由放射形土壤杆菌产生的杂多糖的制作方法

专利名称：由放射形土壤杆菌产生的杂多糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂多糖(HP)，特征在于它可以通过发酵一种培养基获得，这种培养基含有至少一种放射形土壤杆菌I-2001(或者DSM12095)菌株、其重组体或其突变体，以及可以由所述菌株、其重组体或其突变体同化的碳源。
在许多工业领域中，不断搜寻具有以下性质的新型化合物-提高的流变性质，并且它们能形成凝胶，-与它们所掺入的培养基有增加的相容性，-在宽的温度和pH范围内有大的稳定性。
对于在细菌发酵结束时所获得的化合物来说，该化合物具有良好的产率也很重要。
凭借凝胶应用领域的多样性一些应用需要使用凝胶，由于其为特别有吸引力的系统，因此胶凝能力非常有利。
因此，例如农业食品工业提供了大量胶凝化产品(奶油、酸乳酪、各种果冻、冰淇淋等)，并且制药业使用凝胶作为有效成分或增稠剂载体。
在完全不同的另一个领域，一些涂料因静置时具有凝胶特性而不滴落，因此它们易于用漆刷涂敷(流变流体化轮廓)。
含水凝胶还可用作色谱载体或用于开发接触镜片。
细菌源的杂多糖，例如黄原胶，已有描述并因其在极端温度和pH条件下有效的流变性质而被使用。但是，这些适宜在溶液中使用的杂多糖不总能产生凝胶。
已知在所述培养基的组分交联之后形成三维网络时发生培养基的胶凝化。
通常，这种胶凝化是通过将额外的阳离子，特别是碱金属或碱土金属类型的阳离子(例如钙和/或镁)加入到该培养基中、通过将pH转换到酸性或碱性pH、通过添加另一种化合物，特别是另一种多糖(例如黄原胶和角豆胶的组合)、或者通过调节温度引起的。
无论设想的应用是什么，上述胶凝化条件可能-因附加阳离子或共添加剂(为了获得凝胶而必需加入的)与所述组合物中存在的其它成分之间相互作用而对最终凝胶的稳定性和相容性有害，或者-因高温和/或pH改变而使所述杂多糖和/或所述组合物中存在的其它成分变性。
在本发明的正文中，术语“凝胶”是指分散于液体中的杂多糖链至少部分缔合导致的假固体(性能与固体相近)。在予应力频率范围ω内，通常假固体凝胶，就它们的固体组分而言，以也称作储存模量的弹性模数G’(ω)表征，而就它们的液体或粘性组分而言，以也称作损耗模量的粘性模数G”(ω)表征。
可以使用受控应变流变计并以振荡方式运转测定机械值G’(ω)和G”(ω)。作为非限制性指示，例如可以提及Rheo-Fluid Spectrometer流变计。
也可以在受控应变流变计上并以振荡方式运转来测定G’和G”。为了说明起见，例如可以提到CARRIIMED流变计。
测定原理在于首先，确定可逆机械应变的范围，在该范围内凝胶对机械应力的响应为所述应变的线性函数。其次，凝胶经受包括在上面确定的线性范围内的机械应变给定值。然后该流变计进行扫频ω。
与该应变同相的凝胶的应力响应给出弹性模数G’(ω)。G’(ω)相应于弹性形式的凝胶储存的能量并可以回收。
以90°角与该应变异相的凝胶的应力响应给出粘性模数G”(ω)。G”(ω)相应于通过粘性流动消耗掉的能量并且不能回收。
在整个扫过的予应力频率范围(ω)中，当G’/G”比大于或等于10时，即当凝胶弹性保持高时并且当G’(ω)值大于或等于10Pa时，凝胶被称为强或真的。
本发明的目的确切地是提供杂多糖，它具有非常好的流变性质，特别是在增稠和假塑性(流变流体化)性质方面，并且具有产生真凝胶的能力，且不需向培养基中添加额外的阳离子并且不需转换pH，其产生凝胶的温度低于或等于40℃。
本发明的目的还在于提供在低浓度下具有非常好的流变性质的杂多糖。
因此本发明涉及一种杂多糖(HP)，特征在于它可以通过发酵一种培养基获得，这种培养基含有至少一种放射形土壤杆菌I-2001(或者DSM12095)菌株、其重组体或其突变体，以及可以由所述菌株、其重组体或其突变体同化的碳源。
根据布达佩斯条约于1998年4月3日将该放射形土壤杆菌菌株保藏在Collection Nationale de Culture des Microorganismes(CNCM)[国家微生物培养物保藏中心]，在这里它可以由公众以登记号I-2001取得。它还于1998年4月21日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellculturen GmbH(DSMZ)，在这里它可以由公众以登记号DSM12095取得。
可以在25-30℃，更特别地25-28℃的温度下于培替氏培养皿中进行放射形土壤杆菌I-2001(或DSM 12095)的纯培养，培养约24小时。
