专利名称：：利用农杆菌提高大蒜的转化效率的方法及由其制备的大蒜的制作方法利用农杆菌提高大蒜的转化效率的方法及由其制备的大蒜
技术领域：
：本发明涉及利用农杆菌提高大蒜植物体的转化效率的方法以及由该方法制备的大蒜植物体。
背景技术：
：大蒜与洋葱及葱同为百合科作物，在经过漫长的栽培以及体细胞突变后，在全世界范围内选择性地分化为多个地域种(Pooler，M.R.andP.W.Simon.1993.Euphytica68:121-130)。但其遗传变异非常有限。特别是由于不能有性繁殖，因此不能通过基因重组和杂交来培育品种。再者，作为营养繁殖作物，大蒜因感染病毒数量骤降，根据报道，因感染OYDV而减少的大蒜数量达到36-60%(Lotetal.，1994.PlantPathol.43:537-546)。大蒜栽培中存在的问题之一是，除草费功夫，并且在高温期没有适当的除草剂。为了开发大蒜的培育方法、挖掘大蒜的功能性基因，需要开发转化的方法。为了成功地进行转化需要开发出将外部基因导入葱属植物的基因组的详细方法。根据报道，葱属植物转化困难，葱属植物的转化中最常用的方法是利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)禾卩基因枪法。Dommisse等(Dommisseetal.，1990.PlantScience69:249-257)利用根癌农杆菌(11种)、悬钩子土壤杆菌(A.mbi)(1种)、发根土壤杆菌(A.rhizogenes)(6种)从洋葱中确认了根瘤反应和冠瘦瘤生产，因此提示了转化的可能性。最近Eady(Eady，C.C.1995.NewZealandJ.ofCropandHorticulturalScience23:239-250，Eadyetal.,2000.PlantCellRep.19:376-381)禾BZheng(Zhengetal.,2001.MolecularBreeding7,101-115)确认了利用农杆菌在洋葱的合子胚和未成熟胚上进行转化，并且gusA基因可以稳定表达，而Zheng利用坟丘形洋葱即冬葱(shallot)实现了1.95%的转化率。报道转化大蒜的事例已有三件:kondo等(KondoT,H.Hasegawa,andM.Suzuki.2000.PlantCellRep.19(10):989-993)对从原生质体中诱导出的愈伤组织进行农杆菌的转化，确认了gusA的表达;Park等(Park，M.Y.2000.PhDDiss"SeoulNationalUniversity)利用基因枪法导入了对除草剂具有抗性的乙酸乳酸合成酶基因；Zheng等(Zhengetal.,2001.MolecularBreeding7，101-115)利用根癌农杆菌导入BT抗性基因，但是转化效率不高。到现在为止，已开发的除草剂抗性基因有bar、aroA、bxn(PowIesetal.，1997.In:sparksDL(ed)AdvAgron58:57-93)基因。目前，已从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分离出对除草剂具有抗性的bar基因，并用于开发(Thompsonetal.，1987EMBOJ.6(9):25:2516-2523)除草剂抗性作物。据报道，在世界范围内用于商业目的的抗除草剂作物有大豆、玉米、棉花、油菜等，占世界转化作物栽培面积(1亿200万公顷)的68%(JamesC.2006.ISAAAbriefs35-2006.www.isaaa.org)，且以后还会急剧增加。
发明内容本发明是为了满足上述的要求而提出的。本发明的目的是利用农杆菌提高大蒜的转化效率，因此在诱导愈伤组织的培养基的组分和农杆菌和大蒜愈伤组织共同培养时间及培养基的组分以及再分化培养基组分不同的情况下，以研究大蒜转化效率的高低。为了解决上述课题，本发明提供了提加大蒜的转化效率的方法以及用这种方法再生的大蒜植物体。具体方法如下(1)在添加有0.5-2mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和0.05-0.3mg/L的吲哚基乙酸(IAA)的MS培养基上培养7-9周，以诱导产生愈伤组织的阶段；(2)将上述经过诱导产生的大蒜愈伤组织和具有重组植物表达载体的根癌农杆菌在共同培养基上共同培养，以进行转化的阶段；(3)将上述经过共同培养的大蒜细胞接种到添加有抗生素的选择性培养基上培养11-13周，以进行筛选的阶段；以及(4)将上述经过筛选的大蒜细胞接种到再分化培养基上，以进行再分化的阶段。根据本发明提供的大蒜转化的方法可以有效地提高利用农杆菌提高植物体转化效率。图1是转化载体pBmP35sGFPHYR的示意图。图2是转化的大蒜组织表达GFP的图片(A:GFP的瞬时表达；B，C:GFP在愈伤组织12周后的表达)。图3是转化的大蒜的再分化植株。图4是确认转化体中潮霉素基因的PCR分析图(泳道M:lkbDNA梯度分子量标记；泳道P:质粒pBmP35sGFPHYR;泳道N:没有转化的个体；泳道1-13:转化的个体)。