专利名称：：疫苗载体的制作方法疫苗载体本发明涉及新型低变应原性分子及其用途。I型过敏症是IgE介导的超敏性疾病，其影响大约25%的人口。它是基于特异性免疫球蛋白E对无害的空中传播的、昆虫、毒液、食物变应原和接触变应原抗原(源自本身无害的抗原来源，例如花粉、昆虫、霉菌和动物蛋白)的识别。与效应细胞结合的IgE抗体的交联引起炎性调节子(例如组胺，白细胞三烯(leucotrienes))的释放并因此引起过敏症的即刻症状(例如，鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏反应)。通过IgE依赖性和IgE非依赖性机制进行的T细胞激活有助于慢性过敏性炎症。过敏症治疗的可能的唯一致使形式为变应原特异性免疫治疗，其基于反复使用渐增数量的大多数来源的变应原提取物。很多临床研究证明了注射免疫治疗的临床功效，并有这种治疗下的几种免疫机理的证据。由于制备来自某些变应原来源的高质量变应原提取物的困难，以及向病人使用变应原会引起严重的副作用的事实，只能够向某些病人组和疾病表现来推荐变应原特异性免疫治疗。治疗对几种不同变应原来源共同敏感的病人以及遭受严重疾病表现例如过敏性哮喘的病人是特别困难的。过敏性哮喘是过敏症最严重的表现之一，因为它严重影响日常生活质量，引起高入院率，其表现为严重的、威胁生命的形式，需要对病人的深切关注。从天然变应原来源制备的变应原提取物性质上是粗糙的，不可能通过技术手段影响这种制备物中的个别变应原的质量和数量。它们也含有各种不明确的非变应原性成分，几项最近的研究表明了这种提取物的劣质并证明了它们的高异质性。在过去的十年中，使用重组DNA技术在分子变应原鉴定领域取得了巨大进步。很大数量的引起疾病的最重要的变应原已被鉴定至分子水平，已经生产出模拟天然变应原提取物表位复杂性的重组变应原。而且，几个研究小组己经使用己知的关于变应原结构的知识发展了确定的新的过敏症疫苗。已经使用遗传工程、合成肽化学和变应原与免疫剌激DNA序列的结合来减少新疫苗的变应原性活性，并因此减少治疗诱导的副作用率。以这种变应原衍生物进行了第一个有前景的临床研究。有趣的是，虽然可以强烈减少或甚至消除遗传工程化重组变应原和源自变应原的合成的包含T细胞表位的肽的IgE反应活性，但是这些衍生物仍然可以诱导全身性副作用(出现于注射几小时后)。例如，有报道指出，在皮内注射几个小时以后，主要猫变应原Feldl的T细胞表位肽诱导了哮喘和支气管的高反应性，且有力证据表明，这种效应是T细胞介导的和MHC限制性的。这些结果表明，除去IgE反应活性可减少IgE介导的副作用，因为在这些免疫治疗研究的过程中未记录到即现反应。但是，变应原特异性T细胞表位(被保留在重组变应原衍生物以及肽混合物中)是造成延迟的副作用(例如非常有问题的或过敏性皮炎，慢性T细胞介导的过敏性皮肤表现)的原因。在重组变应原衍生物的情况下，所引起的副作用相对轻微，在T细胞肽疫苗的情况下可通过足够的剂量来克服。因此这两种新方法似乎对过敏性鼻结膜炎的免疫治疗都是有前景的，但对于治疗严重形式的过敏性哮喘(其中肺中的延迟副作用的诱导可能是非常有问题的)可能具有局限性。为了使用并因此激发针对肽、多肽和蛋白的有效免疫反应，通常使用佐剂和/或载体。例如，完全氟氏佐剂，是一种可获得的最有力的佐剂。但是，由于其副作用，不允许用于人类。因此，需要能够诱导针对肽和多肽(源自变应原，当然，和其他抗原)的强烈免疫反应的疫苗组合物，以避免使用完全氟氏佐剂。而且，虽然在一个动物模型中已成功使用BSA作为载体，它可能不适宜用于人类疫苗组合物，因为具有有害反应的风险，例如传播朊病毒病(变异型克雅氏病，(variantCreutzfeldt-Jakobdisease))的风险。发展有效的针对变应原疫苗的一个进一歩挑战是需要能够迅速降低个体或动物中变应原的免疫反应。因此，需要血液中高浓度的变应原特异性抗体(主要是IgG亚型)。在粘膜表面IgA抗体是主要的亚型。霍乱毒素(一个现有技术中已知的载体蛋白)，通常也用作佐剂，减少疫苗组合物中完全氟氏佐剂的需要。但是，霍乱毒素增加总的和特异性的IgE抗体水平，并引起IgE相关的炎性反应。由于大多数用于疫苗的载体蛋白所激发的副作用，需要能够刺激针对变应原或其他抗原免疫反应的载体系统，而不使用毒性佐剂，不使用较差耐受的载体蛋白，并且，在一些情况下，不刺激潜在的致病性免疫反应。满足这些特性的新型载体系统可被用于形成适合于治疗或预防疾病(例如过敏性疾病)的新型佐剂和组合物。BohleB.等人(J.Immunol.172(11)(2004):6642-6648)描述了一种包含S-层蛋白(S-layerprotein)半体和Betv1半体的重组融合蛋白。这个分子包含天然的高变应原性Betvl蛋白。WO2004/004761涉及融合至免疫原的病毒样颗粒，可用于免疫。在WO2004/003143中揭示了一种融合蛋白(包含病毒样颗粒和高变应原性分子)作为免疫原用于接种疫苗的用途。本发明的目标是提供可以克服前述缺陷并允许具有减少的副作用的变应原疫苗的药物和载体。因此，本发明涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或^口口o为了激发针对分子，特别是本发明所述的低变应原性分子的加强的免疫反应，所述分子被融合至(通过遗传工程)或结合至(通过化学反应)载体。常规和通常使用的载体为例如KLH(钥孔戚血蓝素，keyholelimpethemocyanin)。KLH(分离自巨大海洋软体动物Megathuracrenulata)是最常见的用于产生用来注射的免疫原的载体蛋白之一。由于具有高质量并且为非哺乳动物蛋白，KLH诱导强烈的抗体反应。融合至或结合至本发明的低变应原性分子的另一个蛋白("载体"或"载体蛋白")是非源自变应原的("非变应原性")。但是，当向动物或人体使用时，本发明中所用的载体蛋白可表现出T细胞反应活性，和Z或激发针对其自身以及与其融合或结合的低变应原性分子的免疫反应。因此，如果载体蛋白源自病原体(例如病毒，细菌等)，则产生针对所述抗体和病原体的(保护性)抗体。如这里所用的"低变应原性蛋白"意思是非变应原性来源的载体与低变应原性分子的融合蛋白/多肽。而且，"低变应原性蛋白"也指载体与低变应原性分子的结合产物(例如，化学偶联，吸附)。如这里所用的"低变应原性"是指具有减少的变应原性潜力的分子。这样的分子与野生型蛋白(即这些分子所源自的蛋白)相比，在个体中具有降低的激发过敏性反应的能力。优选地，至少一个源自变应原的并与另一个蛋白融合/结合的低变应原性分子为C-和/或N-末端截尾。如这里所用的"C-和域N-末端截尾"意思是来自野生型变应原的N-末端或C末端-或N-和C-末端的氨基酸残基通过删除至少1、2、3、4、5、7、10、15、20、30个氨基酸残基被除去。低变应原性分子，即肽/多肽，优选为包含10至50个氨基酸，更优选为15至40个氨基酸，特别地，20-30个氨基酸，并且表现出减少的IgE反应活性。将这些分子设计为不包含T细胞表位(其可能引起T细胞介导的副作用)。T细胞表位和表现出减少的T细胞反应的分子可通过本领域技术人员已知的方法确定和鉴别(例如，BercoviciN.等人ClinDiagnLabImmunol.(2000)7:859-864)。发现可能使用表面暴露肽来设计源自变应原(如主要草花粉变应原例如PWpl和主要桦树花粉变应原，Betvl)的肽疫苗。获得的数据表明可针对任何变应原(根据IgE表位制图，三维结构数据或电脑辅助的表面暴露结构域预测，这些变应原的主要结构是己知的)来生产这些肽疫苗。但是，选择可用于疫苗的合适的肽仍然是关键的，因为不是所有的经过这些方法鉴定的肽都可用于疫苗。适合于疫苗目的的肽需要表现出减少的IgE结合能力，以及为了减少或避免延迟的副作用而需要表现出减少的T细胞反应活性。如这里所用的术语"源自变应原"意思是根据本发明所述的低变应原性分子通过裂解或截断从变应原直接获得。优选地，本发明的低变应原性分子的氨基酸序列与野生型变应原(这些低变应原性分子所源自的)的氨基酸序列的一段(stretch)至少80%是同源的，更优选为至少90%同源，最优选为至少95%同源，特别地为100%同源。但是，不与野生型变应原片段100%同源的分子需要能够以至少60%，优选为至少70%，更优选为至少80%，最优选为至少90%的能力结合至抗体(antibody)或抗体(antibodies),优选为针对所述野生型变应原片段的IgG抗体。一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列的同源度可通过使用一定的算法直接对比两个氨基酸序列来确定。这样的算法为例如，嵌合在各种计算机程序中(例如"BLAST2SEQUENCES(blastp)"(Tatusova等人.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-25;CorpetF,Nucl.AcidsRes.(1988)16:10881-10890)。根据本发明所述的截尾分子可被定义为完全变应原的一部分，其比完全野生型变应原引起较少的变应原特异性T细胞激活(优选为至少30%，更优选为至少50%，最优选至少70%的减少)，表现出减少超过50%的变应原性活性(优选为超过70%，按照IgE结合测试所估计)和诱导IgE介导的细胞激活的能力，并且当与所描述的载体偶联时，诱导产生IgG抗体，该IgG抗体抑制来自过敏性病人的多克隆IgE与完全野生型变应原的结合。该肽应该含有来自变应原的序列以避免与模拟位(mimotope)的重叠。但是，模拟位(抗原碎片的小的肽模拟物，小于15个氨基酸，从随机肽文库中获得)不代表如此处所定义的原始的、源自变应原的分子。根据本发明不能使用它们，因为它们太小以致于不能诱导强有力的阻断IgG反应。根据本发明所述的低变应原性分子可通过重组方法或化学合成来获得。或者，当然也可能通过酶法或化学切割野生型变应原或容纳(harbour)感兴趣分子的多肽/蛋白来获得。优选地，低变应原性分子可包含至少两个截尾的变应原分子(源自至少一个变应原)，其中，如果该至少两个分子源自相同变应原的话，截尾的变应原片段的顺序与野生型变应原中片段的顺序不同。根据本发明所述的低变应原性分子可包含一个或一个以上(优选为至少2个，更优选为至少3个)如此处所定义的低变应原性分子，因此，形成融合蛋白。该融合蛋白中的单个低变应原性分子(当然也缺少IgE结合能力并缺少T细胞表位)，可源自相同和/或不同来源的变应原。如果分子源自相同的变应原，低变应原性融合蛋白中的顺序应与野生型变应原中的顺序不同(这防止了IgE结合位点的还原和形成)(参见例如WO2004/065414,LinhartB和ValentaR(IntArchAllergyImmunol.(2004)134:324-31))。根据本发明的一个优选具体实施方式，至少一个低变应原性分子融合至所述至少一个另一个蛋白或其片段的N-末端和/或C-末端。变应原或其片段可通过化学或重组方法与彼此结合。如果变应原或其片段与载体以化学方式结合，应该给所述变应原或其片段提供一个末端半胱氨酸残基(形成一个自由巯基基团)。任何马来酰亚胺激活的载体蛋白可结合至所述末端(N-或C-末端)半胱氨酸残基，因此产生一个免疫原/载体复合物。如果变应原或其片段在末端没有巯基基团，可应用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)化学以把胺(赖氨酸)或羧基酸(谷氨酸、天冬氨酸或5'-磷酸盐)结合至载体蛋白。如果低变应原性分子融合至载体的N-或C-末端，则使用重组方法。根据本发明的一个优选具体实施方式，至少一个另一个蛋白为病毒，特别是RNA或DNA病毒，细菌、真菌或原生动物蛋白。至少一个另一个蛋白("载体")可以是任何以上提及的来源。但是，特别优选为使用激发免疫反应的蛋白，所述免疫反应为针对该蛋白本身及低变应原性分子所融合或结合的。由于也针对至少一个另一个蛋白的(保护性)抗体形成的诱导，根据本发明所述的低变应原性蛋白可也可用作针对所述另一个蛋白和其发生起源(例如病毒、细菌、真菌)的疫苗。当然，也可能使用本领域熟知的载体蛋白(例如KLH)作为至少一个另一个蛋白。根据本发明所述的病毒蛋白优选为衣壳蛋白。病毒衣壳蛋白是特别合适的，因为它们诱导抗病毒活性，激发抗体(阻断病毒例如鼻病毒吸附至内皮细胞)的形成，表现出针对Thl反应的免疫调节活性，增加肽的免疫原性(例如，较高的抗-肽，由此较高水平的保护性IgG抗体)，是被证实适合于预防性疫苗(病毒疫苗)，并且是安全的(当衣壳蛋白用于持续暴露的人(例如鼻病毒)时)。根据本发明的另一个优选具体实施方式，至少一个病毒衣壳蛋白源自人类致病性病毒，优选为微小核糖核酸病毒科家族的病毒。微小核糖核酸病毒科家族的病毒优选为鼻病毒属，优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。衣壳蛋白可以是VP1、VP2、VP3禾Q/或VP4。融合至病毒衣壳蛋白的变应原优选为选自主要桦树花粉变应原(特别是Betvl禾口Betv4)、主要牧草花粉变应原(特别是Phlpl、Phlp2、Phlp5、Phip6和Phlp7)、主要屋尘螨变应原(特别是Derp1和Derp2)、主要猫变应原Feldl、主要蜜蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白(特别是Phlp12)或储藏室尘螨变应原(特别是Lepd2)。其他根据本发明所用的合适变应原可源自下表。种名变应原名生化.ID或lll名分了-量cDNA(C)或ig白(p)参考文献，登录S-脉^(Ambrosiaartemisiifolia)矮脉#-(shortragweed)Amba1Amba2Amba3Amba5Amba6Amba7三裂叶豚草(Ambrosiatrifida)巨大豚草(giantragweed)Ambt5三裂叶豚草(Artemisiavulgaris)艾iij(mugwort)Artv1Artv2Artv3脂肪转移蛋白Artv4前纤维蚩EU向E-l葵(Helianthusannuus)太阳花(sunflower)Hela1Hda2前纤维蛋白一年生山靛(Mercurialisannua)Meral前纤维蛋白抗原E抗原KRa3Ra5Ra6Ra7Ra5G83810124.427-293512143415.714-15CCCCCPCPPC8,208,212211,2324,25269,10,272828A532929AY15210YI3271石竹目(Cary叩hyllales)藜(Chenopodiumalbum)lamb's-quarters,藜(pigweed),Chea1白苋菜(whitegoosefoot)Chea2前纤维级白Chea3polcalcin钾猪毛莱(Salsolakali)Russian-thistleSalkl17141043CCAY049012,29BAY082337AY08233829C13Rosales蓰草(Humulusjaponicus)蓰草(Japanesehop)Humj4w欧蓍草(Parietariajudaica)Parjl脂肪转移蛋白1Parj2脂肪转移3i白2Parj3前纤维蛋E白药用墙草(Parietariaofficinalis)Parol脂肪转移蛋CJCAY33518715C参见变应原异构休列表C参见变应原异构休列表C参见变应原异构体列表1529DB.草Poales中国狗牙根(Cynodondactylon)狗牙根(bermudagrass)Cynd1Cynd7Cynd12前纤维蛋白Cynd15Cynd22w烯醇酶Cynd23CyncM4Cynd24发病机理相关性蛋白鸭茅(Dactylisglomerata)果园草(orchardgrass)Dacg1AgDglDacg2Dacg3Dacg5羊茅属未草(Festucapratensis)牛尾草(meadowfescue)Fesp4w绒毛草(Holcuslanatus)天鵝絨草(velvetgrass)HoiI1黑麦草(loliumperemie)黑麦草(ryegrass)Lolp1第I组Lolp2第II组Lolp3第III组数据未定3214992132113160CCcccppccp30,S8334331,X9125631a，Y08390AF517686AF517685未定3233,S4535433A,U2534334271111CPPZ2708435,3637.37A,X7336338Lolp5LolpIX，LolplbLolp11hom:胰岛素抑制剂球基草戸(Phalarisaquatica)金黄草(CanaryGrass)Phaa1猫尾草(Phleumpratense)牧草Phip1Phip2Phlp4Phip5Ag25Phlp6Phip11胰岛素抑制剂hom.Phip12前纤维蛋"Phip13多聚半乳糖醛酸酶草地早熟未(Poapratensis)草地早熟未(Kentuckybluegrass)Poapl第I组Poap5假i力i梁(Sorghumhalepense)蒋森草(Johnsongrass)Sorh131/3516C34，3939AC40,S8065427322055-60CCPCCCCCX78813X75925,4141A42Z27082,43AF521563,43AX77583,44AJ2388483331/34PC4634,4748C.树木Arecales海譽(Phoenixdactylifera)海冬-(datepalm)Phod2前纤维蛋白14.3CAsturiasp.c.普通赤杨(Al腿gluti膨a)桤木Alng117CS50892白桦(Betulaverrucosa)枠树Betv117C参见变应原异构体列表Betv2前纤维蛋白15CM65179Betv3CX79267Betv48CX87153,S54819Betv6h:异黄酮还原酶33.5C参见变应原异构体列表Betv7亲环素18PP81531欧洲鹅耳枥(Carpinusbetuhis)铁树(Hornbeam)Carb1纽西兰生鲜栗子(Castaneasativa)栗子17参见变应原异构体列表Cass;122P52Cass;5几丁质酶Cass;8脂肪转移蛋山9.7P53欧洲榛子(C017lusavellana)檢子Cor￡t117C参见变应原异构Co"12前纤维蛋白14cCo"iS脂肪转移蛋白9cCo"t9US球蛋白样蛋tJ40/cBeyerp.c.Corfiio鲁米诺结合蛋G70cAJ295617Co"ni7S豌豆球蛋G样齿白48cAF441864美洲白橡木(QuercusAlba)白橡木Que:a117p54唇形目(Lamiales)木犀科(Oleaceae)欧洲白蜡树(FraxinusExcelsior)卑树Frae20p58A，AF526295普通女贞(Ligustrumvulgare)女贞Lig、'120p58A油橄榄(Oleae!uropea)橄榄树Ole《16c59,60Ole<:2前纤维蛋白15-18c60AOle(:39.260BOle':432pP80741Ole':5过氧化物歧化酶16pP80740Ole':610c60C,U86342Ole(p60D，P81430Ole(:8012+结合蛋白21c60E,AF078679Ole';9卩-l,3-葡聚糖酶46cAF249675Olei510糖基水解酶hom.11c60F，AY082335欧洲丁香(Syringavulgaris)丁香Syr，"120p58A车前禾斗(Plantaginaceae)Plall18PP842242Pinales卩]本柳杉(Cryptomeriajaponica)R本雪松Cryj1Cryj2C叩ressusarisonica柏科树CupaI意大禾U柏(Cupressussempervirens)线杉(CommonCypress)Cups1Cups3w氺h松(Juniperusashei)mounteinccckrJuna1Juna2Juna3杜松木(Juniperusoxycedrus)pricklyjuniperJuno4hom:钙调蛋lj(calmodulin)JuniperussabinoidesmountaincedarJuns1铅笔柏(Juniperusvirginiana)easternredcedarJunv14M5CC55,5657,D2977243A124357043C34C参见变应原异构体列表参考文献未定4330PCPP8129457A,AJ40465357B,P8129529C57C,AF03147150P5843PP81825,58B悬铃木科(platanaceae)二球悬铃木法国梧桐(Londonplanetree)Plaal18PP82817Plaa243PP82967Plaa3脂肪转移蛋白10PIrisp.c.17D.螨虫粗脚粉螨(Acarussiro)节肢动物螨虫Acas13脂肪酸结合蛋白14*CAJ006774热带剥爪螨(Blomiatropicalis)螨虫Blotl半胱氨酸蛋D酶39CAF277840Blot3胰岛素24*CCheongp.c.Blot4cc淀粉酶56CCheongp.c.Blot5cU59102Blot6肤凝乳蛋fl酶25cCheongp.c.Blot10原肌球蛋白33c61BlotII副肌球蛋白110cAF525465,61ABlot2BtllacU27479Blotl3Bt6,脂肪酸结合蛋白cU58106Blot19抗微生物肽hom.7.2cCheongp.c.粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)美洲l屋尘螨(Americanhousedustmite)Derfl半胱氨酸蛋白酶25c69Derf214c70,70A,参见变应原异构体列表Derf3胰岛素30c63Derf724-31cSW:Q26456，71DerflO原肌球蛋山c72Derfl1副肌球蛋白98c72ADerfl4mag3,家蚕体液低分子近白(apolipophorin)cD17686Derfl598k几丁质酶98cAF178772Derfl6小鼠凝溶胶蛋白(gelsolin)/villin53c71ADerfl7Ca结合EF蛋白53c71ADerfl8w60k几丁质酶60cWeberp.c.