放射形土壤杆菌I-2001(或DSM 12095)可以同化的碳源和氮源可以选自葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、甘露糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、甲基-β-吡喃半乳糖苷、甲基-α-吡喃半乳糖苷、纤维二糖、龙胆二糖、甲基-β-D-吡喃葡糖苷、甲基-α-D-吡喃葡糖苷、七叶苷、核糖、阿拉伯糖、木糖、巴糖、鼠李糖、岩藻糖、松三糖、D(+)阿糖醇、L(-)阿糖醇、木糖醇、半乳糖醇、塔格糖、甘油、肌醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、松二糖、山梨醇、福寿糖醇、来苏糖、赤藓醇、D(-)酒石酸盐、D(-)苹果酸盐、L(-)苹果酸盐、顺-乌头酸盐、反-衣康酸盐、2-酮基-D-葡糖酸盐、N-乙酰葡糖胺、奎尼酸盐、甜菜碱、琥珀酸盐、延胡索酸盐、甘油酸盐和葡糖胺。
在该菌株的可能维持培养基中，认为Difco MY型琼脂维持培养基(参考0712-01-8)特别有利。所述Difco MY琼脂培养基具有以下组成细菌培养用酵母提取物3g麦芽汁 3g细菌培养用蛋白胨5g细菌培养用葡萄糖 10g细菌培养用琼脂 20g为了保存该菌株，优选提前使用至少一个预培养步骤。术语“预培养步骤”是指使该细茵菌株发育并增殖，但是不产生多糖的步骤。
已可以证实，所述杂多糖(HP)通常含有葡萄糖基元和/或其衍生物、半乳糖基元和/或其衍生物、葡糖醛酸基元和/或其盐、乙酸基元和/或其盐，以及丙酮酸基元和/或其盐。
所述杂多糖(HP)的组成基元通常以如下摩尔比存在(作为参照，葡萄糖等于1)-半乳糖和/或其衍生物0.2-5，-葡糖醛酸和/或其盐0.1-3，-乙酸和/或其盐0-5，-丙酮酸和/或其盐0.01-2。
更具体地说，所述基元以如下摩尔比存在(作为参照，葡萄糖等于1)-半乳糖和/或其衍生物0.5-4，并优选0.8-2，-葡糖醛酸和/或其盐0.2-2，并优选0.4-1，-乙酸和/或其盐0-4，并优选0-3，-丙酮酸和/或其盐0.01-2。
葡糖醛酸、乙酸和丙酮酸可以为盐形式。作为盐，可以提到的有钠、钾、钙或铵盐。
可以确定如上所指定的原始配方的所述杂多糖(HP)分析方法的原理是在所述杂多糖(HP)的水解以及具有内部或外部校准的色谱测定法之后确定其组成元素(单糖和酸)。
因此，按以下方式进行了单糖测定在密封管中在105℃下将100mg杂多糖(HP)用5ml摩尔三氟乙酸水解3-6小时。
接着蒸发至干，将该干燥残余物浸溶于含有15mg山梨醇的5ml吡啶中作为内标；然后，用0.9ml六甲基二甲硅氮烷将1ml吡啶溶液硅烷化。该硅烷化是用0.1ml三氟乙酸催化的。
然后通过FID(火焰离子化检测)气相色谱法在载有膜厚为0.14微米的聚甲基硅氧烷相的长25m且直径为0.25mm的玻璃毛细管柱上进行单糖测定。所用的气体载体为氢气，其流速为2ml/分钟。
使用5ml的1N盐酸在105℃将50mg杂多糖(HP)水解1小时，然后加入2mg酮戊二酸(构成该内标)并用蒸馏水调整至25ml获得的储液进行丙酮酸测定。该操作之后，与2,4-二硝基苯肼(DNPH)反应-将1ml 2N HCl中的7mg/ml DNPH溶液加入1ml上述溶液中；-反应时间为5分钟；然后-加入2ml丙酮和6ml水-乙腈混合物。
然后使用载有5微米直径C-18接枝二氧化硅的长度为250mm和直径为4.6mm的柱通过高效液相色谱法(HPLC)进行测定。所用洗脱剂为0.02mol/l磷酸和乙腈的体积比为50/50的混合物。其流速为2ml/分钟。
在375nm处使用紫外线进行丙酮酸的检测。
使用5ml的2N盐酸在105℃将100mg杂多糖(HP)水解1小时之后进行丙酮酸测定。然后加入5ml的5mg/ml丙酸溶液作为内标，并将15ml软化水加入该混合物中。使用长250cm且直径为4.6mm的5微米C-18接枝二氧化硅柱通过HPLC进行测定。所用洗脱剂为0.02mol/l磷酸水溶液，其流速为1.2ml/分钟。检测是折射的。
根据《食品化学法典》第4版第768页所述的方法，继用盐酸趁热处理该树胶之后，通过脱羧作用释放的CO2测定葡糖醛酸。
在串联的TSK PW4000和6000柱(柱长30cm，直径为7mm)上通过排阻色谱法，以折射检测来测定摩尔质量。该洗脱剂为0.1mol/l硝酸钠溶液。所述杂多糖在洗脱剂中约为0.015wt％。使用支链淀粉(摩尔质量为5×103-1.6×106g/mol，外推至107g/mol的单分散多糖)进行校准。
由从色谱图推知的质量分布曲线获得平均重量摩尔质量(Mw)；其通常为1×105-5×106g/mol，优选约8×105-5×106g/mol。平均重量摩尔质量更特别是约3×106g/mol。
已叙及，所述(HP)为在溶液中，尤其是在蒸馏水或自来水中具有非常好的流变性质。
因此，可以注意到，例如，(HP)在蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和1Hz频率下产生0.1-200Pa的G’值和0.1-20Pa的G”值。
当G’和G”值有利地是G’在20-200Pa且G”在0.5-15Pa时，(HP)产生强或真凝胶。甚至更有利地，G’为20-150Pa且G”为0.5-10Pa。根据一特别优选的实施方式，G’值为约100Pa且G”值为约5Pa(在蒸馏水中)。
