生物活性玻璃复合聚乳酸的蛋白、多肽缓释微球及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明是一种新型的生物活性玻璃复合聚乳酸的蛋白、多肽缓释微球及其制备方法，主要涉及医药领域。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有35种重要治疗药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用DNA重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。但这些药物在胃肠道内稳定性差，易变性，易被消化酶降解，不易吸收。影响了它们口服给药的生物利用度，目前蛋白质类药物大多采用注射方式给药，因此如何减少注射次数/提高药效成为蛋白、多肽类药物注射给药面临的一个主要问题。
目前多肽、蛋白质类药物常用的剂型是注射用溶液剂或冻干粉针剂，多肽类药物在血液中的半衰期一般很短，静脉注射后很快就被清除或降解，因此需要经常给药，给病人带来较多不便。因此，开展多肽、蛋白质类生物大分子药物缓择或控释制剂的研究已成为该类药物制剂研究的热点。目前研究最多的是微粒递释系统，即采用生物可降解聚合物为囊材包裹多肽、蛋白质药物制成微球制剂，使其在体内达到缓择或控程目的。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)以其良好的生物相容性及生物降解性被美国FDA批准为药用高分子材料。现已有数个多肽类药物长效注射微球产品批准上市，如曲普瑞林、丙氨瑞林、醋酸戈舍瑞林、奥曲肽此类微球制剂能使药物延长释放达I个月，甚至3个月。因此，以生物可降解聚合物为囊材的微囊化技术是开发研制多肽缓、控释剂型的有效途径，颇具发展前景。
[0003]目前国内、外将蛋白、多肽类药物制成缓释微球的研究报道较多(ManishDiwanet al，Internat1nal Journal of Pharmaceutics, 252(1-2)，111-122;Jintian He etal, Internat1nal Journal of Pharmaceutics, 416(1)，69-76;)又例如在中国发明专利(公开号CN101536984A)-注射用重组人血管内皮抑制素多孔缓释微球及其制备方法中公开了一种以可生物降解乳酸-羟基乙酸聚合物为基质的，包括重组人血管内皮抑制素和致孔剂的注射用多孔缓释微球及其制备方法，该方法可以使重组人血管内皮抑制素在体内缓慢释放，并且可以通过致孔剂造成的表面多孔结构达到药物的完全释放目的。但由于微球释放过程中聚乳酸类材料降解产生的低PH值微观环境，使蛋白类药物降解、失活。能够成功保持蛋白类药物在微球制备工艺及体外释放过程中的生物学活性并进行体内研究的报道很少，目前唯一上市的蛋白类缓释注射微球是美国Genentech，Inc公司采用低温喷雾提取法开发的重组人生长激素PLGA微球(Nutropin Depot?)。然而使用这种方法需要相应的设备，样品需要量大，成本高，难于推广，并且这种方法只能改善保持蛋白在缓释微球制备过程中活性的保持，还不能实现长期释放过程的蛋白的活性保持，美国Genentech，Inc公司已经于2004年停止该产品的生产和销售。
[0004]目前国内、外也有向聚乳酸类生物降解微球中加上Mg(0H) 2等碱性颗粒的研究。有研究发现在聚乳酸类生物降解微球中加上Mg(OH)2等碱性颗粒.模型药物BSA的聚集情况得到改善，蛋白失活情况得到了改善(Zhu G et a I, Pharm Res.2000 Mar; 17(3): 351-357 ；Kang J et al ,B1materials.2002 Jan; 23( I): 239-45.) 0 但在常规向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)2颗粒的制备方法中Mg(0H)2不能全程中和PLGA的降解产物乳酸，只能在微球释放前期起到维持蛋白类药物稳定的作用，在微球释放的中后期，蛋白类药物还是会由于处在低PH值的环境中而易于降解、失活。并且由于不同型号的聚乳酸类生物材料具有不同的降解速度，常规加入Mg(OH)2颗粒的方法，不能同步中和不同型号的聚乳酸类生物材料的降解所产生的低PH微观环境。这样常规向PLGA生物降解微球中加入Mg(OH)2颗粒的制备方法还是难于保持蛋白、多肽类药物在储存和释放过程中的稳定性。