微角尘螨(Dermatophagoidesmicroceras)屋尘螨(housedustmite)Derml半胱氨酸蛋白酶25p68屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)欧洲屋尘螨(Europeanhousedustmite)Derpl抗原PI,半胱氨酸蛋白酶25c62,参见变应原异构体列表Derp214c62A-C,参见变应原异构体列表Derp3胰岛素28/30c63Derp4淀粉酶60p64Derp514c65Derp6胰凝乳蛋白酶Derp7Derp8谷胱甘肽转移酶Derp9溶胶原丝氨酸蛋白Derp10原肌球蛋白DerpU家蚕体液低分子蛋白样蛋lj梅氏嗜霉螨(Euroglyphusmaynei)螨虫Eurm2Eurm14家蚕体液低分子蛋白家食甜螨(Glycyphagusdomesticus)储藏室尘螨(storagemite)Glyd2害嗜喊螨(Lepidoglyphusdestructor)储藏室尘螨(storagemite)Lepd2Lepd1Lepd5Lepd7Lepd10原肌球蛋白Lepd13腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)储藏室尘螨(storagemite)Tyrp2E.动物Bosdomesticus家牛(domesticcattle)Bosd2Ag3,lipocalin2522/28361771520PCcpcccccc666767A67BY14906Eptonp.c.参见变应原异构体列表AF14982772B，参见变应原异构体列表73,74,74A,参见变应原异构体列表75,AJ25027875,AJ27105875A，AJ25009675,AJ25027975B,Y1269076,参见变应原异构体列表(同时参见食物)Bosd3Ca-结合SI00hom.11CL39834Bosd4a-乳白蛋白14.2CMl8780Bosd5P-乳球蛋白18.3cX14712Bosd6血清白蛋白67cM73993Bosd7免疫球蛋白16077Bosd8酪蛋白20-3077家犬(Canisfamiliaris)(Canisdomesticus)Canf125c78，79<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>Alta128CU82633Alta225C83A,U62442Alta3热击蛋白.70CU87807,U87808Alta4蛋Q二硫键异构離57CX84217Alta6酸性核糖体蛋白P211CX78222,U87806Alta7YCP4蛋白22CX78225AltaIO醛脱氢酶53CX78227,P42041Alta1烯醇酶45CU82437Alta2酸性核糖体蛋白PI11CX84216单本枝抱(Ciadosporium'nerbarum)Clah11383B,83CClah22383B,83CClah3醛脱氢酶53CX78228Clah4酸性核糖体蛋白P211CX78223Clah5YCP4蛋tl22CX78224Clah6烯醇,46CX78226Clah2酸性核糖体蛋白PInCX851801.2散囊菌目(Eurotiales)黄曲霉(Aspergillusflavus)Aspfl13碱性丝氨酸蛋白酶3484烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Aspfl18CM83781,S39330Aspf237CU56938Aspf3过氧物酶体蛋白19CU20722Aspf430CA腦1732Aspf5金属迈白40CZ30424Aspf6锰过氧化物歧化酶26.5CU53561Aspf712CAJ223315Aspf8核糖体蛋白P211CAJ224333Aspf934CAJ223327AspflO天冬氨酸蛋白酶34CX85092Aspfll肽基脯氨酰异构酶2484AAspfl2热击蛋白P9090c85Aspf13碱性丝氨酸蛋白蜜3484BAspfl516cAJ002026Aspf1643cg3643813Aspf17cAJ224865Aspfl8气泡丝氨酸蛋白酶3484CAspf22w烯醇酶46cAF284645Aspf23L3核糖体蛋白44c85A,AF464911黑曲蒋(Aspergillusniger)Aspn14|3-木糖苷酶Aspn18气泡丝氨酸蛋白酶Aspn253-肌醉六磷酸酶BAspn米曲霜(Aspergillusoryzae)Aspo13碱性丝氨酸酶Aspo21TAKA-淀粉酶A短密青萄:菌(Penicilliumbrevicompactum)Penbl3碱性丝氨酸離产贞青蒋(Penicilliumchrysogenum)(旧称点青霉(P.notatum))Pench13碱性丝氨酸l每Pench18气泡丝氨酸蛋白酶Pench20N-乙酰-e-葡糖胺酶枯青導(Penicilliumcitrinum)Penc3过氧化物酶体膜蛋白Penc13碱性丝氨酸酶Penc19热击蛋GP70Penc22w烯醇離Penc24延长因子ip草酸青踪(Penicilliumoxalicum)Penol8气泡丝氨酸蛋白酶105C34C66-100C85C3453333432681833704634CCCccAF10894484B85B，P34754Z84377X17561D00434,M3321886A878787A86B86AU64207AF254643AY36391I87B1.3肉座菌目(Hypocreales)黄色镰孢(Fusariumculmorum)Fusel核糖体蛋白P2Fusc2硫氧还蛋白样蛋白1"13*CCAY077706AY0777071.4爪甲团囊菌(Onygenales)红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)Trir2Trir4丝氨酸蛋白酶断发毛癣菌(Trichophytontonsurans)Trit1Trit4丝氨酸蛋白酶C88C8830P88A83C88说明1.5酉孝母目(Saccharomycetales)tl色念珠菌(Candidaalbicans)Canda1Canda3过氧化物酶体蛋山甲醇酵母(Candidaboidinii)Candb2402920CC89AY136739J04984,J049852.ftl子菌亚.门(Basidiomycotina)2.1层菌纲(Hymenomycetes)古巴裸盖菇(Psilocybecubensis)PsicIPsic2亲环素毛头鬼伞(Coprinuscomatus)shaggycapCopcl亮氨酸拉链蛋白Copc2Copc3Copc5Copc7161189AAJ132235A.I242791AJ242792AJ242793AJ2427942.2锈菌纲(Urediniomycetes)粘质红酵母(Rhodotorulanuicilaginosa)Rhoml烯醇酶Rhom2气泡丝氨酸蛋白酶4731CC89BAY5472852.3黑粉菌纲(Ustilaginomycetes)MalasseziafurfurMalaf2MFl.过争t化物酶体膜蛋白21ABO11804,90Malaf3MF2，过氧化物酶体膜蛋白20ABO11805,90Malaf4线粒体苹果酸盐脱氢酶马拉色菌(Malasseziasympodialis)Malas1Malas5Malas6Malas73518*17*CCCCAF084828,90AX96486,91AJ011955AJ011956AJ0U957,91A23Malas8Malas9Malas10热击蛋白70Malasll锰过氧化物歧化酶.3.半知菌亚门(Deuteromycotina)3.1瘤座菌目(Tuberculariales)紫附谅菌(Epicoccumpurpurascens)(1H私(E.nigrum)Epipl丝氨酸蛋白酶19*37*8623CCccAJ011958，91AAJ011959,91AAJ428052AJ54842130SW:P83340,91BG.昆虫埃及斑蚊(Aedesaegyptii)蚊子Aeda1三磷酸腺苷双磷酸酶68CL12389Aeda237CM33157西方蜜蜂(Apismellifera)蜜蜂Apim1磷脂,A216c92Apim2透明质酸酶44c93Apim4蜂毒肽c94Apim67-8pKettnerp.cApim7CUB丝氣酸近白R39cAY127579熊蜂(Bombuspennsylvanicus)大黄蜂bumblebeeBomp1磷脂酶16p95Bomp4蛋白酶p95德国小蠊(Blattellagermanica)德国小蠊(Germancockroach)Blag1Bd90kcBlag2天冬蛋白酶36c96Blag4卡里碱(calycin)21c97Blag5谷胱甘肽转移酶22c98Blag6肌钙蛋白C27c98美洲l大蠊(Periplanetaamericana)美洲l大蠊(Americancockroach)Pera1Cr-PHcPera3Cr-PI72-78c98APera7原肌球蛋白37cY14854花翅摇蚊(Chironomuskiiensis)蚊Chik0原肌球蛋白32.5*CAJ012184拟背摇蚊(Chironomusthummithummi)蚊Chit1-9血色素16C99Chit1.01成分1116cP02229Chit1.02成分IV16cP02230Chit2.0101成分I16cP02221Chit2.0102成分A6cP02221Chit3成分II-beta16cP02222Chi14成分ITIA16cP02231Chit5成分VI16cP02224Chit6.01成分VIIA16cP02226Chit6.02成分IX16cP02223Chit7成分VIIB16cP02225Chit8成分VIII16cP02227Chit9成分X16cP02228猫蚤(Ctenocephalidesfelisfelis)猫蚤Ctef1Qef2Mlb27cAF231352Ctef325c松异带蛾(Thaumetopoeapityocampa)ftt异^".l我(pineprocessionarymoth)Thap115pPIR:A59396,衣鱼(Lepismasaccharina)蠹虫(silverfish)Lepsl原肌球蛋白36cAJ309202大黄蜂(Dolichovespulamaculata)白面大黄蜂(whitefacehornet)Dolml磷脂酶AI35c100Dolm2透明质酸酶44c101Dolm5抗原523c102,103黄蜂(Dolichovespulaarenaria)黄蜂(yellowhornet)Dola5抗原523c104Polistesannularies黄蜂Pola1磷脂酶Al35p105Pola2透明质酸酶44p105Pola5抗原523c104胡蜂(Polistesdominulus)地中海纸黄蜂(Mediterraneanpaperwasp)Pold1Pold4丝氨酸蛋白酶Pold5纟氏质黄蜂(Polistesexclamans)黄蜂Polel磷脂酶A1Pole5抗原5马蜂(Polistesfuscatus)與蛑Polf5抗原5柞蚕马蜂(Polistesgallicus)黄蜂Polg5抗原5黄蜂(Polistesmetricus)黄蜂Polm5抗原5黄边胡蜂(Vespacrabo)欧洲蜜蜂(Europeanhoney)Vespcl磷脂酶Vespc5抗原5黑胡蜂(Vespamandariria)雀锋(giantasianhornet)VespmjVespni5Vespulaflavopilosa32-3434233423PC23C24C23CPCHoffmanp.iHoffmanp.iP81656107104106P83377106107106Hoffmanp.iP81657黄蜂Vesf5抗原523C106德国黄胡蜂(Vespulagermanica)黄蜂Vesg5抗原523C106Vespulamaculifrons黄蜂Vesm1ffl旨酶Al33.5c108Vesm2透明质酸酶44p109Vesm5抗原523c104Vespulapermsylvanica黄蜂Vesp5抗原523c106Vespulasquamosa黄蜂Vess5抗原523c106Vespulavidua黄蜂Vesvi5抗原523c106黄胡蜂(Vespulavulgaris)黄蜂Vesv1磷脂酶Al35C105AVesv2透明质酸酶Vesv5抗原5Myrmeciapilosula澳洲跳蚁(Australianjumperant)Myrp1Myrp2火虫义(Soknopsisgeminata)热带红火蚁(tropicalfireant)Solg2Solg4红火蚁(Solenopsisinvicta)火虫义(Solenopsissaevissima)巴西火蚁(Brazilianfireant)Sols2Triatomaprotracta力口州吸血虫(Californiakissingbug)Triap1Procalin4423PCCc105A104X70256S81785Hoffm肌p.'Hoffmanp.i火蚊Sol:i213C110,111Solii324C110Soli413C11020CHoffmanp.c.AF179004.111A.H.食物鳕鱼Gadc1变应原M大西洋鲑亚特兰大鲑鱼(Atlanticsalmon)Salsi小清蛋白BosdomesticusdomesticcattleBosd4a乳白蛋白(牛奶)Bosd5P-乳球蛋白同时参见动物Bosd6血清白蛋白Bosd7免疫球蛋白Bosd8酪蛋白鲤鱼(Cyprinuscarpio)(普通鲤鱼(Commoncarp))Cypcl小清蛋白家鸡(Gallusdomesticus)鸡Galdl卵类粘蛋白121214.218.36716020-301228CC112,113X97824Ml8780X147I2M739937777129114,11527Gald2卵清蛋白44C114,115Gald3Ag22.伴淸蛋白78C114,115Gald4溶解酵素14C114,115Gald5血清"蛋白69CX60688刀额新对虫下(Metapenaeusensis)虾Metel原肌球蛋白CU08008棕虫卩(Penaeusaztecus)!t!卜Penal原肌球蛋白36P116印度对卧(Penaeusindicus)虾Penil原肌球蛋CJ34C116A节对虫下(Penaeusmonodon)黑虎虫下(blacktigershrimp)Penml原肌球蛋白38CPenm2精氨酸激酶40CAF479772-北就((Todarodespacificus)鱿鱼Todpi原肌球蛋白38P117A散大蜗牛(Helixaspersa)散人蜗牛(browngardensnail)Helasl原肌球蛋白南非鲍螺(Haliotismidae)鲍鱼Halm1食用蛙(Ranaesculenta)食用蛙Ranel小清蛋白aRane2小清蛋白卩芥菜(Brassicajuncea)西亚大蒜芥(orientalmustard)Braj12S白蛋白甘蓝型油菜(Brassicanapus)油菜籽Branl2S白蛋白白菜型冬油菜(Brassicarapa)芜箐Brar2hom:prohevein大麦(Hordeumvulgare)大麦Horvl5BMAI-1Horvl6a-淀粉酶Horvl7p-淀粉酶Horv21，3大麦醇溶蛋白364914C15P2515C34CY14855,117B117C11.9*CAJ31595911.7*CAJ414730118118A,P80208P81729119U9A，SW:P80198黑麦(Secalecereale)黑麦Secc20黑麦精小麦(Triticumaestivum)小麦Trial8凝集素Trial9w-5麸朊玉米(Zeamays)玉米(maise),玉米(corn)Zeam14脂肪转移蛋白.水稻(Oryzasativa.)水稻Orys17f菜籽(Aphimgraveolens)片菜Apig1hom:Betv1Apig4前纤维蛋白Apig5胡萝卜(Daucuscarota)胡萝卜Dauc1hom:Betv1Dauc4前纤维蛋白欧洲榛子(Corylusavellana)榛实Cora1.04hom:Betv1Cora2前纤维蛋白Cora8脂肪转移蛋白苹果(Malusdomestica)苹果Maid1hom:Betv1Mald2hom:植物甜蛋白(thaumatin)Mald3脂肪转移蛋白Maid4前纤维蛋白梨(Pyruscommunis)梨Pyre1hom:Betv1Pyrc4前纤维蛋白Pyre5hom:异黄酮还原酶油梨(Perseaamericana)鳄梨Persal内几丁质酶杏(Prunusarmeniaca)杏Pruar1hom:Betv1Pruar3脂肪转移蛋白6516*55/581617149914.4*181433.532Cccccccccccp参见变应原异构休列表PIR:A59156PI9656119B,U3177IZ48967AF29423P819431HD，参见变应原异构体列表AF456482参见变应原异构体列表AF327622AF329829参见变应原异构休列表AJ243427Pastorellop.c.参见变应原异构体列表AF05730AF129424AF071477Z78202U93165甜樱桃(Prunusavium)甜樱桃Pruav1hom:Betv1Pruav2hom:植物甜蛋白Pruav3脂肪转移蛋白Pruav4前纤维蛋白欧辨l李(Pru簡domestica)欧洲李Prud3脂肪转移蛋白桃(Prunuspersica)杉fePrup3脂肪转移蛋白Prup4前纤维蛋白绿戸努(Asparagusofficinalis)芦笋Aspao1脂肪转移蛋白藏红花(Crocussativus)藏红花Cros1离苣(Lactucasativa)莴苣Lacsl脂肪转移蛋白葡萄(Vitisvinifera)葡萄Vitvl脂肪转移蛋白香蕉(Musaxparadisiaca)香蕉Musxpl前纤维蛋fi菠萝(Ananascomosus)菠萝Anacl前纤维蛋白Anac2bromelain柠檬(Citruslimon)柠檬Citl3脂肪转移蛋白甜橙(Citrussinensis)甜橙Cits1germin样蛋白Cits2前纤维蛋白Cits3脂肪转移蛋白惹枝(Litchichinensis)荔枝Lite]前纤维蛋白白芥(Sinapisalba)黄芥Sinai2S白蛋白10151522.8*231491514CCCC9P10P14C9P2115CCCU66076U32440AF221501AF129425119CP81402参见变应原异构体列表119DVarastehA-Rp.'Viethsp.'P80274AF377948AF377949119E-G,D14059Torrejonp.c.Torrejonp.c.Torrejonp.c.Torrejonp.c.AY049013120大豆(Glycine腿x)大豆Glym1HPS7P120AGlym28PA57106Glym3前纤维蛋白14C参见变应原异构体列Glym4(SAM22)PR-1017C細043，120B绿豆(Vignaradiata)绿豆VigrlPR-10蛋白15CAY792956花生(Arachishypogaea)花生Arahl豌豆球蛋白63.5cL34402Arah2conglutin17cL77197Arah3火豆球蛋白60cAF093541Arah4大豆球蛋白37cAF086821Arah5前纤维蛋白15cAF059616Arah6hom:羽扇豆球蛋白(conglutin)15cAF092846Arah7hom:羽扇豆球蛋白15cAF091737Arah8PR-10蛋白J7cAY328088兵豆(Lensculinaris)小扁豆Lenc1豌豆球蛋白47c参见变应原异构体列:Lenc2种子生物素化蛋白.66p120C豌豆(Pis咖savitum)豌豆Piss1豌豆球蛋白44c参见变应原异构体列:Piss2convicilin63c未决中华顿;猴桃(Actinidiachinensis)几维Actcl半胱氨酸蛋白酶30pP00785Actc2植物甜蛋白样蛋白24pSW:P81370,121菜椒(Capsicumannu隨)甜椒(bellpepper)Capalw逆渗透蛋白(osmotin)样蛋tl23cAJ297410Capa2前纤维蛋白14cAJ417552番恭(Lycopersiconesculentum)番茄Lycel前纤维蛋白14cAJ417553Lyce2b-呋喃果糖苷酶50c参见变应原异构体列:Lyce3脂肪转移蛋白6cU81996马铃薯(Solatiumtuberosum)马铃薯Solatl马铃薯块茎特异蛋白(patatin)43pPI5476Solat2组织蛋白酶D抑制剂21pP16348Solat3半胱氨酸蛋白酶抑制剂21pP20347Sola14天冬蛋白酶抑制剂16+4pP30941巴西坚果(Bertholletiaexcelsa)巴西坚果(Brzailnut)Bere12S白蛋白Bere211S球蛋白种T贮存蛋白东部黑核桃(Juglansnigra)山核桃(blackwalnut)Jugnl2S白蛋白Jugn2豌豆球蛋白样蛋白核桃(Juglansregia)英国核杉fe(Englishwalnut)Jugrl2S白蛋l二Jugr2豌豆球蛋白Jugr3脂肪转移蛋白)!要果(Anacardi腦occidentale)腰果Anao1豌豆球蛋白样蛋白Anao2豆球蛋G样蛋白Anao32S白蛋白—度麻(Ricinuscommunis)齒麻子92919*56*449505514CC.CCCCPCCcP04403,M17146AY22I641AY102930AY102931U66866AF066055Pastorello参见变应原异构体列表AF453947AY081853Rice12S白蛋白CPO画芝麻(Sesamuraindic鹏)芝麻Sesi12S白蛋白9C121A,AF240005Sesi22S白蛋白CAF091841Sesi37S豌豆球蛋白样蛋白45CAF240006Sesi4油质蛋白(Oleosin)17CAAG23840Sesi5油质蛋白15CAAD42942厚皮甜瓜(Cucumismelo)香瓜Cueml丝氨酸蛋白酶66CD32206Cucm2前纤维蛋白14CAY271295Cucm3发病机理相关性蛋白PR-l16*PP83834I.