图5是使用限制酶对转化的植物体进行DNA分析的结果图(泳道N:没有转化的个体；泳道1-13:转化的个体)。图6是在转化的植物体中GFP表达的图(A:转化的植物体；B:没有转化的植物体的幼胚；C:转化的植物体的幼胚)。图7是对喷施0.5%的草铵磷表现出的除草剂抗性结果(A:没有转化的个体；B:转化的植物体)。具体实施方式为了实现本发明的目的，本发明提供了采用4个如下阶段制备大蒜植物体的方法(1)在添加有0.5-2mg/L的2，4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)和0.05-0.3mg/L的IAA的MS培养基上培养7-9周，以诱导产生愈伤组织的阶段；(2)将上述经过诱导产生的大蒜愈伤组织和具有重组植物表达载体的根癌农杆菌在共同培养基上共同培养，以进行转化的阶段；(3)将上述经过共同培养的大蒜细胞接种到添加有抗生素的选择性培养基上培养11-13周，以进行筛选的阶段；以及(4)将上述经过筛选的大蒜细胞接种到再分化培养基上，以进行再分化的阶段。首先，为了得到植物体细胞胚的愈伤组织，把大蒜的根接种到添加有植物生长调节物质的MS(Murashige&Skoog，MS)培养基上进行植物体细胞胚的诱导。这时的植物生长调节物质有2,4-D和IAA，如在本发明的诱导产生愈伤组织的第(1)阶段中，最好在MS培养基中添加0.5-2mg/L的2，4-D和0.05-0.3mg/L的IAA，其中，2，4-D和IAA的最适的浓度分别是lmg/L和0.2mg/。在所述的(2)阶段中，所述共同培养的时间可以是5-7天，优选为6天。在这里所讲的共同培养的时间是指把大蒜愈伤组织和具有重组植物表达载体的根癌农杆菌进行共同培养以将载体导入到大蒜愈伤组织中的时间。在所述的(2)阶段中，所述共同培养的培养基是添加有0.5-2mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)禾B150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏(chu)培养基，或者是添加有0.5-2mM的MES和150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫苏糖醇(DTT)的1/2chu培养基；其中，优选的培养基是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培养基或者是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2chu的培养基。最优选的培养基是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培养基。在所述的第(3)阶段中，在选择性培养基上培养大蒜细胞11-13周，其中，最优选为12周。所使用的抗生素可以是用于植物重组表达载体抗性基因的潮霉素和卡那霉素等。在所述的第(4)阶段中，所使用的再分化培养基中添加有4-6mg/L的激动素和0.5-2mg/L的萘乙酸(NAA);其中，最优选添加有5mg/L的激动素和lmg/L的NAA。本发明还提供了上述方法制备的大蒜植物体。以下利用实施例详细说明本发明。但是，实施例的目的只是用于说明本发明，本发明并不局限于这些实施例。实验方法1、在培养的植物体中诱导产生愈伤组织以及对植物体进行再分化产生植物体是通过诱导培养在培养基中的大蒜的根所产生的愈伤组织而实现的。为了从根组织中诱导产生愈伤组织，选择适当浓度的2,4-D、IAA和NAA的组合(表l)，培养8周后，从根组织中诱导出愈伤组织。且为了从愈伤组织再分化成植物体，可以选择适当的激动素和NAA的组合(表3)。2、转化以及筛选转化载体是连接有绿色荧光蛋白(GFP)基因和潮霉素基因的bar基因插入在pBm43GW中所形成的pBmP35sGFPHYR载体，所述bar基因连接Pnos启动子和Tnos终止子(图1)。EHA101是农杆菌菌株，且在LB培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)上培养2天后，转移到转化培养基中悬浮培养，将在600nm处的吸光值调整到1.0。将愈伤组织接种到添加有100|_iM的乙酰丁香酮的共同培养基上培养10分钟以上。为了观察不同条件的共同培养基对转化效率的影响，如表2所示，使用了N6(Chuetal.,1975.Sci.Sinica18:659-668)、1/2N6、MS(MurashigeT，F.Skoog,1962.PhysiolPlant15:473-479)、B5(Gamborgetal.,1968.Exp.CellRes.18:434-437)等培养基。且为了观察硫氧化物的影响，在各种培养基中添加以下物质以观察组合的效果，如表2所示，在MS培养基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在N6培养基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在B5培养基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在1/2N6培养基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)、DTT(100mg/L)。