专利名称：幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的研制方法，特别是幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人类最常见的慢性感染菌之一，是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病原因子，与胃腺癌和胃粘膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关，世界卫生组织癌症研究机构(IARC)已将其列为第1类致癌因子。对Hp感染的有效预防和治疗，将可能使消化性溃疡等相关疾病成为历史性疾病。现有的根除Hp的手段主要是联合应用抑酸剂及二或三种抗生素，但有鉴于Hp感染的普遍性(尤其是发展中国家)、耐药菌株的不断增加、病人的低依从性以及联合治疗方案的昂贵等因素，使抗菌疗法难以成为完全根除该菌的最佳方法，如能成功地研制出一种既有预防功能又有治疗作用的疫苗无疑可使众多的Hp感染者受益，并可能会预防数百万例溃疡、淋巴瘤及胃腺癌的发生，带来巨大的社会和经济效益。
国外自1991年开始Hp疫苗的先驱研究，最早采用的免疫原为全菌裂解物，后因成分复杂、具有潜在毒副作用而渐遭淘汰；理想的保护性抗原应该高纯度、无毒性、易制备，且能干扰细菌的定植和毒力的产生，基因重组蛋白因具备上述优势成为必然的选择。目前已采用的免疫原主要有尿素酶(Urease)、细胞空胞毒纯洁(VacA)及毒素相关蛋白(CagA)、热休克蛋白(HspA/HspB)、过氧化氢酶等，它们在粘膜佐剂的共同作用下均能保护50％以上的小鼠免受螺杆菌的感染。但是一种抗原显然不太可能在人体诱导出足够的保护性免疫，要让所有受试者都产生有效的保护作用，必须要有足够的靶抗原。已有学者证实由两种抗原组合而成的疫苗具有比两者单独使用更强的保护作用。几乎可以肯定由两种或两种以上抗原组合而成的疫苗是必需的。
美国Oravax公司与瑞士Michetti小组已合作完成了重组尿素酶免疫治疗作用的Ⅰ期临床试验。发现在佐剂参与下，口服重组尿素酶可使细菌定植密度大幅度下降，但炎症或粘膜损伤程度几乎没有变化，也无明显副作用产生，进一步证实免疫接种防治Hp感染的可行性，但也显示在免疫原的选择、免疫途径及疫苗输送方式的使用上需要进一步完善。
如前述，尽管目前已有多种抗原组分在动物模型中得以评价，但它们基本上着眼于阻断Hp的毒力因素，而与Hp定植密切相关的粘附素尚未评价。根据既往肠道传染病疫苗的研究经验，阻断定居因子和毒力因素是疫苗发生作用的两大环节，两者缺一不可。
本发明的目的旨在克服现有技术的不足而提供一种工艺简捷、免疫效果好以获取幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法。
本发明的目的是这样实现的一种幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于用粘附素HpaA辅以粘膜佐剂，再经微囊包裹后灌服动物，具有明显的免疫原性。
——所述的粘附素HpaA经克隆和表达，用浓度为30-40％的硫酸铵分级沉淀浓缩粗提，再用溶液A(PH8.0～8.2的25mμTvisCl)和溶液B(A+1MNaCl)进行阴离子交换层析，再经SephodexG100FF进行凝胶过滤层析，最后经超滤浓缩既制得纯度达98％以上的HpaA重组蛋白。
——所述的粘膜佐剂以LTK63为佳。
——所述的微囊包裹以直径6～8μm为佳。
——所述的动物以SPF级BalB/C小鼠为佳。
下面通过实施例对本发明作进一步详述按说明书的工艺制得的HpaA纯蛋白辅以粘膜佐剂LTK63后，制成直径6～8μm的微囊，对SPF级BalB/C小鼠进行灌服第1天、第3天和第5天，待到第20天、第23天、第25天时用HP活菌攻击后，至2个月、5个月时分批处死动物，检测小鼠胃粘膜HP的定植情况，以确定保护率。
结果为完全保护率为40％(40％的小鼠未感染HP)，其余60％的小鼠细菌菌量较对照组明显减少，而单用PBS或单用LTK63佐剂的对照组100％的小鼠均感染HP。
本发明的研制方法采用与HP定植密切相关的粘附素HpaA为免疫原，这一重组抗原的获得为将来制备多价或多组分HP疫苗提供了一个重要的备选抗原。本发明工艺简捷、免疫效果好，其药物制剂将提供治疗慢性胃炎、消化性溃疡乃至胃癌等的重要和有效方法。
权利要求
1.一种幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于用粘附素HpaA辅以粘膜佐剂，再经微囊包裹后灌服动物，具有明显的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于粘附素HpaA经克隆和表达，用浓度为30-40％的硫酸铵分级沉淀浓缩粗提，再用溶液A(PH8.0～8.2的25mμTvisCl)和溶液B(A+1MNaCl)进行阴离子交换层析，再经SephodexG100FF进行凝胶过滤层析，最后经超滤浓缩既制得纯度达98％以上的HpaA重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于粘膜佐剂以LTK63为佳。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于微囊包裹以直径6～8μm为佳。
5.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法，其特征在于动物以SPF级BalB/C小鼠为佳。
全文摘要
本发明提供一种幽门螺杆菌粘附素HpaA基因工程疫苗的研制方法,其特征在于用粘附素HpaA辅助以粘膜佐剂,再经微囊包裹后灌服动物,具有明显的免疫原性。本发明工艺简捷、免疫效果好,其药物制剂将提供治疗慢性胃炎、消化性溃疡乃至胃癌等的重要和有效方法。
文档编号A61K39/02GK1301571SQ9912466
公开日2001年7月4日 申请日期1999年12月24日 优先权日1999年12月24日
发明者周殿元, 陈烨, 王继德, 张亚历, 张振书 申请人:南方医院