该(HP)赋予含水培养基粘性，这可以经流动流变学评价。使用控制应力流变计或控制剪切速率流变计，如分别使用PHEOMAT或CARRIMED型粘度计进行所述的流动粘度的流变测定。
在两种情况下，该仪器测定当HP+水混合物受不可逆应变使该混合物流动时的应力。
因而该仪器使得在给定的剪切速率下定量测定粘质水平成为可能。
使用BROOKFIELD粘度计可以更简单地评价该流动粘度。
此外，(HP)流动粘度的这些流变测定能够评价(HP)溶液和/或含其的制品的流动阈值。所述阈值代表为了破坏培养基的结构并使其流动所必需具备的强度。
该流体流变学还能够定量测定当控制剪切增加时(HP)溶液和/或含其的制品流动的容易性(假塑性或流变流体化性能)。
应注意，例如，HP在含有1％wt/wt NaCl的蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和0.1s-1的剪切速率下产生100-5000Pa.s，并且更特别是200-2000Pa.s的流动粘度值。
在相似条件下，在10s-1的剪切速率下产生0.5-300Pa.s，并且更特别是5-150Pa.s的流动粘度值。
这些流动流变学数据代表了制品在被咀嚼、倾注、溢流等时的性能。
通过将(HP)加入培养基中获得的凝胶为愈合性凝胶，即剪切，甚至强剪切之后，“断裂的”凝胶具有再形成并恢复其最初性质的能力。
使用例如在由直径为12.7mm且渗透速率为0.05mm/s、渗透高度为15mm的圆柱形测定体组成的ETIA T2花纹造型机上进行的抗压试验测定评价由(HP)获得的凝胶的愈合能力。在相同位置在不同时间间隔将活塞推入凝胶中数次，并记录抗压强度。测定以mN/mm表示的原点处的斜率，它代表了凝胶的弹性。
例如，用1％wt/wt的于蒸馏水中的(HP)制备凝胶。然后将该凝胶储存24小时，之后在室温(约25℃)或约6℃的凉处进行抗压试验测定。
以不同时间间隔0、5、15分钟和24小时进行抗压测定试验，每次测定之间间断5分钟。
这样，无论什么时候测定(t=0、5、15分钟和24小时)，斜率保持恒定，约等于45±1mN/mm。
这意味着，凝胶的弹性稳定，并且在整个时间内它具有连续愈合数次的能力，同时保持相同的凝胶强度。
本发明还涉及一种制备如上所定义的杂多糖(HP)的方法。
该制备方法包括首先，将含有至少一种可以被放射形土壤杆菌I-2001(或DSM12095)菌株、其重组体或其突变体同化的碳源的培养基发酵。
除所述可以被同化的碳源之外，该发酵培养基还可以含有至少一种有机或无机氮源，并任选一种或多种无机盐。
按常规在该培养基中接种该放射形土壤杆菌I-2001(或DSM12095)菌株。
作为发酵培养基中的一种组分的有机碳源，除上述的糖类之外，还可提及的有例如淀粉的糖类，有利地是经过水解的淀粉水解物，这些糖类的混合物和含有至少一种这些糖类的混合物。
更具体地说，可以提及的有葡萄糖、蔗糖、淀粉，有利地是经过水解的淀粉水解物，这些糖类的混合物和含有至少一种这些糖类的混合物。葡萄糖和蔗糖是更优选的糖类。
碳源在发酵培养基中的浓度可以为1-100g/l，优选15-60g/l。
作为有机氮源，可以提到的有酪蛋白和酪蛋白酸盐、鱼水解物、小麦、玉米或大豆粉、酵母提取物(面包酵母、酿造酵母、乳酸酵母等)、玉米浆(CSL)、尿素和马铃薯蛋白。
作为无机氮源，可以提到的有硝酸铵或硝酸钠，以及磷酸铵或硫酸铵。
也可以用有机和无机氮源的混合物进行发酵。
含氮源(有机、无机或两者的混合物)在发酵培养基中的浓度可以为1-80g/l，优选3-50g/l该发酵培养基还可以含有痕量元素，如痕量的铁和/或钙和/或锰和/或镁盐，还可以含有维生素和核苷酸。
发酵可以在1-4巴的压力和25-35℃的温度下进行，优选在25-30℃的需氧条件下进行。
发酵培养基的pH可以为5-9，并且优选6-8。根据情况，可以使用如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水的碱，或者如硫酸、磷酸、盐酸或硝酸的酸调整该pH。
放在发酵罐或容器中的发酵培养基可以有利地经过搅拌。该搅拌可以使用例如往复摇动器、旋转摇动器、搅拌旋转轴或气泡柱进行。发酵时间常规长于30小时，但是一般在40-100小时之间。
发酵产率通常大于针对所用的碳源产生的杂多糖(HP)重量的40％，优选为55-75％，最优选为60-75wt％。
发酵之后，按照以下步骤可以将杂多糖(HP)与发酵葡萄汁分离ⅰ-对发酵终点的葡萄汁进行80-120℃的热处理10-60分钟，ⅱ-使用至少部分水混溶性有机液将该杂多糖(HP)沉淀，ⅲ-将杂多糖(HP)与有机液分离。
在步骤(ⅰ)中，有利地将含有杂多糖(HP)的发酵葡萄汁在80-120℃的温度下加热10-60分钟，并优选15～5分钟。
经过上面热处理的葡萄汁有利地具有6-8的pH。
但是，如果需要的话，可以根据情况用碱或酸调整该pH。
后者可以选自上面提到的用于调整发酵培养基pH的碱和酸。
根据本发明的优选变体，将得自步骤(ⅰ)的葡萄汁保持在与热处理温度相同的温度下。