共同培养一般是在22。C下暗培养3-6天。在添加25mg/L的潮霉素、100mg/L的万古霉素、200mg/L的头噻孢肟、lmg/L的2，4-D和0.2mg/L的IAA的MS培养基上培养12周。为了有效筛选转化的组织，在显微镜下筛选稳定表达GFP的组织。再分化的植物体在MS培养基上培养4周后通过驯化移栽到温室。3、转化体的分析取0.5g植物体的叶片，用DNAQIAamp试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取植物体的DNA，然后以潮霉素基因的5'端启动子5,-GCTGCGCCGATGGTTTCTACAA陽3，(如SEQIDNo.:l)禾卩3'端终止子5'-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3，(如SEQIDNo.:2)进行PCR，扩增所需的潮霉素基因片段。PCR条件包括在95。C下加热2分钟，然后在以下条件下进行30个循环在92。C下加热30秒，62"C下加热30秒，以及72'C下加热60秒。通过在显微镜下观察GFP的表达来筛选在共同培养期间和继代培养期间转化的愈伤组织和转化的植物体。在驯化10周左右后，在植物体上喷施0.5%的草铵磷来进行生物鉴定，并且对转化的大蒜还进行了DNA分析。首先提取大蒜的基因组DNA，提取方法是取温室里的大蒜植物的叶子2-3g，以Dellaporta等(Dellaportaetal.,1983.AplantDNAminipreparation:version2.PlantMolecularBiologyReporter1,19-22)的方法提取DNA，然后用Nanodrop分光光度计ND-1000)测定它的浓度，接着把25吗/L的各种DNA样品用100单位的///^////进行消化，然后把消化的DNA在1%浓度的琼脂糖凝胶中电泳17个小时(0.5倍的TBE，25V)。DNA通过毛细管作用转移到尼龙1^1)01^1^-:^+膜(AmershamLifescience,英国)上以进行杂交。使用RedyprimellRandomPrimeLabelingSystem(AmershamLifescience,英国)对通过PCR从30ng的bar基因中得到的产物DNA进行标记。杂交和印迹的洗涤按照标准方法进行。为了识别标志，使用了BAS-1800IIBio-Imaging分析仪(FUJIFILM)。实施例1、从培养的植物体的根组织中诱导产生愈伤组织以及对植物体进行再分化从培养的大蒜植物的根组织诱导愈伤组织时，在MS培养基中添加2,4-D和IAA比添加2，4-D和2ip(异戊烯基腺苷)诱导产生愈伤组织的诱导率高83%。添加的2,4-D和IAA的最适的浓度分别是lmg/L和0,2mg/L(表1)。如果2，4-D和IAA的浓度偏高时，将影响植物体的再分化。在添加5mg/L激动素和lmg/LNAA的培养基中进行植物体的再分化时，再分化率达到51%，但是，只添加激动素时植物体不能进行再分化(表3)。实施例2、转化以及筛选研究表明在大蒜基因转化中，农杆菌和愈伤组织共同培养6天时愈伤组织的GFP表达比较多；当在添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2N6培养基中，或在添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2N6培养基中共同培养培养6天左右时，可以提高转换效率；其中，最好的组合是在1/2N6培养基中添加ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸(表2)。在这种条件下比别的方法更有效地提高了转化的效率。转化体的筛选是通过把细胞体接种到添加有25mg/L的潮霉素的MS培养基上进行的；培养12周后，将在显微镜下鉴定为表达GFP的组织进行继代培养(图2和图3)。以前是以gUSA为标记基因，在观察组织后，被观察的组织不能被再利用；但是，本发明的方法是以GFP为标记基因，因此可以随时观察GFP的表达部位，且可以对筛选出的表达GFP的愈伤组织的部位进行培养，所以对转化体的筛选有更好的效果。当表达GFP的愈伤组织大小达到3mm时，接种到再分化培养基上培养8周，以对植物体进行再分化。把再分化的植物体接种到MS培养基上进行4周的驯化过程，然后移栽到温室栽培。实施例3、对转化体的分析为了筛选转化的组织，共同培养6天后在显微镜下观察瞬时的表达，发现在再分化植物体的根，茎，叶中也显著表达GFP(图6)。采用以潮霉素基因为引物进行PCR的方法分析转化体，结果发现转化的植物体中扩增出大量的895bp大小的DNA片段，而没有转化的植物体中没有观察到扩增的DNA片段(图4)。此外，用限制酶//^////酶切转化体的基因组DNA，进行DNA杂交，分析出除草剂抗性基因是否转到植物体中(图5)。