其他的海兽胃线虫(Anisakissimplex)线虫Anis124P12IB,A59069Anis2副肌球蛋白97CAF173004Anis3原肌球蛋白41C121C,Y19221Anis49PP83885翘缘锐缘蟀(Argasreflexus)壁虱(pigeontick)Argr117CAJ697694猪蛔虫(Ascarissuum)蠕虫Ascs110P122番木瓜(Caricapapaya)木瓜Carp3w木瓜蛋白酶23.4*C122A,Ml5203软珊瑚(Dendronephthyanipponica)软珊瑚Denn153P122B巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)橡胶(橡胶)Hevbl延仲因子58P123,124Hevb21，3-葡聚糖酶34/36C125Hevb324P126,127Hevb4microhelix复合物成分跳P128115Hevb516CU42640Hevb6.01橡胶蛋白前体20CM36986,p02877Hevb6.02橡胶蛋白CM36986,p02877Hevb6.03C-末端片段14CM36986,p02877Hevb7.01hom:来自B血清的马铃薯块茎特异蛋白42C画598Hevb7.02hom:来自C血清的马铃薯块茎特异蛋白44CAJ223038Hevb8前纤维蛋白14C参见变应原异构体列表Hevb9烯醇酶51CAJ132580Hevb10锰过氧化物歧化酶26C参见变应原异构体列表Hevb111类几丁质酶C参见变应原异构休列表Hevb12脂肪转移蛋白9.3CAY057860Hevb13酯酶42PP83269智人(Homosapiens)人自身变应原(humanautoallergens)Horns173*CY14314Homs210.3*CX80909Horns320.1*CX89985Homs436*cY177UHoms542.6*cP02538硬白梧桐(Triplochitonscleroxylon)非洲轻木(obeche)Trips11类几丁质酶38.5pKespohlp.c.参考文献IMarsh,D.G.,禾卩L.R.Freidhoff.1992.ALBE,anallergendatabase.IUIS,Baltimore,MD,Edition1.0.2Marsh,D.G.等人1986.Allergennomenclature.BullWHO64:767-770.3King,T.P.等人1964.Biochemistry3:458-468.4Lowenstein,H.1980.Allergy35:188-191.5Aukrust,L.1980.Allergy35:206-207.6Demerec,M.等人1966.Genetics54:61-75.7Bodmer,J.G.等人1991.Immunogenetics33:301-309.8Griffith,I丄等人1991.Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.96:296-304.9Roebber,M.等人1985.J.Immunol.134:3062-3069.10Metzler,W.J.等人1992.Biochemistry31:5117-5127.IIMetzler，W.J.等人1992.Biochemistry31:8697-8705.12Goodfriend,L.等人1979.Fed.Proc.38:1415.13Ekxamoddoullah,A.K.M.等人1982.Mol.Immunol.19:1527-1534.14Ansari，A.A.等人1987.J.AllergyClin.Immunol.80:229-235.15Morgenstern，J.P.等人1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9690-9694.16Griffith,U.等人1992.Gene113:263-268.17Weber,A.等人1986.Biochem.Physiol.83B:321-324.18Weber,A.等人1987.Allergy42:464-470.19Sta画rth,D.R.等人1990.BulletinWHO68:109-111.20Rafnar,T.等人1991.J.Biol.Chem.266:1229-1236.21Rogers,B丄.等人1991.J.Immunol.147:2547-2552.22Klapper,D.G.等人1980.Biochemistry19:5729-5734.23Ghosh,B.等人1993.J.Immunol.150:5391-5399.24Roebber,M.等人1983.J.Immunol.131:706-711.25Lubahn,B.,和D.G.Klapper.1993.J.AllergyClin.Immunol.91:338.26Roebber,M.,和D.G.Marsh.1991.J.AllergyClin.Immunol.87:324.27GoodfriendL.等人MolImmunol22:899-906,1985.28HimlyM.等人FASEBJ17:106-108,2003.28ANilsen,B.M.等人1991.J.Biol.Chem.266:2660-2668.29WopfnerN.等人BiolChem383:1779-1789,2002.29AJimenezA.等人1994.IntArchAllergyImmunol105:297-307.29BBarderasR.等人IntArchAllergyImmunol127:47-54,2002.29CCarn6sJ.等人Allergy56,Supplement68:274,2001.29DGiulianiA.等人Allergy42:434-440,1987.30Smith,P.M.等人1996.J.AllergyClin.Immunol.98:331-343.31Suphioglu,C.等人1997.FEBSLett.402:167-172.31aAsturiasJ,A.等人1997.ClinExpAllergy27:1307-1313.32Mecheri,S.等人1985.AllergyAppl.Immunol.78:283-289.33Roberts,A.M.等人1993.Allergy48:615-623.33aGuerin-Marchand,C.等人1996.Mol.Immunol.33:797-806.34Klysner，S.等人1992.Clin.Exp.Allergy22:491-497.35Perez,M.等人1990.J.Biol.Chem.265:16210-16215.36Griffith,I.J.等人1991.FEBSLetters279:210-215.37Ansari,A.A.等人1989.J.Biol.Chem.264:11181-11185.37aSidoli,A.等人1993.J.Biol.Chem.268:21819-21825.38Ansari,A.A.等人1989.Biochemistry28:8665-8670.39Singh,M.B.等人1991.Proc.Natl.Acad.Sci.88:1384-1388.39avanReeR.等人1995.JAllergyClinImmunol95:970-97840Suphioglu,C.和Singh，M.B.1995.Clin.Exp.Allergy25:853-865.41Dolecek,C.等人1993.FEBSLett.335:299-304.41AFischerS,等人1996.JAllergyClinImmunol98:189-198.42Matthiesen,F.和H.Lowenstein.1991.Clin.Exp.Allergy21:297-307.43Petersen,A.等人1995.Int.Arch.AllergyImmunol.108:55-59.43AMarknellDeWittA.等人ClinExpAllergy32:1329-1340,2002.44Valenta,R.等人1994.Biochem.Biophys.Res.Commun.199:106-118.46Esch,R.E.,禾GD.G.Klapper.1989.Mol.Immunol.26:557-561.4701sen,E.等人1991.J,Immunol.147:205-211.48Avjioglu,A.等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:340.52KosT.等人1993.BiochemBiophysResCommun196:1086-92.53Diaz-PeralesA.等人2000.ClinExpAllergy30:1403-1410.54Ipsen,H.,和O.C.Hansen.1991.Mol.Immunol.28:1279-1288.55Taniai,M.等人1988.FEBSLett.239:329-332.56Griffith,I丄等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:339.57Sakaguchi,M.等人Allergy45:309-312,1990.57AYokoyamaM.等人BiochemBiophysResCommun275:195-202，2000.57BMidoro-HoriutiT.等人Jlmmunol164:2188-2192,2000.57CTinghinoR.等人J,AllergyClin.Immunol.101:772-777,1998.58GrossGN等人ScandJImmunol8:437-441,1978.58AObispoTM等人ClinExpAllergy23:311-316,1993.58BMidoro-HoriutiT.等人ClinExpAllergy31:771-778,2001.59LombarderoM.等人Clin.Exp.Allergy24:765-770,1994.60Villalba,M,等人Eur.J.Biochem.216:863-869,1993.60AAsturiasJA等人JAllergyClinImmunol100:365-372,1997.60BBataneroE.等人EurJBiochem241:772-778,1996.60CBataneroE.等人FEBSLett.410:293-296,1997.60DTejeraML等人JAllergyClinImmunol104:797-802,1999.60ELedesmaA.等人FEBSLett466:192-196,2000.60FBarralP.等人JImmunol172:3644-3651,2004.61YiFC等人ClinExpAllergy32:1203-1210,2002,61ARamosJD等人IntArchAllergyImmunol126:286-293,2001.62Chua,K.Y.等人J.Exp.Med.167:175-182,1988.62AChua,K.Y.等人Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.91:118-123,1990.62BSmithAM等人IntArchAllergyImmunol124:61-63,2001.62CSmithAM等人JAllergyClinImmunol107:977-984,2001.63SmithWA,ThomasWR.IntArchAllergyImmunol109:133-140,1996.64Lake,F.R.等人J.AllergyClin.Immunol.87:1035-1042,1991.65Tovey,E.R.等人J.Exp.Med.170:1457-1462,1989.66Yasueda,H.,T.Shida，T.Ando,S.Sugiyama禾卩H.Yamakawa.1991.AllergenicandproteolyticpropertiesoffourthallergensfromDermatophagoidesmites.In:"DustMiteAllergensandAsthma.Reportofthe2ndinternationalworkshop"A.Todt,Ed.,UCBInstituteofAllergy,Brussels,Belgium,pp,63-64.67Shen,H,D.等人Clin.Exp.Allergy23:934-940,1993.67AO'NeilGM等人BiochimBiophysActa,1219:521-528,1994.67BKingC.等人JAllergyClinImmunol98:739-747,1996.68LindP.等人J.Immunol.140:4256-4262,1988.69Dilworth,R.J.等人Clin.Exp.Allergy21:25-32,1991.70Nishiyama,C.等人Int.Arch.AllergyImmunol.101:159-166,1993.70ATrudinger,M.等人Clin.Exp.Allergy21:33-38,199171ShenHD等人ClinExpAllergy25:1000-1006,1995.71ATategakiA.等人ACIInternationalsuppl.1:74-76,2000.72AkiT.等人JAllergyClinImmunol96:74-83,1995.72ATsaiL等人ClinExpAllergy29:1606-1613,1999.72BGafvelinG.等人JAllergyClinImmunol107:511-518,2001.73vanHage墨Hamsten.等人J.AllergyClin.Immunol.91:353,1993.74VarelaJ.等人EurJBiochem225:93-98,1994.74ASchmidtM.等人FEBSLett370:11-14,1995.75ErikssonTLJ等人Eur.J.Biochem.268:287-294，2001.75ASaarneT.等人IntArchAllergyImmunol130:258-265,2003.75BErikssonTL等人Eur.J.Biochem.251(1-2),443-447，1998.76RautiainenJ,RytkonenM,PelkonenJ,PentikainenJ,PerolaO，VirtanenT,ZeilerT,MantyjarviR.BDA20,amajorbovinedanderallergencharacterisedatthesequencelevelisBosd2.Submitted.77GjesingB,LowensteinH.AnnAllergy53:602,1984.78deGroot,H.等人J.AllergyClin.Immunol.87:1056-1065,1991.79Konieczny,A.Personalcommunication;ImmunologicPharmaceuticalCorp.79ABulone,V.EurJBiochem253:202-211,1998.79BSwiss誦Protacc.P81216,P81217.79CDandeuJ.P.等人(1993)J.Chromatogr.621:23-31.79DGoubranBotrosH.等人1998.J.Chromatogr.B710:57-65.79EHilgerC.等人Allergy52:179-187;禾BHilgerC.等人Gene169:295-296,]996.79FIchikawaK.等人ClinExpAllergy,InPress2001.80FahlbuschB.等人Allergy57:417-422,2002,81McDonald,B.等人1988.J.AllergyClin.Immunol.83:251.81AClarke,A.J.等人1984.EMBOJ3:1045-1052.82Longbottom,J.L.1983.Characterisationofallergensfromtheurinesofexperimentalanimals.McMillanPress,London,pp.525-529.83Laperche,Y.等人1983.Cell32:453-460.83ABushRK等人1999.JAllergyClinImmunol104:665-671.83BAukrustL,BorchSM.1979.IntArchAllergyApplImmunol60:68-79.83CSward-NordmoM.等人1988.IntArchAllergyApplImmunol85:288-294.84Shen,等人J.AllergyClin.Immunol.103:S157,1999.84ACrameriR.EpidemiologyandmolecularbasisoftheinvolvementofAspergillusfumigatusinallergicdiseases.Contrib.Microbiol.Vol.2,Karger，Basel(付梓).84BShen,等人(已投稿),199984CShenHD等人Vacuolarserineproteinase:AmajorallergenofAspergillusfumigatus.10thInternationalCongressofImmunology,Abstract,1998.85KumarA.等人1993.J.AllergyClin.Immunol.91:1024-1030.85ASaxenaS.等人2003.ClinExpImmunol134:86-91.85BBaurX.等人Allergy57:943-945,2002.86AShenHD等人1996.ClinExpAllergy26:444-451.86BShen,等人Abstract;TheXVIIICongressoftheEuropeanAcademyofAllergologyandClinicalImmunology,Brussels,Belgium,3-7My1999.87ShenHD等人ClinExpAllergy29:642-651,1999.87AShenHD等人ClinExpAllergy25:350-356，1995.87BShenHD等人JLabClinMed137:115-124,2001.88WoodfolkJA等人1998.JBiolChem273:29489-96.88ADeudl,B.等人1991.J.Immunol.147:96-101.89Shen,H.D.等人1991.Clin.Exp.Allergy21:675-681.89AHornerWE等人1995.IntArchAllergyImmunol107:298-300.89BChangCY等人JBiomedSci9:645-655,2002.90YasuedaH.等人BiochemBiophysResCommun248:240-244,1998.NB:strainTIMM2782(TeikyoUniversityInstituteforMedicalMycology)equaltostrainCBS1878(CentralBureauvonSchimmelkulturen).90AOnishiY.等人EurJBiochem261:148-154,1999.NB:strainTIMM2782(TeikyoUniversityInstituteforMedicalMycology)equaltostrainCBS1878(CentralBureauvonSchimmelkulturen).91SchmidtM.等人EurJBiochem246:181-185，1997.NB:strainATCCno.42132(AmericanTypeCultureCollection).91ARasoolO.等人EurJBiochem267:4355-4361,2000.NB:strainATCCno.42132(AmericanTypeCultureCollection).91BNB:;strain4625(IndianAgriculturalResearchInstitute,PUSA;NewDelhi,India).92Kuchler,K.等人1989.Eur.J.Biochem.184:249-254.93Gmachl,M.,禾卩G.Kreil.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3569-3573.93AHoffmanDR.1977.JAllergyClin.Immunol.59:364-366.94Habermann,E.1972.Science177:314-322.95HoffmanDR,JacobsonRS.1996.J.AllergyClin.Immunol.97:812-821.95AHoffmanDR,El-ChoufaniAE,SmithMM,deGrootH.2001.Occupationalallergytobumblebeevenom:AllergensofBombusterrestris.JAllergyClinImmunolInpress.95BHelmR.等人1996.JAllergClinImmunol98:172-180.95CPomesA.等人1998.JBiolChem273:30801-30807.96ArrudaLK等人JBiolChem270:19563-19568,1995.97ArrudaLK等人JBiolChem270:31196-31201,1995.98ArrudaLK等人IntArchAllergyImmunol107:295-297,1995.98AWuCH等人1998.JAllergyClinImmunol101:832-840.98BMelenE.等人1999.JAllergyClinImmunol103:859-64.98CWuCH等人JBiolChem271:17937-17943,1996.98DWuCH等人MolecularImmunol34:1-8,1997.98ESantosABR等人1999.JAllergyClinImmunol104:329-337.98FAsturiasJA等人1999.JImmunol162:4342-4348.99Mazur，G.