在步骤(ⅱ)中，有利地使用至少部分为水混溶性并且杂多糖(HP)在其中不溶或实际上不溶的有机液，通过沉淀从步骤(ⅰ)中获得的葡萄汁中回收杂多糖(HP)。
作为适宜本发明的液体，可以提到的有丙酮或含有1-6个碳原子的醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、或其混合物。
更具体地，用异丙醇进行(HP)的沉淀。
所用有机液的体积一般为待处理的葡萄汁的体积的至少2倍。
还可以在有盐，如硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、氯化钠、氯化钾、氯化钙、或磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙的情况下进行用有机液沉淀杂多糖(HP)。
根据一
具体实施例方式
，可以在40-60℃的温度下进行该沉淀。
杂多糖(HP)一旦沉淀之后，可以在步骤(ⅲ)中从有机液中分离出。
分离方法本身并不重要，同样可以选自已知的常规分离方法，如过滤、离心或旋转过滤。
所得纤维可以任选经脱水，例如使用丙酮或醇类如乙醇、丙醇或异丙醇。
进行该脱水操作所需的醇的重量通常为待处理的纤维重量的1-10倍。
经过脱水的纤维可以经过进一步的过滤、离心或旋转过滤操作。
适宜时，可以将纤维干燥、粉碎和/或筛分，以便获得杂多糖(HP)粉末。
如果想获得更纯的粉末，可以使用一种或多种酶处理发酵葡萄汁或由按照上述方法获得的粉末重组的水溶液。
作为可能适合于该目的的酶，可以提到的有蛋白酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、脂蛋白酶、纤维素酶和壳多糖酶。
可以将酶促纯化与例如各种过滤、离心或透析法的物理纯化方法或者各种层析技术组合，或者用这些物理纯化方法或层析技术代替该酶促纯化。
发酵葡萄汁和杂多糖(HP)的重组溶液，可能已经过纯化处理，可以被浓缩。
在某些情况下浓缩可能是有利的，特别是可以由此降低运输成本时。此外，浓缩液可以比杂多糖(HP)粉末更快地得到利用。
可以使用本领域技术人员已知的所有技术进行该浓缩，特别是蒸发、超滤或渗析。
在本发明中，杂多糖(HP)有利地以纤维或粉末型的固体形式存在。
已叙及，(HP)具有非常好的流变性质，特别是形成真凝胶的能力。根据发酵条件，特别是根据培养基中的组分及其浓度、和/或方法的步骤(ⅱ)中的沉淀条件(尤其是是否在有盐的情况下进行沉淀)，(HP)具有能够用作增稠剂或作为胶凝剂，或者两者的优点。
因此，本发明涉及如上所述或者通过上面定义的方法获得的杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。
(HP)可作为例如石油、农用化学品、食品、化妆品、造纸和纺织业中的增稠剂和/或胶凝剂，还可作为涂料、接触镜片、胶水、墨水和家庭或工业清洁剂中的增稠剂和/或胶凝剂。
可用于化妆用组合物中的本发明杂多糖(HP)的量取决于待增稠和/或待胶凝的含水介质。该量可以为增稠的或胶凝的含水介质重量的约0.01-5％，优选约0.1-0.3％。
术语“化妆用组合物或制品”是指所有化妆产品或制品，如称为化妆品指令的1976年7月27日的欧洲指令第76/768/EEC号的附件1(“化妆产品种类的解说性目录”)中所述的那些。
该化妆用组合物可以配制成大量类型的皮肤和/或毛发用产品，如摩丝、发胶(特别是定形发胶)、调理剂、头发定形用或使头发易于梳理的制品、漂洗制品、洗手剂和爽身水、调节皮肤水分的产品、清洁乳、除去化妆品的组合物、防晒和防紫外线的霜或露、护理霜、防粉刺制品、局部止痛剂、睫毛油、打算涂敷到唇或其它粘膜上的产品、条状物和相同类型的其它组合物。
这些化妆用组合物使用载体、或者几种载体的混合物，其在所述组合物中的存在浓度为约0.5-99.5％，通常约5-90％。
适宜载体的选择取决于所用组分的性质和所述组合物的目的，即该配制产品是否要留在已涂敷的表面上(例如喷雾剂、摩丝、滋养露或胶)，或者另一方面，使用后是否漂洗掉(例如香波、调理剂、漂洗液)。
存在于化妆用组合物中的含水载体还可以含有C1-C6醇，特别是甲醇、乙醇和异丙醇，它们还可以含有另一种溶剂，该溶剂可以使所述组合物中所用的各种成分溶解或分散在该含水介质中。
因此所述载体还可以含有多种其它溶剂，如丙酮、烃类、卤代烃类、芫荽醇、挥发性聚硅氧烷和酯。可用于含水载体中的各种溶剂可以是彼此混溶性的，也可以是彼此不能混溶的。
当该化妆用组合物为喷雾剂、滋养露、胶或摩丝形式时，除水外，优选的载体包括乙醇、聚硅氧烷的挥发性衍生物、及其混合物。
用于气溶胶喷雾剂和摩丝的制品还可以含有能产生摩丝或细雾形式的产品的喷射剂。作为例子，可以提到的有三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氟乙烷、二甲醚、丙烷、正丁烷或异丁烷。