为了确认除草剂抗性基因是否转到植物体中，还进行了生物鉴定。把0.5%的草铵磷喷施到温室栽培的大蒜植物体上，6天后观察，发现转化的植物体正常，而没有转化的植物体已经死亡(图7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1)植物体的再分化的愈伤组织的数目/选取的愈伤组织的数目序列表<110>韩国农村振兴厅<120>利用农杆菌提高大蒜的转化效率的方法及由其制备的大蒜<160>2<170>Kopatentln1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gctgcgccgatggtttctacaa22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gcgcgtctgctgctccatacaa2权利要求1、一种利用农杆菌提高大蒜植物体的转化效率的方法，其特征在于，该方法包括以下阶段(1)在添加有0.5-2mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.3mg/L的吲哚基乙酸的MS培养基上培养7-9周，以诱导产生大蒜愈伤组织的阶段；(2)将上述经过诱导产生的大蒜愈伤组织和具有重组植物表达载体的根癌农杆菌在共同培养基上共同培养，以进行转化的阶段；(3)将上述经过共同培养的大蒜细胞接种到添加有抗生素的选择性培养基上培养11-13周，以进行筛选的阶段；以及(4)将上述经过筛选的大蒜细胞接种到再分化培养基上，以进行再分化的阶段。2、根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第(1)阶段中，所述MS培养基中添加有lmg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.2mg/L的吲哚基乙酸。3、根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)阶段中，所述共同培养的时间为5-7天。4、根据权利要求l所述的方法，其中，在所述第(2)阶段中，所述共同培养基为添加有0.5-2mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸和150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培养基，或者为添加有0.5-2mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫苏糖醇的1/2楚氏培养基。5、根据权利要求4所述的方法，其中，在所述第(2)阶段中，所述共同培养基为添加有lmM的2-(N-吗啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培养基，或者为添加有lmM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的二硫苏糖醇的1/2楚氏培养基。6、根据权利要求5所述的方法，其中，在所述第(2)阶段中，所述共同培养基为添加有lmM的2-(N-吗啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培养基。7、根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第(3)阶段中，在所述添加有抗生素的选择性培养基上培养12周。8、根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第(4)阶段中，在所述再分化培养基中添加有4-6mg/L的激动素和0.5-2mg/L的萘乙酸。9、根据权利要求8所述的方法，其中，在所述第(4)阶段中，在所述再分化培养基中添加有5mg/L的激动素和lmg/L的萘乙酸。10、一种大蒜植物体，其特征在于，该大蒜植物体是根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法制备的。全文摘要本发明是关于利用农杆菌提高大蒜植物体的转化效率的方法以及用该方法制备的大蒜植物体。具体地说，所述方法包括以下阶段(1)在添加有0.5-2mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.3mg/L的吲哚基乙酸的MS培养基上培养7-9周，以诱导产生大蒜愈伤组织的阶段；(2)将上述经过诱导产生的大蒜愈伤组织和具有重组植物表达载体的根癌农杆菌在共同培养基上共同培养，以进行转化的阶段；(3)将上述经过共同培养的大蒜细胞接种到添加有抗生素的选择性培养基上培养11-13周，以进行筛选的阶段；以及(4)将上述经过选择的大蒜细胞接种到再分化培养基上，以进行再分化的阶段。文档编号C12N15/82GK101451150SQ200810178428公开日2009年6月10日申请日期2008年11月26日优先权日2007年12月3日发明者安栗均,尹武卿,金到姺,高官达申请人:韩国农村振兴厅