离目的DNA片段。目的DNA片段与克隆载体质粒连接后转化大肠杆菌感受态细胞，以碱裂解法提取质粒，用最小弧菌外毒素基因探针检测，确认重组质粒中插入片段为含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
目的DNA与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，菌体培养物用超声波破碎，裂解物作SDS-PAGE，并用最小弧菌外毒素单克隆抗体作Western blotting，以检测所表达的外毒素。
3，基因工程疫苗的制备外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，采用硫酸铵分级盐析、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯。用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为基因工程疫苗。
本发明提供的弧菌基因工程疫苗的生产工艺，具体制备方案是这样实现的1、最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基后，30℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
2、外毒素的提纯采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法进行提纯。
3、对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核苷酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针。
4、应用酚-氯仿法提取最小弧菌染色体DNA。选择适当限制性内切酶利用局部消化法处理基因组DNA，凝胶电泳分离，作Southern blotting，转印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探针检测。切取与阳性反应条带位置相应的凝胶条，用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。
克隆载体质粒酶切后，与回收的目的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经培养16-18小时后，以碱裂解法提取质粒，用最小弧菌外毒素基因探针检测，确认重组质粒中插入片段为含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5、外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯。用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为基因工程疫苗苗。
本发明所述疫苗在生产应用中的效果本发明所提供的抗海水养殖动物弧菌病基因工程疫苗的用途，是可应用于海水养殖动物弧菌病的免疫，这种疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率平均可达84％。该疫苗适用于免疫多种海水养殖鱼类，并具有提高养殖产量的效果。利用上述制备的疫苗经浸泡免疫养殖动物，其保护效果见下表
表1 疫苗在网箱养殖真鲷中的试用效果
表2 疫苗在网箱养殖石斑鱼中的试用效果
具体实施例方式实例11，取经活化的最小弧菌10ml，接种于1000ml经过滤的普通海水营养培养基，30℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
2，外毒素的提纯采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法进行提纯。
硫酸铵分级盐析离心上清中加入固体硫酸铵至20％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，弃沉淀，再于上清中加固体硫酸铵至60％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，去上清，沉淀溶于浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液中，对相同缓冲液透析过夜，收集即为粗提外毒素1。
DEAE-纤维素离子交换层析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纤维素柱上(Phamacia产品，2.6cm×30cm)。用浓度为0~1mol/L的NaCl以及浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液梯度洗脱，流速为5ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰洗脱液，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜。用聚乙二醇PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为粗提外毒素2。
Sephadex-G100层析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100层析柱中(Phamacia产品，1.6cm×100cm)，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液洗脱，流速为6ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰，用PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为纯化外毒素。
3，对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核苷酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针。
4，应用酚-氯仿法提取最小弧菌染色体DNA。选择适当限制性内切酶利用局部消化法处理基因组DNA，凝胶电泳分离，作Southernblotting，转印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探针检测。切取与阳性反应条带位置相应的凝胶条，用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。
克隆载体质粒酶切后，与回收的目的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经培养16-18小时后，以碱裂解法提取质粒，用最小弧菌外毒素基因探针检测，确认重组质粒中插入片段为含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯。用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为基因工程疫苗。
实例21，取经活化的最小弧菌10ml，接种于1000ml经过滤的普通海水营养培养基，27℃、200rpm摇床培养20-24小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
2，外毒素的提纯采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法进行提纯。
硫酸铵分级盐析离心上清中加入固体硫酸铵至20％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，弃沉淀，再于上清中加固体硫酸铵至60％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，去上清，沉淀溶于浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液中，对相同缓冲液透析过夜，收集即为粗提外毒素1。