所述含水载体可以为多种形式，特别是乳液的那些，包括油包水乳液、水包油乳液以及多重乳液，所需粘度范围可以高达2000000mPa.s。除含水载体之外，该化妆用组合物可以含有表面活性剂，用于分散、乳化、溶解和稳定尤其是为了它们的润肤或润湿性质所使用的各种化合物。它们可以是阴离子、非离子、阳离子、两性离子或两性类型的；作为例子，可以提到的有阴离子表面活性剂，其用量可以为3-50％，优选5-20％，该试剂例如有.烷基酯磺酸盐.烷基硫酸盐.烷酰胺硫酸盐.饱和或不饱和脂肪酸盐非离子表面活性剂，其用量可以为0.1-30％，优选2-10％，该试剂例如有.聚氧亚烷基化烷基苯酚类.葡糖酰胺类.衍生于N-烷基胺的甘油酰胺类.聚氧亚烷基化C8-C22脂族醇.由环氧乙烷与疏水化合物缩合得到的产物，该疏水化合物是由环氧丙烷和丙二醇缩合得到的
.氧化胺类.烷基聚糖苷类及其聚氧亚烷基化衍生物.C8-C22脂肪酸的酰胺类.乙氧基化脂肪酸.乙氧基化酰氨基胺类、胺类、酰胺类两性和两性离子表面活性剂，其用量可以为0.1-30％，优选1-10％，该试剂例如有*甜菜碱类型的那些如*甜菜碱*磺基三甲铵乙内酯*酰胺烷基甜菜碱*和磺基三甲铵乙内酯*烷基磺基甜菜碱*脂肪酸与蛋白水解物的缩合产物，*椰油两性乙酸酯类和椰油两性二乙酸酯类*烷基两性丙酸酯类或烷基两性二丙酸酯类，*烷基多胺类的两性衍生物调理剂也可以0.05-5％，优选0.1-1％的量存在。
其中，可以提到的有以名称季化羟乙基纤维素所熟知的合成源的那些，如季化羟乙基纤维素-2、-7和-10；多糖类的阳离子衍生物，如羟乙基椰油二镆纤维素、瓜尔羟丙基氯化三镆、羟丙基瓜尔羟丙基氯化三镆；聚硅氧烷的非挥发性衍生物，如酰胺聚二甲基硅氧烷、环甲基硅氧烷、不溶于水且不挥发的有机聚硅氧烷，如油、树脂或树胶，例如二苯基聚二甲基硅氧烷树胶。
所述化妆用组合物还可以含有具有成膜性质的聚合物，可以将其用于提供附着功能。这些聚合物通常以0.01-10％，优选0.5-5％的浓度存在。它们优选为聚乙烯吡咯烷酮型，即聚乙烯吡咯烷酮和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚乙二醇共聚物和磺化对苯二甲酸共聚酯聚合物。
该化妆用组合物还可以含有发挥保护功能的聚合衍生物，其用量为约0.01-10％，优选约0.1-5wt％，该衍生物例如有.纤维素衍生物.接枝于聚亚烷基主干上的聚乙烯酯.聚乙烯醇类.磺化对苯二甲酸共聚酯聚合物.乙氧基化一胺或多胺，乙氧基化胺的聚合物通过使用制品量的0.1-20％，优选1-15％的增塑剂还可以提高该化妆用组合物的性能。在这些试剂中，可以提到的有己二酸酯、邻苯二甲酸酯、间苯二甲酸酯、壬二酸酯、硬脂酸酯、硅共聚醇类、二醇类、蓖麻油、或其混合物。
还可以有利地向这些组合物中加入金属螯合剂、尤其是螯合钙的那些，如柠檬酸根离子，或者聚合分散剂，其用量为约0.1-7wt％，以便控制钙和镁硬度，这些试剂例如有.聚羧酸的水溶性盐.分子量约1000-50000的聚乙二醇。
还可以向该化妆用组合物中加入润湿剂；可以提到的有甘油、山梨糖醇、尿素、胶原、明胶和润肤剂，该润肤剂通常选自烷基甘油一酯和烷基甘油二酯、甘油三酯，如从植物和蔬菜中提取的油类或者动物源的油类或其氢化衍生物、矿物油或液体石蜡、二醇、脂肪族酯和聚硅氧烷。
可以向这些化合物中组合加入如碳酸钙的无机颗粒或粉末、粉末形式或胶体形式的无机氧化物如二氧化钛、二氧化硅、铝盐、高岭土、滑石粉、粘土及其衍生物。
通常向这些成分中加入一种或多种香料、染料和/或遮光剂如颜料。
为了防止皮肤和/或头发受到日光和紫外线的攻击，可以向这些制品中加入或者为强吸收紫外线的化合物，或者为例如氧化锌、二氧化钛或氧化铈的无机颗粒的防晒剂。
通常以0.01-3wt％的量将防腐剂加入这些组合物中，这些防腐剂例如有对羟基苯甲酸酯、苯甲酸钠或者防止细菌繁殖或霉菌繁殖并且通常用于化妆用组合物的任意化学试剂。
有时可以使用改善水活度并大大提高渗透压的试剂，如烃类或盐类。
该化妆用组合物还可以含有调节粘度和/或胶凝的其它聚合物，如交联聚丙烯酸酯、通过发酵获得的水状胶体如黄原胶和Rheozan，如羟丙基纤维素或羧甲基纤维素的纤维素衍生物、瓜尔胶或其衍生物等，它们可以单独使用或者组合使用。
本发明尤其涉及杂多糖作为膳食制品中的增稠剂和/或胶凝剂的用途。
加入杂多糖(HP)的膳食制品通常是简单或多重液体乳液、气体和液体的复合乳液(溢流系统)、液体和固体的悬浮液、或者包括这些可能性的任意其它系统。
在这些制品中，液体有利地为水或至少部分含有水的液体。
根据其类型，通过实施制备膳食制品的常规方法获得膳食制品。因此，将有利地为纤维或粉末类型的固体形式的该(HP)与制品所需的其它成分混合。适当地将整个混合物均化。
制备制品的温度本身并不重要。含有该(HP)的制品可以在对其使用性能没有任何损害的情况下经灭菌。(HP)的另一个优点是可以在不必预先加热这些成分的情况下制备膳食制品。
尽管膳食制品的多样性(pH、离子强度、组成)，但是(HP)保持可相容性，并且基本上保留了其性能。