[0005]生物活性玻璃(B1glass)是20世纪60年代由Larry Hench教授发明的基于Na2〇-CaO-S12为主体的透明生物活性材料，在其植入体内后，接触体液后，可以在材料界面诱发特殊的生理响应，缓慢形成具有碱性基团的碳酸羟基磷灰石(速率受Na2O-CaO-S12比例影响)，可引起组织间特殊生物反应从而导致移植材料与骨组织之间的成骨，能够帮助骨组织以更快的速度再生和修复。经过20多年的前期基础及性能的完善，在90年代经美国食品及药品监督管理局(FDA)正式批准应用于骨、齿科临床，用于修复因各种原因导致的骨缺损，并取得良好的治疗效果。目前国内、外生物活性玻璃作为一种重要的医学材料已经广泛应用于生物医学等领域。但目前尚未有将生物活性玻璃应用于蛋白类缓释注射微球制备的研究。
【发明内容】
[0006]本发明为了提高蛋白、多肽类药物在储存和释放过程中的稳定性采用的技术方案是:采用乳化溶剂挥干的方法制备生物活性玻璃复合的蛋白多肽类聚乳酸类缓释微球体系。并在传统微球制备方法的基础上，添加生物活性玻璃，通过调整生物活性玻璃的组成的比例，达到与PLGA近似于同步的降解速率，通过碳酸羟基磷灰石的缓慢形成来中和PLGA缓慢降解过程中产生的低PH，从而同步提高蛋白、多肽类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。
[0007]本发明主要包括主药(蛋白或多肽类药物)、生物活性玻璃、表面活性剂，聚乳酸类生物医学材料等其它辅料组成。其中按重量份计，蛋白或多肽类药物5?30份，聚乳酸类生物降解材料30?90份，生物活性玻璃5?50份。
[0008]所述的蛋白、多肽类药物，包括但不局限于以下蛋白、多肽类药物:溶菌酶、牛胰岛素、人胰岛素、骨胶原形成蛋白(BMP)，血管生长因子(VEGF)、醋酸奥曲肽、降钙素、重组人生长激素、醋酸亮丙瑞林、重组人干扰素等。
[0009]本发明所选用聚乳酸类生物医学材料作为缓释材料，包括聚乳酸(PLA)或者PLGA。
[0010]表面活性剂选自吐温40、60，80或者司盘40、60，80。
[0011]生物活性玻璃的S12: CaO: P2O5摩尔比可在26:70:4?70:15:15之间；
本专利还提供制备上述蛋白、多肽类药物缓释微球的制剂的方法，包括如下步骤:
(I)生物活性玻璃的制备
1)取2.98份的浓硝酸与22.35份的乙醇混合均匀，得到溶液I；
2)溶液I加入24.17份的正硅酸乙酯，100rmp预水解30min，得到溶液2;
3)向溶液2中再加入1.7份的P2O5,100rmp搅拌30min，得到溶液3 ； 4)向溶液3中加入17份的四水硝酸钙，100rmp搅拌Ih，充分溶解形成清澈溶胶；
5)将步骤4)中制备好的溶胶倒入烧杯，置60°C烘箱中72h，形成凝胶；
6)将步骤5)中得到的凝胶在130 0C干燥72h;
7)将步骤6)所得凝胶球磨、筛分，并将所得的干凝胶粉在700°C煅烧得到生物活性；
(2)蛋白、多肽缓释微球的制备
1)将蛋白、多肽类药物溶解于水或者缓冲液中，备用；
2)将生物活性玻璃加入到步骤I的水相中，涡旋混匀，作为内水相；
3)将聚乳酸类生物材料用有机溶剂溶解，并加上SpanSO混匀作为有机相，备用;所述的有机溶剂包括二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等；
4 )将步骤2)的内水相加入到步骤3)的有机相中，使内水相和有机相混匀，然后在2000rpm磁力搅拌下得到初乳；
5)将上述初乳，加入到1ml的1%-2%(w/v)的聚乙烯醇水溶液中，在4000-6000rpm的转速下高速搅拌2min，得到复乳；
6)将复乳加入到90ml的0.1%-0.3%(?八)的聚乙烯醇溶液中，在20-40°(:的温度下，在2000-4000rpm的转速下搅拌3-5小时后挥干有机溶剂，离心收集微球，用注射用水洗涤，冷冻干燥，制得蛋白、多肽类药物缓释微球。
[0012]对本领域技术人员来说，在制备生物活性玻璃时，能根据原料的量来调节生物活性玻璃中S12: CaO: P2O5的比例。
[0013]本发明的优点是:在采用乳化溶剂挥干的方法制备蛋白类、多肽类药物缓释微球制备过程中，复合无机生物医学材料-生物活性玻璃，通过调整生物活性玻璃的组成的比例，达到与聚乳酸类生物降解材料近似于同步的降解速率，通过碳酸羟基磷灰石的缓慢形成来中和聚乳酸类生物降解材料缓慢降解过程中产生的低PH，从而同步提高蛋白、多肽类药物在微球储存和释放过程中的稳定性。
【附图说明】
[0014]
图1是根据实施例1制备的溶菌酶无机、有机复合缓释微球的体外释放曲线图。
[0015]图2是根据实施例1制备的溶菌酶无机、有机复合缓释微球的体外释放过程中的活性保持测定图。
[0016]图3是根据实施例1制备的重组人干扰素无机、有机复合缓释微球的体外释放过程中样品的UV⑶图谱。
[0017]图4是根据实施例1制备的重组人干扰素无机、有机复合缓释微球的体外释放过程中样品的FTIR图谱。
[0018]
实施实例
本发明通过以下实施实例作更详细的描述，但不能将其解释为限