DEAE-纤维素离子交换层析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纤维素柱上(Phamacia产品，2.6cm×30cm)。用浓度为0~1mol/L的NaCl以及浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液梯度洗脱，流速为5ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰洗脱液，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜。用聚乙二醇PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为粗提外毒素2。
Sephadex-G100层析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100层析柱中(Phamacia产品，1.6cm×100cm)，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液洗脱，流速为6ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰，用PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为纯化外毒素。
3，对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核苷酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针。
4，应用酚-氯仿法提取最小弧菌染色体DNA。选择适当限制性内切酶利用局部消化法处理基因组DNA，凝胶电泳分离，作Southernblotting，转印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探针检测。切取与阳性反应条带位置相应的凝胶条，用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。
克隆载体质粒酶切后，与回收的目的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经培养16-18小时后，以碱裂解法提取质粒，用最小弧菌外毒素基因探针检测，确认重组质粒中插入片段为含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯。用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为基因工程疫苗。
实例31，取经活化的最小弧菌10ml，接种于1000ml经过滤的普通海水营养培养基，37℃、200rpm摇床培养18-20小时，培养物经10000rpm离心30分钟，取上清。
2，外毒素的提纯采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法进行提纯。硫酸铵分级盐析离心上清中加入固体硫酸铵至20％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，弃沉淀，再于上清中加固体硫酸铵至60％的饱和度，置于4℃静置4小时，10000rpm离心30分钟，去上清，沉淀溶于浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液中，对相同缓冲液透析过夜，收集即为粗提外毒素1。
DEAE-纤维素离子交换层析粗提外毒素1加入已平衡的DEAE-纤维素柱上(Phamacia产品，2.6cm×30cm)。用浓度为0~1mol/L的NaCl以及浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液梯度洗脱，流速为5ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰洗脱液，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜。用聚乙二醇PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为粗提外毒素2。
Sephadex-G100层析粗提外毒素2加入已平衡的Sephadex-G100层析柱中(Phamacia产品，1.6cm×100cm)，用浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液洗脱，流速为6ml/cm2/小时，每4ml收集一管，同时测定每管的溶血价。合并蛋白峰，用PEG100浓缩胶浓缩，然后再对浓度为50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.8)缓冲液透析过夜，即为纯化外毒素。
3，对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核苷酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针。
4，应用酚-氯仿法提取最小弧菌染色体DNA。选择适当限制性内切酶利用局部消化法处理基因组DNA，凝胶电泳分离，作Southernblotting，转印到NC膜上的DNA用最小弧菌外毒素基因探针检测。切取与阳性反应条带位置相应的凝胶条，用DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。
克隆载体质粒酶切后，与回收的目的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经培养16-18小时后，以碱裂解法提取质粒，用最小弧菌外毒素基因探针检测，确认重组质粒中插入片段为含最小弧菌外毒素基因的目的DNA片段。
5，外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析等生化方法对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯。用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为基因工程疫苗。
权利要求
1.一种抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗，其特征在于本疫苗由权利要求2中所述的为最小弧菌外毒素基因的表达产物经福尔马林灭活后制备，产生菌种为最小弧菌。
2.一种制备权利要求1所述的抗海水养殖动物弧菌病基因工程疫苗方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)、最小弧菌活化后接种普通海水营养培养基后，30℃、200rpm摇床培养18-20小时；(2)、采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及Sephadex-G100层析方法对培养物上清外毒素进行分离、纯化；(3)、对已提纯的外毒素进行氨基酸测序，根据氨基酸序列反推出外毒素基因编码区可能的核酸序列，据此用DNA合成仪体外合成寡核苷酸片段，用DIG标记后作探针，用以筛选及检测外毒素基因；(4)、外毒素基因与表达载体质粒重组后转化大肠杆菌，对培养物上清进行外毒素基因表达产物的提纯，用浓度为0.2％的福尔马林对表达产物进行灭活处理，得到的灭活疫苗为抗海水养殖动物弧菌病基因工程疫苗。
3.一种权利要求1中所述抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗的用途，其特征在于该疫苗适用于免疫多种海水养殖鱼类，并具有提高养殖产量的作用。
全文摘要
本发明涉及抗海水养殖动物弧菌病的基因工程疫苗及制法用途。目前只有鳗弧菌菌体疫苗的生产和应用，对其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用较差，此外，传统的细菌疫苗的生产工序在最后环节加入灭活用药物，残留于疫苗中，导致副作用。本发明所述疫苗为最小弧菌外毒素基因的表达产物经福尔马林灭活后制成，纯化后的表达产物经福尔马林灭活制成疫苗。这种基因工程疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率可达84％。该疫苗适用于免疫多种海水养殖鱼类，并具有提高养殖产量的效果。
文档编号A61K39/02GK1706496SQ20051003466
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月18日 优先权日2005年5月18日
发明者吴后波, 李涛 申请人:中国科学院南海海洋研究所