与本发明主题的杂多糖(HP)相关的有利的流变性质，以及(HP)在低于或等于40℃的温度下生产pH范围大的真凝胶的能力，也使得赋予其单独使用或与其它添加剂组合使用的制品与不含所述添加剂的制品相近的质地成为可能。
表征膳食制品的质地的可测定的参数为流变性，并且主要在于测定弹性模数(G’)和粘性模数(G”)，和给定剪切速率下的流动粘度。G’和G”，以及粘度的定义如上。
这些流变特性的目的在于证实制品的粘性-弹性和/或假塑性性能，以便将它们彼此比较。
(HP)，有利地为纤维或粉末状固体形式，具有赋予含有它的制品流变流体化轮廓的能力。
类似地，(HP)具有生产真凝胶的能力，在施加机械应力之后该凝胶可以愈合。
应说明的是，对制品所测得的G’和G”模数以及粘度与在蒸馏水中对(HP)测定的那些可以不同。
在如窝形奶油水果蛋糕的乳基和定型甜食中，可以有利地用(HP)至少部分地代替常规胶凝剂，特别是明胶。
在如维纳格雷酸辣沙司的成-酸介质中，通过加入少量(HP)可以构造所含的含水介质。
在糖果领域，特别是HARIBO类型的口香糖中，可以有利地用(HP)至少部分地代替胶凝剂，如明胶。
在高离子强度的介质中，特别是猪肉店中，可以向角叉菜聚糖中加入(HP)，从而强化其质地，特别是例如香肠的弹性外观。
在预期会溢流的制品中，如Chantilly奶油、顶端配料或冰淇淋，(HP)可用作增稠剂和/或胶凝剂。
类似地，(HP)可用于例如以下制品蛋黄酱、蔬菜木斯或含蛋白质的木斯，如肉或鱼木斯，或者含白蛋白的木斯，如蛋糖霜。
作为增稠剂和/或胶凝剂，(HP)还可以为酸奶的组成部分。
在上述膳食应用中，以含有它的组合物或制品的重量计，通常使用0.01-5wt％，并且优选0.05-2wt％的杂多糖(HP)。以组合物或制品的重量计，甚至更优选使用0.1-1wt％的杂多糖(HP)。
应说明的是，杂多糖(HP)并不改变它所加入的食品的口味。
本发明最后涉及含有如上所定义的杂多糖(HP)的膳食组合物或制品。
下面通过实施例说明本发明，但是，它们并不限制本发明的范围。
维持放射形土壤杆菌I-2001(或DSM12095)菌株的培养基为Difco MY琼脂培养基(参考0712-01-8)。该培养基的组成(已配制好)如下细菌培养用酵母提取物3g麦芽汁 3g细菌培养用蛋白胨5g细菌培养用葡萄糖 10g细菌培养用琼脂 20g将21g该培养基稀释于1升蒸馏水中。溶解之后，将该培养基在高压消毒锅中在121℃下灭菌15分钟。然后将该培养基分布于培替氏培养皿中。
在25-30℃，优选25-28℃下培养的培替氏培养皿上培养最少24小时。预培养-保藏然后将该菌株保藏在通过液氮冷冻(LNF)法冷冻在-196℃下的管中。
为了进行液氮冷冻(LNF)，在具有以下组成的PYG10培养基上制备一预培养物麦芽汁3g(Oxoid获得)酵母提取物3g(Oxoid)大豆蛋白胨5g(Oxoid)葡萄糖 10g(从Prolabo获得)矿质水适量至1升为了制备该培养基，将所有成分分散于矿质水中。使用10％硫酸将pH调整至6.5。在高压消毒锅中将该培养基在120℃下灭菌20分钟。
在220rpm且振幅=50mm的旋转振荡器上在28℃下培养24小时之后，向该培养物中加入10％(体积)的纯无茵甘油。然后将该培养物分入容量从1ml到10ml，优选从2ml-4ml的低温管中。
将这些管保藏在液氮中。
在本实施例中，涉及两个“预培养”步骤。这些步骤都在500ml锥形瓶中进行，相应于培养基100ml。
相应于细菌菌株产生多糖步骤的生产步骤是在20升发酵罐(其中15升是可用的)中进行的。
旋转振荡器的搅拌条件是转速=220rpm，振幅=50mm。
预培养步骤1使用具有以下组成的PYG10培养基进行预培养步骤1麦芽汁3g(Oxoid)酵母提取物3g(Oxoid)大豆蛋白胨5g(Oxoid)葡萄糖10g(Prolabo)蒸馏水适量至1升将所有成分分散于一定量的蒸馏水中至1升。在灭茵之前，使用10％硫酸将pH调整至6.5。在高压消毒锅中将该培养基在120℃下灭菌20分钟。
灭菌之后以及用低温管接种(适量)之前，pH为7.33。
用足量LNF接种每只锥形瓶。
在旋转振荡器(220rpm,A=50mm)上在28℃下培养24小时之后，该培养基具有以下特征pH=6.82粘度=100mPa.s在28℃下在72小时后在MY琼脂(Difco培养基，参考0712-01-8)上的茵群读数=1.8×109cfu/ml培养24小时之后，将预培养物1用于接种预培养物2。预培养步骤2使用以下组成的培养基进行预培养步骤2酵母提取物 4g(Oxoid)MgSO4·7H2O 0.8g (Prolabo)FeSO4·7H2O 0.01g (Prolabo)MnSO4·H2O 5ppm Mn2+(Prolabo)K2HPO44g (Prolabo)或Na2HPO43g (Prolabo)葡萄糖 10g(Prolabo)去离子水适量至 1升(Prolabo)在蒸馏水中制备100g/l的葡萄糖溶液，然后在中性pH下在121℃灭菌15分钟。
将剩余成分分散于一定量的去离子水中至900ml，然后将pH调整至6.8，之后在121℃下灭菌15分钟。
