一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位 疫苗。
【背景技术】
[0002] 2010年春季在我国华东、华南地区少数鸭群首次出现一种新发疾病，该病主要引 起鸭群采食量和产蛋大幅下降、卵巢出血、神经症状等，因此初期该病又称为鸭出血性卵巢 炎、产蛋下降综合征等。随着引起该病的病毒分离及对病原全基因的解析，目前该病又命名 为鸭坦布苏病毒，定位于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒的恩塔亚病毒群。
[0003] 鸭坦布苏病毒为单股正链RNA病毒，基因组10990bp，其中95-10278bp为ORF区 域，编码3个结构蛋白（衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E)和7个非结构蛋白（NS1、NS2a、 NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，利用NSl基因序列建立进化树，其与黄病毒属恩塔亚病毒群和 乙型脑炎病毒群的同源性在63%-71%之间。该病侵染蛋鸭(绍兴鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、金定 鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭等)、肉鸭(樱桃谷鸭、北京鸭等）和野鸭种鸭。受感染鸭群里的鸭 几乎全部发病，死亡率为5%-30%不等。
[0004] 据不完全统计，在蛋鸭和肉鸭主产区，约有1. 2亿只蛋鸭和1500多万只肉鸭发病， 累计经济损失超过50亿元。作为新发病毒，目前尚无商业化的鸭坦布苏病毒疫苗进行防 控。黄病毒属中，其包膜蛋白E具有高免疫原性，并能引起强烈和持久的免疫反应，黄病毒 属的包膜E蛋白按其空间结构可分为DomainI、DomainII和DomainIII三个结构域，其 中DomainIII结构域是病毒与细胞表面受体的结合位点。Chu等构建了表达西尼罗病毒E 蛋白结构域III的重组质粒，并以腹腔注射途径免疫BALB/C小鼠，同时辅以寡脱氧核苷酸 (CpG-DNA)作为佐剂，3周后，免疫的小鼠可产生高滴度的西尼罗病毒中和抗体。培养免疫 西尼罗病毒E蛋白DomainIII和CpG的小鼠脾细胞，发现可分泌大量的IFN-Y和IL-2,并 引起T细胞增殖。实验结果表明，辅以佐剂CpG免疫西尼罗病毒E蛋白DomainIII可使小 鼠产生抗西尼罗病毒的Thl型免疫应答，对预防西尼罗病毒感染起到了潜在的免疫保护作 用。
[0005] 因此E蛋白是研究最广泛应用的抗原蛋白，可作为黄病毒亚单位疫苗和DNA疫苗 的候选蛋白。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，即通过生物软件预 测分析鸭坦布苏病毒E蛋白的主要抗原表位，通过筛选、拼接等技术获得一个新型融合蛋 白DE，并以该蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。
[0007] 本发明首先提供一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE，其编码蛋白的氨基酸序列为 SEQIDNO:1 ; 上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQIDNO:2 ; 本发明还提供一种鸭坦布苏病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的鸭坦 布苏病毒蛋白DE，其浓度为0. 1-0. 5mg/ml之间； 本发明的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下： 1) 将鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒； 2) 将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE 的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭坦布苏病毒DE蛋白； 3) 对重组表达的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
[0008] 本发明利用pET28a( + )表达性载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE 的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 20kD重组目的蛋白。将重组 蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫14日龄樱桃谷肉鸭，免疫后可使鸭群获得免 疫保护。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0010] 实施例1鸭坦布苏病毒新型融合蛋白DE基因的获得 利用生物软件DNAStar对鸭坦布苏代表毒株ZJ-6 (GenBank登录号JF459991. 1)的 包膜蛋白E进行抗原表位分析，选定E蛋白抗原性较强N端部分（61-138aa)与C端主要 DomainIII部分（322-408aa)序列进行拼接，中间设计Lingker(GGGS)进行连接，获得一种 新型融合蛋白DE，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO: 1，并利用在线生物软件DMWorks 进行大肠杆菌稀有密码子优化，获得融合蛋白DE的核苷酸序列SEQIDN0:2。
[0011] 将新获得的融合蛋白DE的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上BamH I和HindIII酶切位点。
[0012] 实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得 1、上述扩增得到的新型融合蛋白DE基因用BamHI和HindIII双酶切后连入pET28a载体相应的酶切位点，构建pET28a/DE表达载体。
[0013] 2、用CaCl2法将pET28a/DE表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50iig/ ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamHI和HindIII 双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培 养至0. 6?0. 8时加入0. 8mMIPTG诱导4?5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时 设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在20kD处多出一条蛋白条带，与 重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30%以上。经鸭坦布苏抗体免疫印迹检定，显示阳性 反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌。
[0014] 实施例3发酵、纯化与鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的制备规程 1菌毒种 1.1制造用菌种为鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗生产菌株；检测用的强毒株为 鹅源坦布苏SD株。
[0015] 1.2生产用菌种标准 I. 2. 1形态和生化特性 含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白 色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡 萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP_，枸橼酸利用试验_。
[0016] 1.2. 2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。
[0017] 1.2.3鉴别检验 1. 2. 3.IPCR检测将本菌的LB液体培养物3ill做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出438bp左右的片段。
[0018]Pl:5' -CACCGAATCTCGTTGCCC-3' P2 : 5 ' -CGGATCTGACCTTTGCCA-3' 扩增的条件如下：94°C5min变性，94°C30S，55°C30S，72°Clmin，30 个循环，72°C延 伸lOmin。 1. 2. 3. 2Western-blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml含 有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至0D_值在0. 6?I. 0之间时加入0. 8mM的IPTG诱 导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重悬后高压匀质破碎，8000r/min离心去沉淀，上清 液与抗鸭坦布苏病毒阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。
[0019] 1.2. 4纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。
[0020] 1.2.5基础种子代次F5~F8代。
[0021] 1.2.6保存冻干菌种，_20°C，保存期为2年。