等人1990.Monog.Allergy28:121-137.99AMoneoI.等人Allergy58:34-37,2003.100Soldatova,L.等人1993.FEBSLetters320:145-149.IOILu,G.等人1994.J.AllergyClin.Immunol.93:224.102Fang,K.S.F.等人1988.Proc.Natl.Acad.Sci"USA85:895-899.103King,T.P.等人1990.Prot.Seq.DataAnal.3:263-266.104Lu,G.等人1993.J.Immunol.150:2823-2830.105King,T.P.和Lu,G.1997.数据未发表105AKingTP等人1996.J.AllergyClin.Immunol.98:588-600.106Hoffman,D.R.1993.J.AllergyClin.Immunol.92:707-716.107HoffmanDR.1992.数据未发表108HoffmanDR.J.AllergyClin.Immunol.91:187,1993.109JacobsonRS等人J.AllergyClin.Immunol.89:292,1992.110HoffmanDR.J.AllergyClin.Immunol91:71-78,1993.111SchmidtM.等人FEBSLetters319:138-140，1993.111APaddockCD等人JImmunol167:2694-2699,2001.112ElsayedS,BennichH.ScandJImmunol3:683-686,1974.113ElsayedS.等人Immunochemistry9:647-661,1972.114Hoffman,D.R.1983.J.AllergyClin.Immunol.71:481-486.115Langdand,T.19".Allergy38:4S3-500.116DaulCB,SlatteryM,MorganJE,LehrerSB.1993.Commoncmstaceaallergens:identificationofBcellepitopeswiththeshrimpspecificmonoclonalantibodies.In:"MolecularBiologyandImmunologyofAllergens"(D.KraftandA.Sehon,eds.).CRCPress,BocaRaton,pp.291-293.116AShantiKN等人J,Immunol.151:5354-5363,1993.ii/iuu守乂vJ丄iiuiiuiKU丄/u:4^-3-4:):),zuuj.117AMiyazawaM等人J,AllergyClin.Immunol.98:948-953,1996.117BAsturiasJA等人IntArchAllergyImmunol128:90-96,2002.117CL叩ataAL等人J.AllergyClin.Immunol.100:642-648,1997.117DHoffmann-SommergruberK.等人Clin.Exp.Allergy29:840-847,1999.118MonsalveRI等人Biochem.J.293:625-6321993.118A.MonsalveRI等人1997.ClinExpAllergy27:833-841.119Mena,M.等人PlantMolec.Biol.20:451-458,1992.119APalosuoK.等人J.AllergyClin.Immunol.108:634-638,2001.119BXuH.等人Gene164:255-259,1995.119CPastorelloEA等人J.AllergyClin.Immunol.94:699-707，1994.119DDiaz-PeralesA.等人JAllergyClinImmunol110:790-796,2002.119EGalleguillosF,RodriguezJC.ClinAllergy8:21-24，1978.119FBaurX.ClinAllergy9:451-457,1979.119GGailhoferG.等人ClinAllergy18:445-450,1988.120Menendez-Arias,L.等人1988.Eur.J.Biochem.177:159-166.120AGonzalezR.等人Lancet346:48-49,1995.120BKleine-TebbeJ.等人JAllergyClinImmunol110:797-804,2002.120CSanchez-MongeR.等人J.AllergyClin.Immunol.106:955-961,2000.121Gavrovic-JankulovicM.等人JAllergyClinImmunol110:805-810，2002.121APastorelloEA等人J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.756:85-93,2001.121BMoneoL等人J.AllergyClin.Immunol.106:177-182,2000.121CAsturiasJA等人2000.Allergy55:898-890.122Christie,J.F.等人1990.Immunology69:596-602.122ABaurX.等人ClinAllergy12:9-17,1982.122BOnisukaR.等人IntArchAllergyImmunol125:135-143,2001.123CzupponAB等人JAllergyClinImmunol92:690-697,1993.124AttanayakaDPSTG等人1991.PlantMolBiol16:1079-1081.125ChyeML,CheungKY.1995.PlantMolBiol26:397-402.126AleniusH.等人1993.IntArchAllergyImmunol102:61-66.127YeangHY,CheongKF,SunderasanE,HamzahS，ChewNP,HamidS,HamiltonRG,CardosaMJ.1996.The14.6kD(REF,Hevb1)and24kD(Hevb3)rubberparticleproteinsarerecognisedbyIgEfromSpinaBifidapatientswithLatexallergy.JAllergClinImmunolinpress.128SunderasanE.等人1995.JnatRubbRes10:82-99.129SwobodaI.等人2002.JImmunol.168:4576-84.根据本发明的一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力。根据本发明的另一个优选具体实施方式，低变应原性分子表现出减少的T细胞反应活性。但是，在根据本发明所述的低变应原性分子中也可使用包含至少一个T细胞表位的变应原片段。如这里所用的"表现出减少的IgE结合能力"意思是，根据本发明所述的分子显示出显著减少的IgE结合能力或活性(与野生型变应原相比，结合能力至少减少50%，优选为至少减少70%，更优选为至少减少80%，再更优选为至少减少90%，最优选为至少减少95%)或甚至完全缺失。分子(像肽和蛋白)的IgE结合活性/能力可通过例如酶联免疫吸附测试(ELISA)使用例如从曾经暴露于野生型变应原的个体(例如过敏性个体)获得的血清来确定。简单来说，将待测肽包被至微量滴定板的孔中。洗涤并封闭孔后，以抗体溶液(由过敏性个体的血浆组成，该个体曾暴露于所测肽或由其制备的蛋白)在孔中温育。向孔中加入标记的二抗并温育。然后IgE结合的数量被定量并与纯化的野生型变应原的IgE结合相比较。或者，肽的结合能力可通过Western杂交分析确定。例如，使用SDS-PAGE将所测肽在聚丙烯酰胺凝胶中分析。然后将该肽转移至硝化纤维，接下来以来自过敏性个体的血清温育。经标记的二抗温育后，所结合的IgE数量被确定和定量。另外一个可用于确定肽的IgE结合活性的测试为ELISA竞争测试。简单来说，通过混合來自过敏性个体(通过直接ELISA表明其与野生型变应原有IgE反应活性)的血浆产生一个IgE抗体库。在ELISA竞争测试中使用这个库将野生型变应原的IgE结合与所测肽相比较。野生型变应原和所测肽的IgE结合被确定并定量。"T细胞表位"意思是蛋白(例如变应原)或其片段，对于它T细胞具有抗原特异性结合位点，结合至所述结合位点的结果为激活该T细胞。如这里所用的术语"表现出减少的T细胞反应活性"是指分子表现出T细胞反应活性，使用本领域已知的标准测试中的等摩尔量，与野生型变应原(低变应原性分子源自该野生型变应原)所诱导的刺激相比，所述反应活性显著性减少(减少的T细胞反应活性意味着，在等摩尔数量下，与野生型变应原相比，低变应原性分子的剌激减少至少30%，优选为至少50%，更优选为至少70%，最优选为至少90%)。在本发明的一个特别具体实施方式中，该分子可"缺少"T细胞表位，因此在待处理的个体(即，将接受表位呈递价态分子)中分子显示出减少的T细胞反应活性。例如可能是，源于变应原的分子相对于一个个体或一组个体为缺少T细胞表位，但相对于其他个体则具有T细胞表位。检测T细胞表位存在的方法在本领域是己知的，包括检测T细胞增殖的测试(例如胸苷摄入)。不能诱导统计学上显著高于背景(即，使用标准的统计学方法，通常p小于0.05)的胸苷摄入的免疫原通常被认为是缺少T细胞表位，虽然将意识到，胸苷摄入的定量数量可依赖于所测的免疫原而变化(参见例如，ZhenL.等人(InfectImmun.(2003)71:3920-3926))。通常，低于大约2-3的刺激指数(更优选为低于大约l)表明缺少T细胞反应活性和表位。也可根据标准方法通过测定源自T细胞的淋巴因子的分泌来确定T细胞表位的存在。可通过将受刺激细胞的增殖率(胸苷摄入)除以只在培养液中的未刺激细胞的增值率来计算刺激系数(SI)。SI=1意味着无刺激，SK1意味着毒性效应，SI>1意味着对细胞的刺激。可通过经验确定T细胞表位的位置和内容(如果存在的话)。除了T细胞的刺激，还可确定细胞因子的分泌。例如，IFN-Y已被识别为有害细胞因子。其他的例子可以是TNF-a、IL-5、IL-4、IL-8等。优选地，变应原片段由下列组成Phlp1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，PWp5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，Feld1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Feld1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Betvl的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Derp2的l至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Derp21的l至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Feld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Ambal的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。以上所列源自变应原的分子的具体氨基酸序列为-<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>术语"其片段"和"其序列变体"是指从此处披露的源自变应原分子所导出的肽，其表现出与所述源自变应原分子相当的或相同的生物化学特性(例如，防止IgE与变应原(那些分子所源自的变应原)结合的能力)。本发明所述的片段包含至少5个，优选为至少7个，更优选为至少10个连续的，和/或最大为95%，优选的最大为90%，更优选的最大为80%的源自变应原的分子的氨基酸残基。术语"序列变体"包括对肽进行的修饰例如片段化(参上)、氨基酸取代(例如以其他天然或非天然的氨基酸或氨基酸衍生物)、去除或加入。"序列变体"也指上表中的所述源自变应原的分子，其中至少1个，优选为至少2个，更优选为至少3个，再更优选为至少4个(5、6、7、8、9、10、15、20)个氨基酸残基被加入到C-和/或N-末端。注意到克隆30变应原是源自屋尘螨Dermatophagoidespteronyssinus的变应原，由以下序列组成KDCPGNTRWNEDEETCT(SEQIDNo.140;也参见ATA733/2006)。根据本发明，肽也是环绕的(encompassed),其与以上所披露的氨基酸序列为至少80%，优选为90%同源。本发明的另一个方面涉及编码根据本发明所述的融合的低变应原性蛋白的核酸分子。本发明的另一个方面涉及包含本发明所述的核酸分子的载体。所述载体优选为表达载体。容纳本发明所述核酸分子的载体可用于克隆目的或用于生产表达载体。所述载体可以是质粒、粘粒(cosmid)、病毒、噬菌体或任何其他遗传工程中通常使用的载体，并且，除了本发明所述的核酸分子外，还可包括控制表达的真核或原核元件，例如用于转录和/或翻译启动和终止的调节序列、增强子、启动子、信号序列等。根据本发明的一个优选具体实施方式，该载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。优选地，本发明所述的载体可用于在各种宿主中克隆和表达的目的。因此，所述载体除了编码本发明所述的低变应原性分子或融合蛋白之外，还包含宿主特异性调节序列。本发明的另一个方面涉及包含本发明所述核酸分子或载体的宿主。根据本发明所述的核酸分子和载体可被引入合适的宿主。所述分子可被引入该宿主的基因组。该载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被引入宿主的染色体。本发明的另一个方面涉及针对本发明所述低变应原性分子、低变应原性融合蛋白或融合蛋白的抗体。根据本发明的一个优选具体实施方式，抗体是单克隆或多克隆抗体。根据本发明所述的抗体包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段和任何以上的表位结合片段。而且，抗体被认为是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点(与抗原免疫特异性地结合)的分子。优选地，本发明所述的免疫球蛋白分子为IgG、IgM、IgD、IgA和IgY型，免疫球蛋白分子的类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。多克隆抗体可通过向非人类的哺乳动物使用本发明所述多肽(优选为使用佐剂)并收集所产生的抗血清来制备。可通过一段时间的重复注射来获得改善的效价。对于引起抗体的哺乳动物种没有特别限制；通常优选使用兔子或天竺鼠，但是也可使用马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、母牛、绵羊、骆驼等。在制备抗体时，将确定数量的本发明所述免疫原用例如生理盐水溶液稀释至合适的浓度，将得到的稀释溶液与例如完全弗氏佐剂混合以制备悬浮液，或与矿物胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronicpolyols)、聚阴离子、肽、油乳状液、钥孔戚血蓝素、二硝基酚和潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗，bacilleCalmette-Guerin)禾口短小棒状，下菌(corynebacteriumparvum)、混合。每次使用大约50吗至大约2500吗的本发明所述多肽通过例如腹膜内方式向哺乳动物例如兔子使用悬浮液和混合物。优选地，在大约2-3个月的时间内，优选大约l个月每2周使用一次悬浮液以引起免疫。在最后一次施药1至2周后，通过从免疫的动物中收集血液，离心血液并从血液中分离血清来重新获得抗体。单克隆抗体可以是例如人源或鼠源的。鼠单克隆抗体可由K6hler和Milstein的方法(K6hler,G,和Milstein,C.,Nature256(1975)495)来制备，例如通过将超免疫小鼠的脾细胞与合适的鼠骨髓瘤细胞系融合。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物种的分子，这样的抗体具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。产生嵌合抗体的方法在本领域是已知的。参见例如Morrison,Science229:1202(1985);Oi等人，BioTechniques4:214(1986);Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods125:191-202;US5,807,715;US4,816,567禾口US4,816,397。人源化抗体是与所需的抗原结合的来自非人物种抗体的抗体分子，其具有来自该非人物种的一个或一个以上补体决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区的框架残基被来自CDR供体抗体的相应残基替代，以改变(优选为改善)抗原的结合。这些框架取代物通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基之间的相互作用来鉴定对抗原结合重要的框架残基，通过序列比对来鉴定特定位置不正常的框架残基(参见例如，Queen等人，US5,585,089;Riechmann等人,Nature332:323(1988))。可使用本领域已知的众多方法将抗体人源化，例如，CDR-移植(CDR-grafting)(EP239,400;WO91/09967;US5,225,539;US5,530,101;禾nUS5,585,089),镶饰(veneering)或重塑(resurfacing),(EP592,106;EP519,596;Padlan,MolecularImmunology28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人，ProteinEngineering7(6):805-814(1994);Roguska.等人，PNAS91:969-913(1994)),和链穿梭(chainshuffling)(US5,565,332)。根据本发明所述的抗体可有利地用于遭受过敏症(特别是遭受屋尘螨过敏症)个体的脱敏(desensitization)。对于被动免疫，抗体优选为IgG或其衍生物(例如嵌合或人源化抗体)。而且，抗体也可被用于个体的脱敏(desensibilisation)。本发明的另一个方面涉及包含本发明所述低变应原性蛋白或抗体的疫苗制剂。根据本发明所述的疫苗制剂可以本领域己知的方式制成，并必要地适应于所述疫苗制剂的使用方式。(本发明的)疫苗制剂的优选使用方式包括通常的为疫苗接种所描述和建议的所有标准使用制度以及特异的过敏症免疫治疗(口服、经皮、静脉内、鼻内、经粘膜、直肠等)。但是，特别优选为经皮下或肌内使用本发明所述的分子和蛋白。本发明所述的疫苗制剂可只包含鼻病毒属成员的病毒衣壳蛋白或其片段。优选地所述制剂进一步包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。为了增加本发明所述的低变应原性分子的免疫原性，可在本发明所述的药物中使用例如佐剂。根据本发明所述的佐剂为辅助性试剂，当与抗原一起或平行使用时，增加其免疫原性和/或影响免疫反应的质量。因此，佐剂可例如相当地影响体液或细胞免疫反应的程度。通常的佐剂为例如铝化合物、含脂化合物或灭活的分支杆菌。47通常，佐剂可以是不同的形式，只要它们适合于向人类使用。这些佐剂的其他例子为矿物或植物来源的油乳状液、矿物化合物例如磷酸铝或氢氧化铝，或磷酸钙、细菌产物和衍生物，例如P40(源自肉芽肿棒状杆菌(Corynebacteriumgranulosum)的细胞壁)、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA,MPL,LPS的衍生物)和胞壁酰肽(muramylpeptide)衍生物及其结合物(衍生自分支杆菌成分)、明矾、不完全氟氏佐剂、静脉脂肪乳剂(liposyn)、皂角苷、鲨烯等(参见例如GuptaR.K.等人(Vaccine11:293-306(1993))禾QJohnsonA.G.(Clin.Microbiol.Rev.7:277-289)。根据本发明的另外一个优选具体实施方式，所述疫苗制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5昭至200昭的所述低变应原性分子或抗体。本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用途。所述药物优选为进一歩包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。根据本发明所述的药物可用于主动(使用本发明的低变应原性蛋白和/或分子)以及被动(针对本发明所述低变应原性蛋白和/或分子的抗体)免疫。根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5叱至200吗的所述低变应原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。优选地，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。特别的剂量制度，即剂量、时间和重复，取决于特别的个体和该个体的医疗史。经验考虑，例如半衰期，通常有助于确定剂量。可在治疗过程中确定并调节使用频率。