灭菌之后，向每只锥形瓶中加入10ml葡萄糖溶液。
在灭菌之后和接种之前，pH为6.88。
每只锥形瓶接种足够量的预培养物1。
在旋转振荡器(220rpm,A=50mm)上在28℃下培养24小时之后，该培养基具有以下特征pH=6.82粘度=50-100mPa.s在28℃下在72小时后在MY琼脂(Difco培养基，参考0712-01-8)上的茵群读数=1.6×109cfu/ml培养24小时之后，将预培养物2用于接种生产步骤中的两种发酵培养基(发酵罐1和2)。生产步骤最后步骤是杂多糖(HP)生产步骤。
发酵罐1的培养基具有以下组成葡萄糖 20g (Prolabo)CSL6g (Prolabo)MgSO4·7H2O 0.8g(Prolabo)MnSO4·H2O 5ppm Mn2+(Prolabo)K2HPO41g (Prolabo)消泡剂 0.2ml去离子水适量至1升葡萄糖将该足够克数的葡萄糖溶于一定量的去离子水中至3升。使用10％硫酸将pH降至5。将Mariotte烧瓶中的该溶液在高压消毒锅中在120℃下灭菌30分钟。
氮+盐将该足够克数的玉米浆(CSL)、15g K2HPO4、12g MgSO4·7H2O、23ml的10g/l MnSO4·H2O溶液和3ml消泡剂溶于量至7升的去离子水中。用10％硫酸将pH降至6.5。将该混合物在120℃下就地灭菌30分钟。
1N氢氧化钠将40g NaOH碎片溶于量至1升的蒸馏水中。将Mariotte烧瓶中的该溶液在高压消毒锅中在120℃下灭菌30分钟。
当所有成分都在28℃时，将它们在发酵罐中混合。然后向该发酵罐中接种适量的预培养物2。
在发酵罐1中的发酵条件如下搅拌200rpm 0-20小时，然后400rpm直到发酵结束。
通气0-18小时为400l/h，然后从24小时直到发酵结束为825l/h。
将温度调整到28℃。
用1N NaOH将pH调整至6.8。
压力为大气压。
发酵罐2的培养基具有以下组成NaNO31.2g (Prolabo)NH4NO30.25g (Prolabo)CaSO4·2H2O 0.3g (Prolabo)MgSO4·7H2O 0.8g (Prolabo)MnSO4·H2O 5ppm Mn2+(Prolabo)FeSO4·7H2O 0.01g (Prolabo)Na2HPO43g(Prolabo)葡萄糖 45g(Prolabo)消泡剂 0.2ml软化水适量至1升葡萄糖将该足够克数的葡萄糖溶于一定量的去离子水中至3升。使用10％硫酸将pH降至5。将Mariotte烧瓶中的该溶液在高压消毒锅中在120℃下灭菌30分钟。
氮+盐将18g NaNO3、3.75g NH4NO3、4.5g CaSO4·2H2O、23ml的10g/lMnSO4·H2O溶液、12g MgSO4·7H2O、75ml的2g/l FeSO4·7H2O溶液、4.5gNa2HPO4和3ml消泡剂溶于量至7升的去离子水中。用10％硫酸将该溶液的pH调整至6。将该混合物在120℃下就地灭菌30分钟。
1N氢氧化钠将40g NaOH碎片溶于量至1升的蒸馏水中。将Mariotte烧瓶中的该溶液在高压消毒锅中在120℃下灭菌30分钟。
当所有成分都在28℃时，将它们在发酵罐中混合。然后向该发酵罐中接种适量的预培养物2。
在发酵罐2中的发酵条件如下搅拌0-20小时200rpm，然后400rpm直到发酵结束。
充气0-18小时为400l/h，然后从24小时直到发酵结束为825l/h。
将温度调整到28℃。
用1N NaOH将pH调整至6.8。
压力为大气压。发酵结果根据所研究的培养基，发酵时间为65-90小时，可以用异丙醇沉淀的固体为15-26g/kg，相对所用碳源的重量产率为33-60％。萃取和纯化使用10％(wt/wt)的纯异丙醇使发酵终点的葡萄汁稳定。然后在中性pH(这里，pH=7)下将其在110℃下热处理25分钟，热处理期间的pH不变。
一旦热处理结束，趁热(温度＞80℃)萃取该葡萄汁。
沉淀条件是异丙醇=53％wt/wtNa2SO4=0.2％wt/wt固体=0.4％wt/wt沉淀之后，将这些纤维剁碎，然后洗涤并用滴定度为78％的异丙醇脱水。
然后将这些纤维在80-85℃的通风恒温箱中干燥，直到获得含水量约10wt％的产品。
然后将纤维粉碎并过筛。
在本实施例中，使用BROOKFIELD RVT20-2粘度计在室温下测定流动粘度，以mPa.s计。
使用CARRIMED CSL100控制应力流变计产生弹性模数值，以Pa计。
它们是在频率为0.01-10Hz的振荡系统中测定的。
按以下方式进行溢流度测定(以％计)·将木斯加入到已知的体积烧杯(V)中；该烧杯有三个尖的旋塞，并将木斯整平；·将烧杯称重，以确定所装的木斯的质量(M)；·溢流度=[M(g)/V(ml)]×100制备2个制品制品3.1含有本发明的杂多糖(HP)，制品3.2(对比)含有酪蛋白酸钠和藻酸钠。
制品的组成如表Ⅰ。表Ⅰ

水相在配备有去絮凝桨的烧杯中称重所需的水量，在剧烈搅拌(500rpm)下将上表中所述的粉末混合物分散。