优选地，向其使用本发明所述药物的个体为具有成为过敏症风险的个体或动物。患有或具有患过敏性病状、紊乱或疾病风险的个体包括己存在过敏性病状或者已知的或怀疑趋势(朝着与过敏性病状相连或由过敏性病状引起的征状发展的趋势)的个体。因此，该个体可具有主动的慢性过敏性病状、紊乱或疾病，急性过敏性发作，或潜伏的过敏性病状、紊乱或疾病。某些过敏性病状与季节性或地理性环境因素相关。因此，有风险的个体包括那些具有遭受病状风险的(该病状基于既往个人或家庭史，以及季节或物理位置)的个体，但该病状或与该病状相关的症状可能不在个体中表现其自身。根据本发明所述的向个体使用的药物(其包括至少一个如此处描述的低变应原性分子)可预防所述个体的致敏或诱导针对变应原的合适的免疫反应。如果本发明的药物用于预防致敏，则它应该在个体与所述变应原首次接触前使用。因此，优选为向婴儿和儿童使用本发明所述的药物。向怀孕个体使用本发明所述的药物将在未出生子女中诱导针对变应原的抗体的形成。对这种治疗使用本发明所述低变应原性分子是特别有益的，这是因为，由于缺少T细胞表位，在变应原免疫治疗过程中发生的副作用可被显著减少甚至完全避免。本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性蛋白或抗体在诊断个体中过敏症和/或病毒感染中的用途。本发明的另一个方面涉及来自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白作为载体在药物或疫苗中的用途或用于诊断病毒感染，特别是普通感冒的用途。作为广泛传播的KLH载体蛋白的有价值的替代物，可使用微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白。载体可通过化学方式结合至或通过重组技术融合至肽、蛋白和多肽或其他抗原。而且，病毒衣壳蛋白可用于检测例如针对个体血清中所述衣壳蛋白的抗体。这样的载体的一个优点为，不仅所融合或结合的抗原可暴露于免疫系统，而且诱导了针对鼻病毒的衣壳蛋白的免疫反应。因此，这样的疫苗引起对鼻病毒引起的疾病的预防和/或治疗。该病毒优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。本发明的另一个方面涉及源自Phip5(GenbankNr.X7435)的低变应原性分子，具有C-和/或N-末端截尾并实质上缺乏IgE结合能力。草花粉是空气传播过敏原(对干草热和过敏性哮喘负责)的最有力的室外季节性来源之一。超过40%的过敏性个体表现出对草花粉变应原的IgE反应活性，其被分成超过11个组。超过80%的草花粉过敏性病人与第5组变应原反应。第5组变应原为非糖基化的，高度同源蛋白，具有介于25-33kD的分子量。几个第5组变应原已被克隆和/或免疫鉴定。通过引入点突变、行中几个氨基酸的突变或缺失来降低变应原性活性的试验表明没有效果(SchrammQ等人JImmunol1999;162:2406-1435)。已经描述了Phlp5的IgE结合区域(FlickerS,等人JImmunol2000;165:3849-3859)，已经解决了其三维结构(MaglioO,等人2002.ProteinEng.15:635-642)。特别地，根据本发明所述的Phip5肽(其为C-和/或N-末端截尾的并缺少IgE结合能力)，可用于个体的主动疫苗接种。根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子缺少T细胞表位。如上所述，如果低变应原性分子实质上缺少T细胞表位，变应原免疫治疗的延迟副作用可被显著降低甚至是避免。缺少T细胞表位的经截尾的Phip5分子由Phip5的93至128、98至128、26至53、26至58或252至283位氨基酸或其片段或其序列变体组成。特别地，这些经截尾的分子实质上表现出无T细胞表位，但是，能够激发针对野生型变应原的合适的免疫反应。根据本发明的另一个优选的具体实施方式，低变应原性经截尾的Phip5由Phip5的132至162、217至246或176至212位氨基酸或其序列变体组成。这些低变应原性分子包含一个或一个以上T细胞表位但缺少IgE结合能力。本发明的另一个方面涉及源自Feldl的低变应原性分子(GenbankNr.X62477和X62478),其具有C-和/或N-末端截尾并缺少IgE结合能力。对动物的过敏症影响多达40%的过敏性病人。在国内环境中，对主要流行宠物，猫和狗的过敏症占特别主导并与长年的症状相连。动物变应原存在于皮屑、上皮细胞、唾液、血清或尿液中。既可通过直接的皮肤接触也可通过吸入携带变应原的颗粒而暴露于变应原。已表明主要猫和狗变应原普遍存在，甚至可在不拥有宠物的家庭和公共地方例如学校被检测到。这是由于工业化国家养宠物的家庭数目较高并在增长(大约50%)以及变应原(其被得到并分散)的高度稳定性。Fdd1被鉴定为主要猫变应原，其被超过90%的猫过敏性病人所识别。Feld1代表生物功能未知的38kDa的酸性糖蛋白。它由两个相同的非共价连接的异二聚物组成，所述异二聚物又由两个反平行的由3个二硫键连接的多肽链组成。链1和链2在不同的基因上编码，每个由3个外显子组成。已经在大肠杆菌(五.co//)中作为链2-链1融合蛋白而表达了重组Feld1(rFeld1)。这个重组Feld1能够完全模拟野生型变应原的免疫特性。源自主要猫变应原Feld1并缺少IgE结合能力的肽适合于例如免疫治疗和预防性的过敏症疫苗接种。这些肽可包含在一个较大的多肽中或与合适的载体蛋白(例如钥孔戚血蓝素，KLH)偶联。源自Feldl的合成肽(像Phlp5和这里所揭露的源自变应原的肽)能够诱导IgG反应，即产生所谓的"阻断抗体"或"保护性抗体"。这些抗体防止IgE与变应原Feld1的结合。因此可达到过敏性症状的显著性降低。根据本发明的一个优选具体实施方式，经截尾的分子表现出减少的T细胞反应活性。为了避免或显著降低延迟的副作用，源自Feld1的低变应原性分子表现出如本发明所定义的减少的T细胞反应活性。优选地，经截尾的Feld1由Feld1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Feld1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列变体组成。本发明的另一个方面涉及低变应原性分子，其由下列氨基酸组成或包含下列氨基酸Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、卯至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Feld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Ambal的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。本发明的另一个方面涉及低变应原性融合蛋白，其包含至少两个本发明所述的低变应原性分子，所述低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力并表现出任选减少的T细胞反应活性。本发明所述的源自变应原并缺少IgE结合能力的低变应原性分子可重组地与彼此融合或化学地与彼此结合。作为融合蛋白/多肽的单一成分(变应原片段)，所述融合蛋白/多肽也缺少IgE结合能力。根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个，优选为至少3个，更优选为至少4个，再更优选为至少5个本发明所述的低变应原性分子。当然，也可能将低变应原性分子与其他非源自变应原的肽、多肽和蛋白融合。当向个体使用时，这些肽、多肽和蛋白也可诱导免疫反应或者作为载体或表现出酶学活性。根据本发明所述的融合蛋白中的低变应原性分子可直接或通过一个连接子(优选为由氨基酸残基组成)与彼此相连。制备融合蛋白的方法在本领域中是熟知的，可在标准的分子生物学参考书例如Sambrook等人(MolecularCloning,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)禾卩Ausubel等人(ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded;WileyandSons,1995)中找到。通常，通过首先构建融合基因(被插入到合适的表达载体中)，然后，用于转染合适的宿主细胞来产生融合蛋白。通常，通过一系列限制性酶消化和连接反应(这导致产生所需要的插入到质粒中的序列)来产生重组融合构建体。如果不能得到合适的限制性位点，则可使用本领域技术人员已知的和以上所列参考书中的合成低聚核苷酸接头或连接子。编码变应原和天然蛋白的多聚核苷酸序列可在被插入到合适的载体之前被组装，或者编码变应原的序列可被插入到编码载体中已经存在的天然序列的序列附近。将序列插入到载体中应该符合读码框(inframe)以使该序列能被转录成蛋白。所需要的精确的限制性酶、连接子和/或接头以及精确的反应条件将根据所用的序列和克隆载体而变化，这对于本领域普通技术人员来说将是明显的。但是DNA构建体的组装在本领域是常规的，可由本领域技术人员容易地完成。根据本发明的一个优选具体实施方式，如果至少两个分子源自相同的变应原，则这些分子以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序与彼此相融合。根据本发明所述的融合蛋白可包含至少两个源自相同野生型变应原的低变应原性分子。在这样的情况下，单一的分子(变应原片段)以不同于野生型变应原中顺序的顺序与彼此相融合。这样的方法防止了低变应原性融合蛋白中潜在的IgE结合位点/表位的重新形成。本发明的另一个方面涉及编码本发明所述的低变应原性分子和融合蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子可用于例如重组地生产所述分子。根据本发明的另一个方面，所述核酸分子可包含在载体中。该载体优选为表达载体。本发明的另一个方面涉及疫苗制剂，其包含本发明所述的低变应原性分子、融合蛋白或抗体。优选地，该制剂进一歩包含至少一个佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。现今最新的增加免疫反应的方法中也有使用特别的载体物质例如KLH(钥孔戚血蓝素)。本发明所述的低变应原性分子也可融合或结合至病毒衣壳蛋白，该病毒衣壳蛋白也可用作载体(参见以上)。根据本发明的一个优选具体实施方式，所述制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别为0.5吗至200(ig的所述低变应原性分子或抗体。疫苗制剂实质上可由本发明所述的药物组成(参见以上)。本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在制备用于治疗或预防个体中过敏症的药物中的用途。根据本发明所述的低变应原性分子、融合蛋白和抗体可用于个体的疫苗接种。此疫苗接种可降低或防止由野生型变应原所引起的过敏性反应。根据本发明的一个优选具体实施方式，所述药物进一步包含至少一个佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。优选地，根据本发明所述的药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别为0.5吗至200吗的所述免疫原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。根据本发明的另一个优选具体实施方式，该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的量向个体使用。根据本发明的一个优选具体实施方式，所述个体具有获得过敏症的风险。本发明的另一个方面涉及本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体在诊断个体中的过敏症或监视过敏症治疗过程中的用途。根据本发明所述低变应原性分子、融合蛋白或抗体不仅可用于药物也可合适地用于各种诊断目的。例如，这些分子和融合蛋白可通过例如将个体的样品(包含组胺释放细胞)暴露于所述多肽而用于诊断过敏症(参见例如，Purohit等人,Clin.Exp.Allergy35(2005):186-192)。而且，这些分子、融合蛋白和抗体可被固定于表面以形成多肽阵列/芯片。这样的阵列可用于例如高通量筛选以诊断取自许多个体的许多样品中的过敏症。本发明通过以下图示和实施例进一步解释，但是，并不限制于此。图1A显示了载体p89VPl的示意性综述。图1B显示了pET-17b载体的多克隆位点和89VP1编码基因的DNA序列。图1C显示了产生核酸融合体三种可能性的示意性代表。图2显示了含有经纯化的89VP1his-标签化蛋白的经考马斯蓝染色的12%的SDS-PAGE凝胶(第1道5叱分子标记；第2-5道1089VP1洗脱样品)。图3显示了对14VP1的IgG识别14VP1和对照的免疫杂交。点通过放射自显影来显示(第1-6道以1:500-1:16000稀释的兔子抗-14VPl抗血清温育；第7-12道以1:500-1:16000稀释的免疫前血清温育)。图4显示了小鼠中89VP1特异性IgGl反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。89VP1特异性IgGl的效价通过ELISA测定，以y-轴上的OD值来表达。结果显示为箱线图(boxplot)，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。图5显示了小鼠中Phlp1特异性IgG反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。rPhlp1特异性IgGl的效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值(OD405nm)来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgGl抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。图6显示了经免疫小鼠中牧草花粉提取物特异性IgGl反应。以不同的抗原来免疫各组小鼠，如每个箱顶部所示。牧草花粉提取物特异性IgGl的效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值(OD405nm)来表达。光学值对应于小鼠血清中的IgGl抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。图7显示了通过以所有19个病人的针对rPhlp1、r89P5和KLHP5的抗血清预温育而对病人的IgE与rPhlp1结合的％抑制的平均值。％抑制显示于y-轴。结果以柱形图显示。图8显示了经免疫小鼠的脾细胞的增殖。用肽5、89VP1(89)和KLH来刺激经不同抗原(如每个箱顶部所示)免疫的小鼠的T细胞。培养液用作参考。在y-轴显示了刺激指数。结果以柱形图显示。图9显示了在人血清中通过ELISA测定而检测的IgGl、IgG2、IgG4和IgA对14VP1、89VP1和rPhlp1的反应。对于4个89VP1、14VP1及rPWp1特异性抗体测试了IO个病人的血清(如每个箱顶部所示)。在左手边和右手边的每个"柱形图配对"分别显示了秋季和冬季所取的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值(OD405nm)来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。图10显示了过敏性病人的血清中抗-89VPl和抗-rPhlp1抗体的检测。对于7个89VP1特异性抗体(每对的左侧柱形图)和rPhlpl特异性抗体(每对的右侧柱形图)测试了5个Phlp1过敏性病人的血清。效价通过ELISA测定，以y-轴上的光学值(OD405nm)来表达。光学值对应于人血清中的抗体水平。结果显示为箱线图，其中50%的值在箱和柱之间的非异常值之内。箱内的线表明了中位数。图11显示了抗-14VPlIgG与HRV14蛋白提取物和纯化的14VP1的结合(第1禾口4道5吗的标记；第2禾n4道病毒提取物；第2禾n5道5吗的14VP1)。用抗-14VP1免疫血清和免疫前血清分别温育A杂交和B杂交。通过Western杂交来检测所结合的IgG，通过放射自显影来显示。图12显示了HRV14的中和(第A道(细胞对照)以1:10、1:1()S稀释的抗-14VP1免疫血清预温育HRV14之后的细胞(Al-A6行)；第B道以1:102-1:108稀释的免疫前血清预温育HRV14之后的细胞(B1-B6行)；第C道以HRV1410TCD50-106TCD50温育之后的细胞(Cl-C6行)；D5:以免疫前血清温育之后的细胞；D6:以免疫血清温育之后的细胞)。细胞植板于所有的孔，在三天后以结晶紫染色。图13显示了抗-肽抗血清与完全Phip5变应原的IgG反应活性。显示了从6只兔子(每个均以一种KLH偶联的肽来免疫)获得的3个血清样品(取血l:免疫前血清；取血2-3:月间隔收集的血清样品)对Phip5的IgG反应活性(OD值)。图14显示了rPhlp5的变应原性活性，以及由CD203c表达所检测的肽混合物。来自三个Phlp5过敏性病人的肝素化血液样品以10—4至10pg/mL系列稀释的重组变应原、源自Phlp5的肽的等摩尔混合物、抗-IgE或对照缓冲液(co，x-轴)进行温育。然后以CD203cmAb将细胞染色，并在FACScan上分析CD203c的表达。在y-轴上显示了刺激指数(SI)。图15显示了对源自Phlp5的肽的鉴定，该肽诱导低淋巴增殖反应。以不同浓度的肽和用于对照目的的白细胞介素-2(x-轴)刺激来自牧草花粉过敏性病人的PBMC。在y-轴上显示了刺激指数(SI)。图16显示了源自Feld1的合成肽(其在兔子中诱导Feld1特异性IgG免疫反应)。以KLH偶联的源自Feld1的合成肽或未偶联的rFeld1来免疫6只兔子，在月间隔进行取血3-4次。免疫前血清和抗血清针对ELISA板上所结合的rFeld1的IgG反应活性表示为光学密度(O.D.值，y-轴)。图17显示了通过敏性病人嗜碱细胞上CD63和CD203c的表达而确定的源自Feld1的合成肽的低变应原性活性。以系列稀释的Fdd1(实心框)或源自Fdd1的合成肽的混合物(空心框)(x-轴)温育来自5个猫过敏性病人的PBMC。对于病人RR，也用系列稀释的源自Feld1的合成肽作为单一成分对PBMC进行探测。表面标记CD203c和CD63表达的诱导以平均荧光强度测定，经计算的刺激指数显示于y-轴。图18显示了以KLH偶联的源自Betv1的肽处理在致敏小鼠中减少了针对rBetv1的淋巴增殖反应。在体外以重组桦树花粉变应原Betv1(白色条形柱)、KLH(黑色条形柱)或肽混合物(灰色条形柱)刺激后培养的脾细胞中测定了T细胞增殖。条形柱代表不同小鼠组别的平均刺激指数(SI士SD)。图19显示了以KLH偶联的源自Betv1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性疫苗接种，在致敏后该肽减少针对rBetv1的淋巴增殖反应。图20显示了以KLH偶联的源自Betv1的肽对初次接受试验小鼠进行预防性疫苗接种诱导了Betv1特异性IgG反应并为由完全变应原诱导的变应原特异性IgG反应作好了准备。在不同的时间点(x-轴)测定了4个处理组中的针对Betvl的IgG反应(OD值:y-轴)。图21显示了源自Phlp5的肽(1，2)和变体(la，2b)的IgE反应活性IgE结合能力的对比，使用来自7个草花粉过敏性病人(pl-p7)和来自一个非过敏性个体(NHS)的血清通过使用0.20g/点的点杂交测验来确定。rPhlp5用作阳性对照，HSA用作阴性对照。以1251标记的抗-人IgE来检测所结合的IgE。图22显示了源自PWp5的肽(1，2)和变体(la，2b)的淋巴增殖反应。以不同浓度的肽和用于对照目的的等摩尔浓度的rPhlp5刺激来自草花粉过敏性病人的PBMC。在y-轴显示了刺激指数(SI)。图23显示了抗VP1抗体的交叉保护。实施例泰沐p卵KP7游裕遂使用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen,Germany)从细胞培养物上清液中提取RNA，然后加入1pi的RNase抑制剂(BoehringerGmbH,Germany)至最终浓度0.01U/pl，这样来制备用于RT-PCR的病毒贮存样品。.通过用编码人类鼻病毒株89(89VP1)的VP1蛋白的cDNA序列替代pET-17b的多克隆位点的Ndel/EcoRI片段来构建质粒p89VPl(图1A)。Ndel和EcoRI限制性位点(在pET-17b中)用于插入Asel/EcoRI连接的89VP1，该89VP1在5'末端带有ATG，在3'末端带有6个组氨酸，接着是终止密码子TGA(图1B)。通过核苷酸测序来确定在pET-17b中插入了89VP1。在Ndel/Asel融合代替Ndel位点后产生了CATAAT，其不能被任何已有酶切割。因此，该位点突变为CTTAAG，即AflII的限制性位点。为了再插入一个变应原片段，ACCGTT序列在3'末端被突变为ACCGGT，即Agel的限制性位点。89VP1的核苷酸序列下面显示了氨基酸序列。在图1B中以下划线显示了限制性位点。所述AflII和Agel限制性位点以快速改变位点形成突变试剂盒(QuickchangesitemutagenesisKit(Stratagene))产生。因此，如图1C所示，可在89VP1的5'末端(使用AflII)或3'末端(使用Agel)的剩余限制性位点或同时两个位点插入基因片段的cDNA，以便于容易纯化。因此重组变应原片段将在89VP1的N-末端和/或C-末端表达。表l:克隆和突变形成的引物(5'至3')卵m克澄89VP1正向CGGAATTCATTAATATGAACCCAGTTGAAAATTATATAGATAGTGTATTA189VP1反向CGATTAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACGTTTGTAACGGTAA2克蘑效厕AflII正向CTTTAAGAAGGAGATATACTTAAGATGAACCCAGTTG3AflII反向CAACTGGGTTCATCTTAAGTATATCTCCTTCTTAAAG4Agel正向CCTGATGTTTTTACCGGTACAAACGTCCACCAC5Agel反向GTGGTGGACGTTTGTACCGGTAAAAACATCAGG6宴蕭2,殺膨m应M凝合節游/键歸雄将以上所描述的方法示例于C-末端Phip1变应原片段，即肽5(CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTAYESK;M.Focke等人FASEBJ(2001)15:2042-4)。用Phip1cDNA(GenBank:X78813)作为模板通过PCR扩增肽5的DNA序歹U(弓l物Phip1正向5'-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3，(SEQIDNo.7);Phip1反向5，陽CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3，(SEQIDNo.8))。将PCR产物插入p89VPl载体的AflII限制性位点，得到的构建体被称为载体p89P5和基因产物r89P5。婆'嚴激j,卵PT7嚴5嚴会歪/^,卵PT7游表这,錄众为了达到89VP1或r89P5(重组89VPl-肽5融合蛋白)，将质粒转化至E.coliBL21(DE3)。经转化的E.coli在37。C下生长于250ml含有100mg/1氨比西林的LB培养基，生长至0.4的光密度(600nm)，通过加入异丙基-卩-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至1mM的最终浓度来诱导蛋白表达。4小时后，通过在4'C和3500rpm56下离心10分钟来收集E.coli细胞。使用QiagenNi-NTA和柱以Qiagen程序来进行纯化。将细胞沉淀在变性条件下重悬于5ml的6M盐酸胍1个小时。离心(20分钟，10000xg)后，以1ml的Ni-NTA再温育上清液1个小时。然后将悬浮液装柱，以5ml的洗涤缓冲液(8M的尿素，pH6.3)洗涤两次，然后以4ml的洗脱缓冲液(8M的尿素，pH3.5)洗脱。通过降低尿素的摩尔浓度透析后达到复原。如图2所示以SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度和大小。蛋白带对应于经计算的33.6kD的蛋白大小。也通过Western杂交分析(使用抗-组氨酸标签抗体)确定了蛋白的完整性。劣蕭(-淑免泉被澄彦KP7錄辦好i沐将5叱的14VP1(人类鼻病毒株14的VP1蛋白)和对照(Betv1、Phlp5、BSA)点膜至硝化纤维膜带。将这些带暴露于兔子抗-14VPl抗血清(第1-6道)和免疫前血清(第8-12道)的稀释液。以1:1000稀释的1251标记的驴抗-兔子IgG检测所结合的兔子IgG抗体，并以放射自显影显示(图3)。兔子抗-14VPl血清的点杂交分析表明14VP1有强烈的免疫原性。与免疫前血清和Betv1、Phip5和BSA对照相反，以1:16000稀释的抗血清仍能检测到IgG抗体。实嚴翔5,if过虹/M緣定，瘦V、,f^卵py7錄，丝i沐及应为了确定89VP1的免疫原性及其作为肽5的载体的能力，以下列抗原免疫六周龄的雌性balb/c小鼠组(CharlesRiver):KLH、KLH马来酰亚胺偶联的肽5(KLHP5)和KLHEDC偶联的肽5(KLHP5edc)。通过Imject马来酰亚胺激活的mcKLH禾口ImjectImmunogenEDCKit(Pierce)进行化学偶联。马来酰亚胺基团与SH基团反应，EDC与羧基和氨基基团反应以形成稳定的键。每组4只的小鼠以89VP1、r89P5和89P5edc进行免疫，2只以单独的肽5进行免疫(每只5吗，与氢氧化铝1:2混合)。在大约三周间隔内通过皮下来免疫小鼠，在尾静脉取血。通过ELISA确定89VP1特异性IgGl抗体的水平。以5吗/ml的89VP1包被ELISA板(Nunc)。以1:500稀释小鼠抗-89VPl、抗-r89P5和肽5血清。以1:1000的大鼠抗-小鼠IgGl(BDPharmingen)，然后以1:2000的POX偶联的山羊抗大鼠IgG(AmershamBioscience)检测所结合的IgGl。在y-轴显示了光学值(OD405nm)，对应于小鼠血清的IgGl抗体水平(图4)。KLHP5、KLHP5edc、KLH和肽5用作对照。以89VP1(89VP1、89P5edc和r89P5)注射的小鼠的免疫过程中以增加的效价检测到了IgGl抗体。以89VP1、r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的结果。实:MW6.'遞i^虹7&4磁定免度V、嵐^^PWp7錄岸丝拔银^应为了评估以r89P5免疫是否诱导与完全Phlp1反应的IgG抗体，使用了如实施例5中描述的同样的方法和同样的小鼠血清。以5pg/ml的rPhlp1包被ELISA板并测定了IgGl抗体的效价(图5)。所有的与KLH或89VP1偶联的源自Phip1的肽都在免疫过程中以渐增的反应来诱导rPhlp1特异性IgGl抗体。以r89P5和KLHP5免疫的兔子显示了相同的结果。婆i激7,/W定發享花教碧欲激錄弄丝/gG/拔沐如第5部分所述进行了小鼠免疫和ELISA分析。将全牧草花粉提取物包被于ELISA板(100吗/ml)，并确定了IgGl抗体的效价(图6)。三次免疫后可在以肽5免疫的小鼠中检测到提取物特异性IgGl抗体。类'/f,/g,^子i-r卵户5叛谬淑欽谅乂游/g五与r/Wp7游禁合为了确定肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE抗体与rPhlp1结合的能力，以1pg/ml的rPhlp1包被ELISA板，洗涤并封闭。板以I:IOO稀释的兔子抗-肽(89P5,KLHP5)、兔子抗rPhlp1以及用于对照目的的相应的免疫前血清进行预温育。洗涤以后，板以来自Phlpl过敏性病人的(l:3稀释的)人血清进行温育，以小鼠抗-人IgE(Pharmingen1:1000)，然后以1:2000的POX偶联的绵羊抗-小鼠IgG(AmershamBioscience)来检测所结合的IgE。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率100-ODi/ODpx100。OD,和ODp分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。表2显示了抗-Phlp1肽抗体抑制19个过敏性病人的IgE与完全rPhlp1结合的能力。图7显示了所有的抗-rPhlp1、抗-r89P5和抗-KLHP5免疫血清的平均抑制(以％表示)。抗-肽血清比rPhlp1更好的阻断了IgE的结合。抑制能力与89P5和KLHP5几乎一样。表2显示了所有19个病人的抑制(以％表示)。表2:以兔子抗-rPhlp1、r89P5和抗-KLHP5抗血清温育后19个病人的IgE与rPhlpl结合的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>实細p.-叛腳激V、嵐,細后游r潘淑激以KLH、KLHP5和KLHP5edc免疫每组三只小鼠。以89VP1、r89P5和89P5edc免疫每组4只小鼠四次，以单独的肽5免疫2只小鼠(每只5吗)。最后一次免疫IO天后取出脾细胞，在96孔板中以三次重复用肽5(P5)、89VP1、KLH和分别作为阳性对照和阴性对照的ConA和培养液来刺激单独的细胞培养物。四天后向每个孔中加入放射性[3司胸苷0.5^Ci。然后在15小时后用Packard细胞收集器收集细胞至imifilter板。用(3计数器测定细胞相连的放射活性。计算了刺激指数并显示于y-轴。在x-轴上显示了用于剌激的抗原。每个框代表用于免疫小鼠的抗原的数据(图8)。所有超过2的值作为阳性。经KLH和KLHP5免疫的小鼠只有当以KLH刺激时是阳性的，肽5小鼠是完全阴性的。对应于ELISA结果，KLHP5edc组也是阴性的。来自经r89P5、89P5edc和89VP1免疫小鼠的细胞只有当以89VP1刺激后增殖。初次接受试验的对照小鼠在所有的情况下没有表现出增殖。这些结果表明T细胞表位是由载体89VP1而不是由肽5提供的。婆:MW70.'检##季浙冬季获淳游乂虛/,^游"P7V-、/〃riWPJ錄微拔沐在秋季从五个随机选取的个体中取血清，冬季五个。通过ELISA确定了针对14VP1、89VP1和rPhlp1的IgGl、IgG2、IgG4和IgA抗体水平，如实施例5中所述。以1:1000用1:2000POX偶联的绵羊抗小鼠IgG(AmershamBioscience)来检测人IgGl、IgG2、IgG4和IgA(BDPharmingen)。在取自秋季和冬季的血清中可检测到抗-14VPl和89VP1IgGl高效价(图9)。抗-rPhlp1IgGl抗体效价相比较很低。IgG2、IgG4和IgA抗体可在所有的情况下检测到，水平非常低。不同HRV株的VP1蛋白紧密相关，在其他的研究中已表现出交叉反应性。实'嚴翔〃，/i^敏丝疯乂游宛-砂FiV/〃i層riWp7贫沐获取了五个Phlp1过敏性病人的血清，如实施例5所述进行了ELISA实验。以rPhlp1和89VP1包被ELISA板，确定了特异性IgM、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgE抗体效价(图10)。可检测到比抗-rPhlp1IgGl抗体更多的抗-89VPlIgGl抗体。实嚴夠J2:遞过肠加r",杂交分,澄^/贫-"FW^沐与全裙毒游兹合通过使用全HRV14病毒(第2禾口5道)和作为对照的5pg的纯化的14VP1(第3禾B6道)来确定经14VPl注射兔子血清中的IgG抗体与全病毒的结合。以12%的SDS-Page分离病毒提取物并点膜至硝化纤维膜。测试了1:500的兔子抗-14VP1抗血清(第1-3道)和1:500的免疫前血清(第4-6道)与HRV14和14VP1的结合。以125I标记的驴抗-兔子抗体检测了所结合的IgG，通过放射自显影显示(图ll)。可在与14VP1相同的大小处(33.6kD)检测到14VPl-抗血清的结合。实應-萍"，拔-"^7V拔沐#完',游乂类#谅毒〃游吵/〃确定了HRV14的组织培养半剂量50(TCD50)。因此，在MEM-Eagle，1%FCS和40mMMgCl2中进行了1:102至1:108的病毒稀释，在24孔板于34。C下5%C02加湿的空气屮和HeLaOhio细胞一起温育三天。也展丌了无病毒的对照。三天后通过结晶紫显示病毒的毒性效应，计算了TCD50(引起50%细胞死亡的稀释)。在34t:下温育行A和B中的血清稀释液和病毒U00TCD50)。两小时后在所有的孔中展开细胞。D5和D6是血清对照。在图12中显示了实验计划。三天后以结晶紫检测了抗体的中和效应(图12)。婆:#辨"，源—^尸W。5游会成就游特丝使用IIBTU-激活(0.1mmol小级别循环)以Fmoc策略在AppliedBiosystems肽合成器Model433A上合成了肽，如Focke等人FasebJ(2001)15:2042所述。在对Phip5变应原进行了深度分析后，制备了六个源自Phip5的肽，这些肽在长度上介丁-31(Pl:3026道尔顿)至38(P6:3853道尔顿)个氨基酸，富含暴露于溶剂的氨基酸(表3)。这些肽具有介于4.32至8.98的等电点，其中三个(肽3、4和6)可含有人T细胞表位。表3.非变应原性的源自Phip5的合成肽的特性。显示了位置(相对于Phip5分子)、序列、长度、分子量(MW)，等电点(pl)和源自Phip5肽的T细胞表位的存在性。以黑体和下划线标示了所加入的半胱氨酸残基(为了促进偶联)。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>/5..i&iW/75游嚴疑少/gEf应舒丝^^嚴丝^/#15.1缺少IgE反应活性为了分析六个源自Phip5的肽的IgE反应活性，使用来自29个草花粉过敏性病人的血清通过ELISA对分离的和KLH偶联的源自Phip5的肽的IgE结合能力与完全rPhlp5的IgE结合能力进行了比较(表4)。表4:29个草花粉过敏性病人和1个非变应原性对照的血清学特性。性别、年龄、总血清IgE水平(kU/L)、牧草提取物特异性IgE(kUA/L)、对rPhlp5特异性的IgE抗体和6个分离的(Pl至P6)禾nKLH偶联的(KLH-P1至KLh-P6)肽(通过ELISA测定)，显示了OD(光密度)。破折号表示对分离的和KLH偶联的肽缺少IgE反应活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>CA)來检测所结合的IgE抗体。总IgE水平和草花粉提取物特异性IgE分别介于24.9至2000kU/L(平均262.7)和2.2至100kUA/L(平均41.5)。所有的病人都含有rPhlp5特异性IgE抗体，介于0.157至2.530OD单位(平均1.082OD单位)，但是29个病人中没有一个显示出对任何肽(P1-P6)或肽的等摩尔混合物的IgE反应活性(OD《0.08)。这个结果证明没有血清是含有可检测的对六个源自PWp5肽中任一个有特异性的IgE抗体。15.2.由嗜碱细胞上CD203c表达所检测的减少的变应原性活性嗜碱细胞的激活和流式细胞术CD203c的上调已被描述为变应原诱导的嗜碱细胞激活和脱粒的代理标志(Hauswirth等人，JAllergyClinImmunol2002;110:102)。因此，通过测定草花粉过敏性病人的嗜碱细胞上CD203c的上调比较了完全rPhlp5变应原和肽的等摩尔混合物的变应原性活性。在获得知会同意之后，从三个过敏性捐赠人取得了外周血细胞。以系列稀释的重组变应原(10—4至10ng/ml)、抗-IgE抗体(1pg/ml)或对照缓冲液(磷酸盐缓冲盐水-PBS)在37"下温育肝素化血液等分试样(100pi)15分钟。温育后，以含有20mMEDTA的PBS洗涤细胞。然后以10piPE偶联的CD203cmAb97A6在室温(RT)下温育细胞15分钟。然后，以2mL的FACSTM裂解溶液将红血球裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan(BectonDickinson)上用二色流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c的上调通过平均荧光强度(MFI)(由经刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)细胞获得)来计算，并表达为刺激指数(MFIstim:MFIcontrol)。SI》2.0(》2倍上调)被认为是特异性反应的指征。如图14中所示，发现在致敏个体中完全rPhlp5表现出外周血嗜碱细胞上CD203c的表达的剂量依赖性(10—4至10ng/ml)增长，而肽的等摩尔混合物没有表现出效应。对来自草花粉过敏性病人的嗜碱细胞上CD203c表达的确定表明以源自Phlp5的肽观察不到变应原性活性。婆:MW".-以i^户/z/p5游l兗疫遂导7与riWp5浙来^石/^草#游天然变应凝应游/gG拔沐16.1.重组变应原和变应原提取物在E.Coli中表达了纯化的重组Phlp5，如Vrtala等人(JofImmunol(1993)151:4773-4781)所描述。从AllergonPharmacia(Sweden)获得了来自梯牧草(Phleumpmtense)、多年生黑麦草(Loliumperenne)、草地早熟未(Poapratensis)、鸭茅(Dactylisglomerata)、黑麦(Secalecereale)、小麦(Triticumaestivum)、燕麦(Avenasativa)、大麦(Hordeumvulgare)、黄花茅(Anthoxanthumodoratum)的草花粉，制备了水性花粉提取物，如Vrtala等人(IntArchAllergyImmunol(1993)102:160-9.)所描述o16.2.兔子的免疫根据生产商的建议，将HPLC纯化的肽偶联至KLH(钥孔戚血蓝素，MW4,5xl03-1.3xl07，Pierce,USA)，使用ConjugationKit(Sigma,USA)进行纯化。以每个KLH偶联的肽(200吗/注射)和用于对照目的的完全rPhlp5使用弗氏完全佐剂和不完全佐剂(CharlesRiver)将兔子免疫。在四周间隔内取得血清样n叩016.3.兔子抗体与完全rPhlp5和来自不同草种的天然变应原的反应活性为了研究以KLH偶联的肽免疫之后所诱导的抗体是否能够识别rPhlp5、天然Phip5和来自其他草花粉种的Phip5相关草花粉变应原，进行了ELISA实验。为了进行ELISA检测，板(NuncMaxisorp,Denmark)以花粉变应原提取物(100pg/ml:梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、黄花茅)或纯化的重组变应原(5(ag/ml:rPhlp5)进行包被。洗涤ELISA板并封闭，接下来以兔子抗-肽抗血清和1:2500稀释的相应的免疫前血清进行温育。以HRP偶联的山羊抗-兔子Ig抗血清(JacksonImmunresearch,Pennsylvania)检测所结合的兔子IgG。结果代表两次重复测定的平均，其误差<5%(图13，表5)。表5:抗-Phlp5肽抗血清与rPhlp5和来自梯牧草、多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦、小麦、燕麦、大麦、黄花茅的天然第5组变应原的交叉反应活性。显示了经过KLH偶联的源自Phlp5的肽(P1至P6)免疫的六只兔子中肽抗血清(抗-Pl至抗-P6)与Phlp5和来自草花粉的花粉提取物的IgG反应活性(OD值)。抗-肽抗血清与rPhlp5和草花粉提取物的交叉反应活性<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>16.4.以源自Phip5的肽免疫诱导了交叉反应性IgG抗体以每个肽免疫诱导了有力的Phip5特异性IgG反应，其在第一次免疫四周后可检测到，在第二次免疫后增加(图13)。以肽2免疫诱导了最高的PWp5特异性IgG反应，接下来是肽6、4、5禾tU，肽l诱导了最低的反应。除了抗-肽l抗体(其缺少与第5组变应原中多年生黑麦草、草地早熟禾、鸭茅、黑麦和大麦的反应活性)之外，其他的肽抗血清均与每个所测的草花粉提取物有交叉反应(表5)。实i,/77,以蕭^P/z/p5游,免资诱导7^",劍享论教谨敏丝MX游/g五与JWp5兹合游/gG贫沐17.1.肽特异性IgG对过敏性病人的IgE与rPhlp5a结合的抑制关于肽诱导阻断抗体的能力的信息是重要的，因为已表朋阻断抗体在免疫治疗中扮演重要角色。为了检测肽诱导的兔子Ig的抑制过敏性病人的IgE与完全rPhlp5结合的能力，使用来自29个草过敏性病人的血清进行了竞争性ELISA实验。以rPhlp5(1吗/ml)包被ELISA板，并以1:250稀释的每个抗-肽抗血清(抗-P1至抗-P6)、抗-肽抗血清混合物、抗-rPhlp5抗血清或者用于对照目的的相应的免疫前血清或免疫前血清混合物进行预温育。洗涤后，板以l:3稀释的来自29个草花粉过敏性病人的血清温育，以碱性磷酸酶偶联的小鼠单克隆抗-人IgE抗体(Pharmingen)来检测所结合的IgE抗体。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率IgE结合的。/。抑制400-ODi/ODpx100。OD,和ODp分别代表以兔子免疫血清和免疫前血清预温育后的消光度。以肽诱导的兔子IgG预温育Phip5在不同程度上抑制了过敏性病人IgE反应活性。对IgE结合的平均抑制程度介于19.3%(抗-肽6IgG)至28.5%(抗-肽1IgG)。针对完全Phip5获得的兔子抗体诱导了对IgE结合平均43.6%的抑制。表6:兔子抗-Phlp5抗血清抑制牧草花粉过敏性病人的血清IgE与Phip5的结合。显示了对Phlp5用抗-肽抗血清(抗-Pl至抗-P6)、六个抗-肽抗血清(抗-Pl-P6)的混合物或抗-rPhlp5抗血清进行预温育之后，每个病人的IgE与Phip5结合的抑制百分率。在最底行显示了平均抑制百分率。N.d.:未做。特异性抗血清对lgE与Ph1p5结合的。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>实:MW7^p5游嚴诱导瓶待^丝游沐g谱遭^应18.1.淋巴增殖测试为了鉴定具有最低可能的T细胞反应活性的肽(为了使治疗相关的副作用最小化)，通过淋巴增殖测试检测了T细胞反应活性。从两个草花粉过敏性病人中通过Ficoll(AmershamPharmaciaBiotech,UK)密度梯度离心分离了外周血单核细胞(PBMC)。以三次重复方式在96孔板(Nunclone;NalgeNuncInternational,Denmark)中在37。C下5%C02加湿的空气中以200pi的无血清UltraCulture培养液(BioWhittaker,Rockland,ME，培养液以2mML-谷氨酸(SIGMA,USA),50卩-巯基乙醇(SIGMA)和每毫升0.1mg的庆大霉素(Sigma)补充)来培养PBMC(2xl05)。用不同浓度的合成肽(每孔1.25、0.6和0.3pg)和用于对比的每孔4U白细胞介素-2(BoehringerMannheim,Germany)以及单独的培养液来刺激细胞。培养6天后每孔加入0.5nCi的[3印胸苷(AmershamPharmaciaBiotech),16小时后使用微贝塔闪烁计数器(WallacADL,Germany)通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性。从三次重复计算出平均cpm，从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数(SI)。以不同浓度的合成肽刺激来自牧草花粉过敏性病人的PBMC。以肽刺激的刺激指数显著性低于以IL2刺激的。源自Phlp5的肽诱导了低特异性淋巴增殖反应。最低的反应出现于肽5，然后是肽4。総"7游会成扁錄丝为了获得适合于猫过敏症疫苗接种的肽，根据Feld1的已知氨基酸序列设计了五个肽，这五个肽长度为30至36个氨基酸，并且覆盖了全分子。使用HBTU[2-(lH-苯并三唑-l-基)1，1,3,3四甲基脲六氟磷酸]-激活(0.1mmol小级别循环)以Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略在AppliedBiosystems肽合成器Model433A(USA)上合成了肽。预装的PEG-PS(聚乙烯乙二醇聚苯乙烯)树脂(0.15-0.2mmol/g装载)(PerSeptiveBiosystems,UK)用作固相以建立起肽。化学物质从AppliedBiosystems购买。通过在反馈控制系统中监视传导性来确定氨基酸的结合。向肽1、3、4和5加入一个半胱氨酸残基以促进其与载体的偶联(表7)。用250pi蒸馏水、250(Jtriisopropylsilan(Fluka,Switzerland)、9.5mlTFA的混合物从树脂中切割肽2小时，在叔丁基甲基醚(Fluka,Switzerland)中进行沉淀(Focke2001)。通过质谱检测肽的特性，通过制备性HPLC(PiChem,Austria)将肽纯化至>90%的纯度。表7:源自Feld1的合成肽的分子特性。显示了源自Feld1的合成肽在天然Feldl分子内的位置、氨基酸序列、氨基酸数目、经计算的分子量(MW)和理论等电点(pl)。所有的肽在水中可溶。厂位置氨基酸序列aa长度MWPi肽1SEQIDNo.15链l,aal-34telCPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPWC3539114.30肽2SEQIDNo.16链l,aa35-70LENARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLC3640834.72肽3SEQIDNo.17链2,aal-34VKMAITCPIFYDVFFAVANGNEIXLDLSLTKVNAC3538354.56肽4SEQIDNo.18链2，aa35-63TEPERTAMKKIQDCYVENGL[SRVLDGLVC3033824.93肽5SEQIDNo.19链2,aa64-92CMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR3032464.78五个源自Feld1的合成肽具有介于3246至4083道尔顿的分子量，具有4.30至4.93的经计算的等电点。所有的五个肽均为水溶性的，肽l、2和3可能含有人T细胞表位(表7)。表8.与rFeld1相比源自Feld1的合成肽具有减少的IgE反应活性<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>与wg/J7淑M象^d/游会y^it^夯凝'少游/g五《应活丝#^嚴^Fe"7游^成嚴欽,变应嚴丝活丝为了鉴定适合于疫苗接种的低变应原性肽，研究了血清IgE对源自Feld1的合成肽的反应活性。对IgE介导的猫过敏症的诊断是基于既往病历、刺皮测试(Allergopharma,Reinbek,Germany)和对血清总IgE以及猫皮屑特异性血清IgE的测定(CAP-FEIA,PharmaciaDiagnostics,Sweden)。包括了用于对照目的的非过敏性人员。20.1.在ELISA测试中检测的IgE结合能力使用来自14个猫过敏性病人的血清对五个源自Feld1的合成肽的IgE结合能力与完全rFeld1变应原进行了比较。ELISA板(NuncMaxisorb,Denmark)以源自Feld1的合成肽或作为对照的rFeld1(0.5^g/孔)进行包被，洗涤然后封闭。然后以1:5稀释的来自猫过敏性病人和非过敏性个体的血清在4'C下进行温育过夜。所结合的IgE抗体用1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体(KPL,USA)进行检测。对来自7个女性和7个男性猫过敏性病人(年龄为22至75岁)的血清进行CAP-FEIA确定。所测的总IgE水平介于122至>4000kU/1，猫皮屑特异性IgE水平介于1.99至>100kUA/1(表7)。在ELISA测试中，确定了所测的所有14个血清对主要猫变应原Feld1的IgE反应活性。以光密度(OD)获得结果，其介于0.178至2.838OD单位。在相同的ELISA测试中测定了14个血清对源自Feld1的合成肽的IgE反应活性。发现肽1、2、3和5保留了IgE结合。对于肽1来说观察到的IgE结合为6/14血清，对于肽2为3/14血清，对于肽3为1/14血清，对于肽5为10/14血清。所测的OD单位对于肽1来说介于0.051至1.998之间，对于肽2来说介于0.060至0.123，对于肽3为0.186，对于肽5来说介于0.056至0.677。总之，所测的所有OD单位均显著性低于各自的相对于完全Feld1变应原所测的值。这证明了与完全Feld1变应原相比，源自Fdd1的合成肽具有减少的IgE反应活性。因此，源自Fddl的合成肽可认为是低变应原性的，当在SIT中使用时，其提供了减少的IgE介导的副作用的优点。20.1.对人嗜碱细胞上的表面标记CD203c和CD63表达的特异性诱导(图17)由于IgE结合是诱导1型过敏性反应的先决条件，但不足以诱导1型过敏性反应，1型过敏性反应还需要与效应细胞结合的特异性IgE的交联，所以在嗜碱细胞激活测试中研究了源自Feld1的合成肽的实际变应原性活性。这些测试检测到表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调，CD203c和CD63二者均被识别为嗜碱细胞激活的标记(Hauswirth等人JAllergyClinImmunol.(2002)110:102-109)。在获得知会同意之后，从5个猫过敏性病人取得了肝素化血液样品。以系列稀释的rFeld1、源自Feld1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物、抗-IgE抗体或缓冲液(PBS)在37'C下对血液等分试样(100|al)进行温育15分钟。温育之后，在含有20mMEDTA的PBS中洗涤细胞。然后以10piPE偶联的CD203cmAb97A6和20pl的FITC偶联的CD63mAbCLB-gran12在室温下对细胞进行温育15分钟。然后，将样品以2mlFACSTM裂解溶液进行红血球裂解。然后洗涤细胞，重悬于PBS，并在FACScan(BectonDickinson)上用二色流式细胞术使用Paint-a-Gate软件分析。变应原诱导的CD203c和CD63的上调通过平均荧光强度(MFI)(由经刺激的(MFIstim)和未刺激的(MFIcontrol)细胞获得)来计算，并表达为刺激指数(MFIstim:MFIcontrol)。SI大于2.0(即大于2倍上调)被认为是特异性(诊断性)反应的指征。在所研究的所有五个猫过敏性病人(RR、EB、KC、MG和SM)的嗜碱细胞上，以rFdd1刺激均诱导了表面标记CD203c和CD63的变应原特异性上调。在5个病人中的4个(RR、KC、MG和SM)中观察到CD203c和CD63的上调为剂量依赖性的。对于这些病人来说对于所测的最低浓度(0.001ngrFeldl/ml),CD203c刺激指数为1.1(SM)至3.2(RR);对于所测的最高浓度(10吗的rFeldl/ml)，CD203c刺激指数为3.6(KC)至6.2(RR)。在同样的测试中所确定的CD63的刺激指数对于所测的rFeld1的最低浓度(0.001昭rFeld1/ml)为介于1.1(RR)至2.0(MG);对于所测的rFeld1的最高浓度(10昭的rFeld1/ml)为介于3.9(RR)至7.3(MG)。对于病人EB来说，0.001吗/ml的Feld1已经足以诱导表面标记CD203c和CD63的高水平的上调，从而防止观察到表面标记上调的剂量依赖性。以五个渐增的浓度(0.005、0.05、0.5、5和50吗/ml)的五个源自Feldl的合成肽的等摩尔混合物对来自所有的五个猫过敏性病人的嗜碱细胞进行探测。另外以五个渐增浓度(0.001、0.01、0.1、l和10吗/ml)的五个单独的源自Feld1的合成肽对病人RR的嗜碱细胞进行探测。发现肽在上调表面标记CD203c和CD63上是缺陷的。肽不能够诱导病人RR、KC和SM的CD203c和CD63表达的任何增加。对于病人MG可检测到CD203c(SI=2.3)和CD63(SI=2.5)轻微的上调，但是仅限于所测的最高浓度(50pg肽混合物/ml)，而所用的最低浓度也没有刺激效应。对于病人EB观察到更为有力的CD203c(SI=4.2)和CD63(SI=4.3)的上调，但是，仍然是只对所测肽混合物的最高浓度。在这两种情况下(病人MG和EB)，以肽刺激后的上调率均比相应的以完全Fdd1变应原刺激后的显著性降低。这证明了源自Fdd1的合成肽提供了比完全Feld1变应原具有较低的变应原性活性的优点。当在SIT中使用源自Feld1的合成肽时，这与减少IgE介导的副作用风险相关。寞'嚴激"，议i^Fg/J/游会成嚴應處诱导7与完全rFe/d7f应游/gGi#源自Fdd1的合成肽在IgE结合方面表现为缺陷的。作为疫苗接种(目的是诱导变应原特异性IgG抗体)的候选分子，肽必须保持特异性的变应原结构并且必须仍然能够诱导对完全变应原特异性的IgG免疫反应。为了找出源自Feld1的合成肽是否满足这些要求，在兔子中进行了免疫实验。以未经偶联的rFdd1和KLH偶联的源自Feld1的合成肽对兔子进行免疫。使用Imject马来酰亚胺激活免疫原偶联试剂盒(ImjectMaleimideActivatedImmunogenConjugationKit)(Pierce,USA)，通过它们的半胱氨酸残基将经HPLC纯化的肽偶联至KLH。使用CFA(第一次免疫)和IFA(4周后第一次推进性注射；7周后进行带有不完全佐剂的第二次推进性注射)(CharlesRiverBreedingLaboratories,Germany)以免疫原(200吗/注射)对兔子(NewZealandWhiterabbits)进行免疫。在第一次免疫8周后然后在4周间隔内对兔子进行取血。在ELISA测试中监视肽特异性和rFeld1特异性抗体的诱导。ELISA板(NuncMaxisorb,Denmark)以rFeld1(0.5吗/孔)进行包被，洗涤并封闭。然后用1:1000稀释的兔子抗血清和相应的兔子免疫前血清以两次重复的方式对板上所结合的rFdd1进行探测，以1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗-兔子抗血清(JacksonImmunoResearchInc.,USA)对所结合的IgG进行探测。计算两次重复的平均值，显示出小于5%的误差。以源自Feld1的合成肽进行的免疫诱导了与Feld1反应的IgG抗体。以五个源自Fdd1的合成肽中的每个进行第一次免疫八周之后，可在五个兔子抗血清中的每个里面检测到与完全Feld1变应原反应的IgG抗体。在接下来的取血中IgG抗体水平保持了相当的水平(图16)。抗-肽1、抗-肽2、抗-肽4和抗-肽5兔子抗血清在与抗-Feld1兔子抗血清大约相同的程度上表现出对Feld1的IgG反应活性。抗-肽3兔子抗血清也表现出明显的但有些低的对Feld1的IgG反应活性。这表明所有的5个源自Feld1的合成肽均为诱导Feld1特异性IgG抗体反应的候选分子。,嚴^fe/游^^g,诱导MFe/d/麥谅游沐^潜jn应所需要的用于改善的SIT的候选分子不仅提供减少的IgE介导的副作用的优点，而且有减少的T细胞介导的副作用的优点。为了研究源自Fddl的合成肽的T细胞激活特性，进行了淋巴增殖测试。通过Ficoll(AmershamPharmaciaBiotech,UK)密度梯度离心从7个猫过敏性病人中分离了PBMC。以三次重复方式在96孔板(Nimclone,NalgeneNuncInternational,Denmark)中在37。C下5%C02加湿的空气中以200pi的无血清UltraCulture培养液(Cambrex,Belgium,培养液以2mML-谷氨酸(Sigma,USA),50(iM卩-巯基乙醇(Sigma)和每毫升0.1mg的庆大霉素(SIGMA)补充)来培养PBMC(2xl05)。以不同浓度(5、2.5、1.25和0.6昭/孔)的rFeld1和源自Feld1的合成肽作为单独成分或作为等摩尔混合物以及用作对照目的的4U白细胞介素-2或单独的培养液来刺激细胞。培养6天后每孔加入0.5|iCi的31€-胸苷(AmershamPharmaciaBiotech)，16小时后使用微贝塔闪烁计数器(WallacADL,Germany)通过液体闪烁计数来测定所引入的放射活性，从三次重复计算出平均cpm。从抗原或白细胞介素-2刺激与未刺激的对照所获得的cpm的商作为刺激指数(SI)。IL-2刺激了来自所测的所有7个猫过敏性病人的PBMC的增殖，产生的刺激指数对RR为9.8，对EB为5.2，对KC为3.2，对MG为6.7，对SM为6.3，对RA为15.7以及对AR为13.9。源自Fddl的合成肽诱导了较低的刺激指数(表9)。表9:可鉴定源自Feld1的合成肽(基于等摩尔)诱导了比Feld1较弱的淋巴增殖反应。以系列稀释的rFdd1或源自Feld1的合成肽作为单独成分对来自771个猫过敏性病人的PBMC进行刺激。以刺激指数显示特异性淋巴增殖反应。5fig/w2.5ng/w1.25pg/w0.6fig/w病人RRrFeld12.61.81.51.9肽l1.90.61.31.5肽22.11.32.01.6肽33.52.82.03.0肽42.52.41.50.8肽51.70.92.30.7病人EBrFeld18.22.91.61.5肽l1.30.91.01.2肽22.41.71.81.6肽31.11.21.41.7肽43.63.63.22.3肽52.22.11.42.1病人KCrFeld10.81.21.35.2肽l0.71.01.11.1肽21.21.51.01.1肽30.60.50.50.6肽41.61.41.31.1肽51.3L40.91.4病人MGrFeld12.92.32.32.2肽l1.81.41.41.1肽21.21.31.40.9肽31.10.50.60.7肽4U1.51.81.0肽51.51.21.60.8病人SMrFeld12.31.61.81.1肽l1.11.00.81.0肽21.81.11,31.2肽32.62.12.11.5肽41.91.61.71.1肽52.31.31.41.0病人RArFeld13.21.22.41.2肽l0.80.71.31.1肽21.20,51.71.6肽32.02.31.60.9肽43.01.3Ll0.6肽50.40.60.90.9病人ARrFeld11.40.60.91,0肽l1.00.51.70.7肽20.70.60.90.6肽31.61.62.11.0肽41.00.70.70,6肽50.80.50.30.5实窗翔"，"jr^^/w游^成嚴兗疫,遂导游/gG^沐渐叙漱过敏丝嫁乂游诚与赵i^/w变应厕兹合在ELISA竞争测试中检测了肽诱导的兔子Ig抑制过敏性病人的IgE抗体与完全rFeld1结合的能力。ELISA板(NuncMaxisorb，Denmark)以rFeld1(0.05昭/孔)进行包被，洗涤并封闭。然后以1:100稀释的兔子抗-肽抗血清(使用了单独的抗-肽抗血清以及抗-肽抗血清的混合物)、兔子抗-rFeld1抗血清和用于对照目的的相应的兔子免疫前血清对板上所结合的rFdd1进行预温育。在对板进行洗漆后，以1:5稀释的来自猫过敏性病人的人血清对它们进行温育。以1:2500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-人IgE抗体(KPL,USA)来检测所结合的IgE。按照如下计算经抗-肽抗血清预温育而达到的对IgE结合的抑制百分率IgE结合的％抑制=100-O.DVO.D.px100，其中O.D.!为以兔子免疫血清预温育后所测的光密度，O.D.p为兔子免疫前血清预温育后所测的光密度。以5个抗-肽兔子抗血清预温育ELISA板上所结合的Feld1产生的抑制图谱在所测的来自猫过敏性病人的14个不同血清中有差别。抗-肽1兔子抗血清阻断了所测的13/14个病人的血清IgE与Feld1的结合，抗-肽2兔子抗血清阻断了8/14个，抗-肽3兔子抗血清阻断了13/14个，抗-肽4兔子抗血清阻断了9A4个，抗-肽5兔子抗血清阻断了5/14个。在不同的抗血清中也显示出抑制程度的差异。在所测的单一的抗-肽兔子抗血清中，抗-肽l兔子抗血清表现出最好的抑制率(从0-55%，平均为29%)。抗-肽2兔子抗血清抑制率可达到0-18%(平均为5%)，抗-肽3兔子抗血清为0-29%(平均为11%)，抗-肽4兔子抗血清为0-24%(平均为8%)，抗-肽5兔子抗血清为0-18%(平均为5%)。所有5个抗-肽兔子抗血清的混合物对所有病人的血清最有效地达到了对病人的IgE与Feld1的结合的抑制，其抑制率为25-84%(平均为59%)。这些抑制甚至比通过用抗-Feld1兔子抗血清预温育而达到的抑制还要显著(表10)。表10:针对源自Feld1的合成肽产生的兔子抗血清抑制人IgE与Feld1的结合。显示了14个病人中通过用兔子抗血清预温育Feld1而达到的对IgE与Feld1结合的抑制百分率(作为平均值)。预温育以5个针对源自五个Feldl的合成肽产生的兔子抗血清(抗-肽1至5)、5个抗-肽抗血清的混合物(Mix)和一个针对Feld1产生的抗血清(抗-rFeld1)进行。5个抗-肽病人抗-肽l抗-肽2抗-肽3抗-肽4抗-肽5抗血清的抗rFeldl混合物1481829201878642240800674335511517884744387112486649510551205448633012506846761105058458443171006053926171215165343100010003126113800005256124702207755]132728005641141606502525平均29511845947当把抗-肽1兔子抗血清与每个其他的抗-肽抗血清组合起来时，对过敏性病人的IgE结合的抑制显著性增高，几乎达到(例如，抗-肽1+4:41%，抗-肽1+5:42%)用抗-rFeldl抗体所得到的值(67%)(表ll)。表11:病人抗-肽l+抗-肽2抗-肽1+抗-肽3抗-肽1—卜抗-肽4抗-肽l+抗-肽5抗-rFeld11614961637522417282874360526257864433343406851792730676372442467372621363474851465355729402846436110161130344011453547457812524056597613291729326214710141628平均3628414267禁,^a^房,应载沐游r潘應表泣游r潘蘑麥励游,^v7游,诱导vi錄^丝/gGf应#磁》、S"vJ^#丝7潘應潜裙已经表明源自Betvl的、表面暴露的B细胞肽在小鼠治疗和预防性疫苗接种模型中诱导保护性的Betv1特异性IgG反应(FockeM等人ClinExpAllergy(2004)34:1525-1533)。在FockeM等人(2004)中，在免疫小鼠前将6个源自Betv1的肽偶联至载体分子KLH。在本实施例中表明这些肽所诱导的Betv1特异性IgG反应(表l)是由源自载体的而不是源自Betvl变应原的T细胞表位的帮助所驱动。令人惊奇地发现任何一个具有以下序列的源自Betvl的肽均未诱导相关的T细胞反应LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF(SEQIDNo.20),GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN(SEQIDNo.21)和VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK(SEQIDNo.22)。这可以证明大多数T细胞反应为针对载体分子KLH(图18和19)。这个发现对于减少治疗性疫苗接种中的副作用和减少预防性疫苗接种中潜在的致敏风险具有重要意义。过去已经证明源自变应原的肽缺少任何IgE反应活性，但是由于T细胞激活而含有源自变应原的T细胞表位诱导的副作用。源自变应原的肽缺少IgE和T细胞反应活性，如Betv1肽所例示，在治疗性疫苗接种中既没有诱导IgE介导的也没有诱导T细胞介导的副作用。当用于预防性疫苗接种时，该肽将诱导Betvl特异性的保护性IgG反应而不预先准备好Betv1特异性T细胞。这将最小化通过疫苗接种而预先准备好免疫反应(其可为接下来的过敏性致敏铺好道路)的风险。在本实施例中，在治疗性和预防性变应原疫苗接种小鼠模型中变应原性和载体特异性T细胞反应是分开的。选取了源自Betv1的肽2、3和6(FockeM等人(2004))并且在BALB/c小鼠中测试了它们是否含有任何已知的Betv1特异性T细胞表位。按照如下对小鼠进行免疫(表10显示了致敏和处理程序)以10吗重组Betv1(Biomay,Austria)和/或合成的源自Betv1的肽2、3禾B6的混合物(每个10pg)来免疫BALB/c小鼠组(n=5)。如前所述将肽偶联至KLH(FockeM等人(2004))。为了进行免疫，把Betv1和肽混合物吸附至氢氧化铝(Alu-Gd-S,Serva,Germany)，总体积为150(il/小鼠。表12:致敏和处理程序致敏治疗组(n=5)(rBetv1)(肽KLH)无致敏/无治疗(S-/T-)致敏/无治疗(S+/T-)无致敏/治疗(S-/T+)致敏/治疗(S+/T+)无预防/致敏(P-/S+)预防/无致敏(P+/S-)预防/致敏(P+/S+)第0、20、40天--第60、80、100天第0、20、40天第60、80、100天致敏(rBetv1)第60、80、100天第0、20、40天--第0、20、40天第60、80、100天预防(肽KLH)在T细胞增殖测试中分析了变应原特异性、肽特异性和载体特异性淋巴增殖。在无菌条件下取出脾脏并匀浆。对红血球进行裂解后，洗涤细胞并重悬于完全培养液(RPMI,10%胎牛血清，O.lmg/ml庆大霉素，2mM谷氨酸)。将单细胞悬浮液以2x105细胞/孔植板于96孔圆底板并以作为阳性对照的concavalinA(0.5ng/孔)、rBetvl(2吗/孔)、KLH(2pg/孔)、肽混合物(0.34吗每种肽/孔)或单独的培养液刺激4天。以0.5)iCi/孔含氚胸苷进行脉冲16小时并收集。由闪烁计数来测定增殖反应。计算了抗原和培养液对照剌激后的平均增殖比率值，即刺激指数(SI)。有趣的是，可以显示出与致敏但未治疗的组8+/丁-相比，Betv1致敏小鼠(S+ZT+组)中以源自Betv1的肽进行的治疗性疫苗接种能够减少Betv1特异性增殖。在致敏和处理组中，未检测到肽特异性增殖，但是根据载体效应，观察到了KLH特异性增殖。单独的肽疫苗(SVT+组)主要诱导了KLH特异性T细胞，但几乎没有Betvl特异性T细胞反应(图18)。与Betv1致敏组PVS+相比，以肽进行的预防性疫苗接种几乎没有诱导Betv1特异性增殖(P+ZS-组)，但是有KLH特异性增殖。在进行预防性疫苗接种然后致敏的小鼠(P+ZS+组)中，Betv1特异性增殖显著地减少，而且，没有在任何小鼠组中观察到肽特异性反应(图19)。因此，可以显示在过敏症小鼠模型中，以结合至载体的源自变应原的B细胞肽进行的预防性疫苗接种没有预先预备肽特异性T细胞，几乎没有变应原特异性而只有载体特异性T细胞。在过敏性致敏以及治疗性疫苗接种之前对小鼠进行的预防性疫苗接种减少了变应原特异性T细胞增殖。以源自Betv1的肽进行的预防性处理(而无Betv1特异性T细胞的帮助)诱导了Betv1特异性IgG反应。而且，预防性处理增加了Betv1特异性IgG反应(已经由Betv1变应原在第一次致敏20和40天诱导)(图20)。这些结果证明肽疫苗诱导了可被变应原暴露所推进的Betv1特异性IgG反应。寞遞W";表观忠减少游/g五兹合潔力游Jf^DgrP2游嚴使用根据表13所述的肽和遭受屋尘螨过敏症个体的血清按照实施例15.1和20.1对源自Derp2的肽的IgE结合能力进行了确定。表13:源自Derp2的肽肽位置序列SE(JIDNo.Derp2肽11-33DQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK%Derp2肽221-51CHGSEPCIIHRGKPFGLEAVFEANGNSKTAK97Derp2肽342-73EANQNSKTAKIEIKASIEGLEVDVPGIDPNAC98Derp2肽462-103EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN99Derp2肽598-129APKSENVVVTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD100结果清晰地显示本发明的源自Derp2的肽表现出显著性减少IgE结合的能力。表14:结果rDerp2肽l肽2肽3肽4肽5平均(n=50)1,0800,0100,0150,0040,0310,006—实'嚴树26:嚴长度殷变存成厥游/w祭会虔力、r邻應i座舒丝教免,嚴丝贿做26.1.肽的设计为了研究肽长度变异对IgE结合能力、T细胞反应活性和免疫原性的效应，通过几个氨基酸来增加肽l(Pl)的长度和减少肽2(P2)的长度而设计了源自Phlp5的肽的变体(表15)。表15:合成的源自Phlp5的肽(1，2)及其变体(la，2b)的位置、序列、氨基酸数目的长度和分子量表15:源自PHLp5的合成肽的变体aa位置序列aa数目分子量(MW)肽198-128CGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK3230261393-128CFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK373592肽226-58ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKC3430682b26-53ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAC2926447726.2.缺少IgE反应活性为了分析源自Phip5的肽1、2及其变体la、2b的IgE反应活性，使用0.2吗的肽/点和来自7个草花粉过敏性病人(pl-p7)和1个来自非过敏性个体(NHS)的血清进行了点杂交测试。所结合的IgE以125I标记的抗-人IgE(Phadia,Uppsala,Sweden)进行检测。rPhlp5用作阳性对照，HSA用作阴性对照。病人与rPhlp5但不与肽和肽变体(图21)反应。26.3.淋巴增殖反应以不同浓度的源自Phip5的肽1、2及其变体la、2b和用于对照的rPhlp5刺激来自2个草花粉过敏性病人的PBMC。由肽所获得的刺激指数显著性较低于由rPhlp5所获得的(图22)。26.4.肽变体的免疫原性以KLH偶联的源自Phip5的肽及其变体对兔子进行免疫。使用ELISA实验来测定所获得的兔子抗血清对肽及其变体的IgG反应活性(表16)。以肽及其变体进行免疫诱导了交叉反应性的能识别肽及其相应变体的IgG抗体。表16:在兔子中经以KLH偶联的肽免疫而产生的抗-Phlp5肽抗血清的交叉反应活性。显示了肽抗血清对肽(1，2)和变体(la,2b)的IgG反应活性。用免疫前血清未观察到反应活性(prePI,prePla,preP2,preP2b)。a.抗肽1抗血清(抗P1)与肽1变体(la)交叉反应，抗肽la抗血清(抗Pla)与肽1交叉反应。b.抗肽2抗血清(抗P2)与肽2变体(2b)交叉反应，抗肽2b抗血清(抗P2b)与肽2交叉反应。表16:兔子抗血清的交叉反应活性<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>26.5.肽诱导的兔子抗血清抑制草花粉过敏性病人的IgE与rPhlp5的结合在竞争性ELISA中研究了兔子抗-肽2和2bIgG的抑制人IgE与rPhlp5结合的能力。ELISA板以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phip5抗血清进行预温育。然后将板暴露于来自12个草花粉过敏性病人的血清。在表17中显示了对IgE与rPhlp5结合的抑制百分率。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE与rPhlp5的结合。也以兔子抗肽1和la抗血清进行了竞争性ELISA。在实施例17中(以源自Phlp5的肽进行免疫诱导了IgG抗体，其抑制了草花粉过敏性病人的IgE与Phlp5的结合)抗肽l(PO抗体抑制了病人的IgE与Phlp5的结合(其平均抑制率为28.5%)。使用抗肽la抗血清获得了相似的结果(其抑制百分率为23.7%)。表17:抗肽抗血清对病人的IgE与rPhlp5结合的抑制。抗肽2和抗肽2b抗血清在相同程度上抑制病人的IgE与rPhlp5的结合。ELISA板上所结合的rPhlp5以抗P2、抗P2b和用于对照目的的抗Phip5抗血清进行预温育。然后将板暴露于来自12个草花粉过敏性病人的血清。显示了对IgE与rPhlp5结合的抑制百分率。表17:对lgE结合的。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实蕭27;恭m雄舰！靜人类鼻病毒包含超过一百种不同的株。在这个中和测试中显示一种株的鼻病毒感染也可被另一种株的VP1特异性抗体所抑制。以等密度将HeLa细胞铺种于孔中。100TCD50HRV14以抗-14VPl和抗-89VPl抗体(未稀释的；1:2-1:32孑L1-6)进行预温育并分别加入到行A和D的孔中。把用抗-14VPl和抗-89VPl分别预温育的100TCD5oHRV89加入到行B和C的孔中。3天后活细胞染成紫色。抗-89VP1抗体和抗-14VPl抗体以相互可比较的方式阻断了HRV14的感染。针对14VP1和89VP1产生的抗体也在相同浓度上抑制了HRV89的感染。权利要求1、一种低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或结合。2、根据权利要求l所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个低变应原性分子与所述至少一个另一个蛋白或其片段的N-末端和/或-C末端融合。3、根据权利要求1或2所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个另一个蛋白是病毒，特别是RNA或DNA病毒、细菌、真菌或原生动物蛋白。4、根据权利要求3所述的低变应原性蛋白，其特征为该病毒蛋白是衣壳蛋白。5、根据权利要求3或4所述的低变应原性蛋白，其特征为该至少一个病毒蛋白源自人类致病性病毒，优选为微小核糖核酸病毒科家族的病毒。6、根据权利要求5所述的低变应原性蛋白，其特征为该微小核糖核酸病毒科家族的病毒为鼻病毒种，优选为人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89和14。7、根据权利要求1至6任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为变应原选自主要桦树花粉变应原特别是Betv1和Betv4、主要牧草花粉变应原特别是Phip1、Phip2、Phlp5、Phlp6和Phlp7、主要屋尘螨变应原特别是Derp1和Derp2、主要猫变应原Feldl和Feld2、主要蜜蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白特别是Phlpl2、橄榄树变应原特别是01eel、墙草变应原特别是Parj2、豚草变应原特别是Amba1、艾蒿花粉变应原特别是Artv1或储藏室尘螨变应原特别是Lepd2。8、根据权利要求1至7任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该低变应原性分子表现出减少的IgE结合能力。9、根据权利要求1至8任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该低变应原性分子表现出减少的T细胞反应活性。10、根据权利要求1至8任一项所述的低变应原性蛋白，其特征为该变应原片段由下列氨基酸组成Phlp1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phip5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，Feld1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Feld1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Betv1的30至59、50至79或75至104位氨基酸，Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或卯至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Feld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canf1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amba1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350或356至396位氨基酸，Alta6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。11、编码如权利要求1至IO任一项所述融合的低变应原性蛋白的核酸分子。12、包含如权利要求ll所述核酸分子的载体。13、根据权利要求12所述的载体，其特征为所述载体为表达载体。14、根据权利要求12或13所述的载体，其特征为所述载体为细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。15、一种包含如权利要求11所述核酸分子或如权利要求12至14任一项所述载体的宿主。16、一种针对如权利要求1至IO任一项所述低变应原性蛋白的抗体。17、根据权利要求16所述的抗体，其特征为所述抗体是单克隆或多克隆抗体。18、一种包含如权利要求1至10任一项所述低变应原性复合物或如权利要求16或17所述抗体的疫苗制剂。19、根据权利要求18所述的制剂，其特征为所述制剂还包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。20、根据权利要求18或19所述的制剂，其特征为所述制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5吗至200吗的所述低变应原性蛋白或抗体。21、根据权利要求1至10任一项所述的低变应原性蛋白或根据权利要求16或17所述的抗体在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物的用途。22、根据权利要求21所述的用途，其特征为所述药物还包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。23、根据权利要求21或22所述的用途，其特征为所述药物用于主动或被动免疫。24、根据权利要求21至23所述的用途，其特征为所述药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5吗至200吗的所述低变应原性蛋白或抗体。25、根据权利要求21至24任一项所述的用途，其特征为该药物以0.01mg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。26、根据权利要求1至10任一项所述的低变应原性复合物或根据权利要求16或17所述的抗体在诊断个体中的过敏症和/或病毒感染中的用途。27、来自微小核糖核酸病毒科家族的病毒的病毒衣壳蛋白作为载体在药物或疫苗中的用途或用于诊断病毒感染，特别是普通感冒的用途。28、根据权利要求27所述的用途，其特征为该病毒是人类鼻病毒种，特别是人类鼻病毒89或14。29、一种源自Phip5的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾，与野生型Phlp5相比表现出减少的IgE结合能力。30、根据权利要求29所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应活性。31、根据权利要求30所述的分子，其特征为所述截尾的Phip5由Phip5的93至(128，98至128、26至53、26至58、252至283位氨基酸或其序列变体组成。32、根据权利要求29所述的分子，其特征为所述截尾的Phip5由Phip5的132至162，217至246、176至212位氨基酸或其序列变体组成。33、一种源自Feld1的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表现出减少的IgE结合能力。34、根据权利要求33所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应活性。35、根据权利要求33或34所述的分子，其特征为所述截尾的Feld1由Feld1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Fdd1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列变体组成。36、一种源自Derp2的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表现出减少的IgE结合能力。37、根据权利要求36所述的分子，其特征为该截尾分子表现出减少的T细胞反应活性。38、根据权利要求36或37所述的分子，其特征为所述截尾的Derp2由Derp2的1至33、21至51、42至73、62至103、98至129位氨基酸或其序列变体组成。39、一种源自Derp7、Derp21、克隆30、Altal、Parjl、Oleel、Feld2、Canfl、Canfl、Artvl、Ambal、Alta2或Alta6的低变应原性分子，其具有C-和/或N-末端截尾并表现出减少的IgE结合能力及任选地表现出减少的T细胞反应活性，优选地由Derp7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Derp10的卜35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Derp21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，克隆30的1至32、15至48或32至70位氨基酸，Alta1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Parj2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Olee1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Feld2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Canf2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Canfl的19至56、51至卯、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Artv1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amba1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300305至350或356至396位氨基酸，Alta6的l至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alta2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。40、一种包含至少两个根据权利要求29至39任一项所述的表现出减少的IgE结合能力及任选地表现出减少的T细胞反应活性的低变应原性融合蛋白。41、根据权利要求40所述的融合蛋白，其特征为如果至少两个分子源自相同的变应原，则这些分子以不同于野生型变应原中片段顺序的顺序与彼此相融合。42、一种编码如权利要求29至39任一项所述的低变应原性分子或如权利要求40或41所述的融合蛋白的核酸分子。43、一种包含如权利要求42所述核酸分子的载体。44、根据权利要求43所述的载体，其特征为所述载体是表达载体。45、根据权利要求43或44所述的载体，其特征为所述载体为细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。46、一种包含如权利要求18所述核酸分子或如权利要求43至45任一项所述载体的宿主。47、一种针对如权利要求29至39任一项所述低变应原性分子或如权利要求40或41所述融合蛋白的抗体。48、根据权利要求47所述的抗体，其特征为所述抗体是单克隆或多克隆抗体。49、一种包含如权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、如权利要求40或41所述融合蛋白或如权利要求46或47所述抗体的疫苗制剂。50、根据权利要求49所述的制剂，其特征为所述制剂还包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。51、根据权利要求49或50所述的制剂，其特征为所述制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5吗至200吗的所述低变应原性分子或抗体。52、根据权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、根据权利要求40或41所述融合蛋白、根据权利要求42所述核酸分子、根据权利要求43至45任一项所述载体或根据权利要求47或48所述抗体在制备用于治疗或预防个体中过敏症的药物的用途。53、根据权利要求52所述的用途，其特征为所述药物还包含至少一个佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。54、根据权利要求52或53所述的用途，其特征为所述药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，特别地，0.5吗至200叫的所述免疫原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。55、根据权利要求52至54任一项所述的用途，其特征为该药物以O.Olmg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1mg/kg体重至2mg/kg体重的数量向个体使用。56、根据权利要求52至55任一项所述的用途，其特征为所述个体具有患过敏症的风险。57、根据权利要求29至39任一项所述低变应原性分子、如权利要求40所述融合蛋白、或如权利要求47或48所述抗体在诊断个体中的过敏症或监视过敏症治疗过程中的用途。全文摘要本发明涉及低变应原性蛋白，其由至少一个源自变应原的低变应原性分子组成，该低变应原性分子与至少一个另一个非变应原性蛋白或其片段融合或结合。文档编号C07K19/00GK101466738SQ200780021374公开日2009年6月24日申请日期2007年6月11日优先权日2006年6月9日发明者B·林哈特,H·格伦隆德,I·斯达博达,J·廷霍费尔,K·韦斯特尼,M·福克-泰克尔,M·范哈格,P·瓦伦特,R·瓦伦塔,R·赖宁格,S·弗塔拉,S·斯皮茨约,T·波波夫-克劳普申请人:碧欧美公司