加入所述粉末之后维持搅拌5分钟。油相在烧杯中，将脂肪物质和乳化剂水浴加热到70℃。
然后在1000rpm搅拌下将该油相加入水相中。
加入油相之后维持搅拌5分钟。在该操作过程中，补充蒸发掉的水分。
然后使用Ultra-Turrax在2000rpm下将整个混合物均化2分钟。
将混合物冷却至低于10℃，之后进行溢流。使用KENWOOD CHEF型实验室混合器在接近5℃的温度下以最大速度进行3分钟。
结果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ

这些结果表明使用本发明(HP)的制品3.1的粘度比对比制品3.2的低，因此制品3.1更易溢流。
此外，制品3.1(本发明)首先更易胶凝(在高频率下G’较高)，并且具有改善的溢流度。
权利要求
1．一种杂多糖(HP)，特征在于它可以通过发酵一种培养基获得，这种培养基含有至少一种放射形土壤杆菌I-2001(或者DSM12095)菌株、其重组体或其突变体，以及可以由所述菌株、其重组体或其突变体同化的碳源。
2．如权利要求1所述的杂多糖(HP)，特征在于它含有葡萄糖基元和/或其衍生物、半乳糖基元和/或其衍生物、葡糖醛酸基元和/或其盐、乙酸基元和/或其盐，以及丙酮酸基元和/或其盐。
3．如前面权利要求所述的杂多糖(HP)，特征在于它含有摩尔比如下的所述基元，作为参照，葡萄糖等于1-半乳糖和/或其衍生物0.2-5，-葡糖醛酸和/或其盐0.1-3，-乙酸和/或其盐0-5，-丙酮酸和/或其盐0.01-2。
4．如前面权利要求所述的杂多糖(HP)，特征在于它含有摩尔比如下的所述基元，作为参照，葡萄糖等于1-半乳糖和/或其衍生物0.5-4，并优选0.8-2，-葡糖醛酸和/或其盐0.2-2，并优选0.4-1，-乙酸和/或其盐0-4，并优选0-3，-丙酮酸和/或其盐0.01-2。
5．如权利要求1-4任一所述的杂多糖(HP)，特征在于所述葡糖醛酸、乙酸和丙酮酸为盐形式。
6．如前面权利要求所述的杂多糖(HP)，特征在于所述酸为钠、钾、钙或铵盐形式。
7．如权利要求1-6任一所述的杂多糖(HP)，特征在于它具有1×105-8×106g/mol，优选约8×105-5×106g/mol的平均摩尔质量(Mw)。
8．如权利要求1-7任一所述的杂多糖(HP)，特征在于它具有约3×106g/mol的平均摩尔质量(Mw)。
9．如权利要求1-8任一所述的杂多糖(HP)，特征在于所述杂多糖(HP)在蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和1Hz频率下产生0.1-200Pa的G’值和0.1-20Pa的G”值。
10．如前面权利要求任一所述的杂多糖(HP)，特征在于所述杂多糖(HP)在蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和1Hz频率下产生20-200Pa的G’值和0.5-15Pa的G”值。
11．如权利要求10所述的杂多糖(HP)，特征在于所述G’值为20-150Pa且G”值为0.5-10Pa。
12．如权利要求10或11所述的杂多糖(HP)，特征在于G’为约100Pa且G”为约5Pa。
13．如权利要求1-12任一所述的杂多(HP)，特征在于所述HP在含有1％wt/wt NaCl的蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和0.1s-1的剪切速率下产生100-5000Pa.s，并且特别是200-2000Pa.s的流动粘度值。
14．如权利要求1-13任一所述的杂多糖(HP)，特征在于所述HP在含有1％wt/wt NaCl的蒸馏水中的1％wt/wt溶液在23℃和10s-1的剪切速率下产生0.5-300Pa.s，并且特别是5-150Pa.s的流动粘度值。
15．如权利要求1-14任一所述的杂多糖(HP)，特征在于它为纤维或粉末类型的固体形式。
16．一种制备如权利要求1-15所定义的杂多糖(HP)的方法，特征在于按照以下步骤将所述杂多糖(HP)与发酵葡萄汁分离ⅰ-对发酵终点的葡萄汁进行80-120℃的热处理10-60分钟，ⅱ-用水混溶性有机液将所述杂多糖(HP)沉淀，ⅲ-将杂多糖(HP)与有机液分离。
17．如权利要求16所述的方法，特征在于，在步骤(ⅰ)中，经过热处理的葡萄汁具有6-8的pH。
18．如权利要求16或17所述的方法，特征在于得自步骤(ⅰ)的葡萄汁保持在与热处理温度相同的温度下。
19．如权利要求16-18任一所述的方法，特征在于，在有盐，如硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾或磷酸钙的情况下进行用有机液沉淀杂多糖(HP)。
20．如权利要求16-19任一所述的方法，特征在于，在步骤(ⅱ)中，在40-60℃的温度下进行沉淀。
21．如权利要求16-20任一所述的方法，特征在于将步骤(ⅲ)结束时获得的纤维脱水。
22．如权利要求21所述的方法，特征在于纤维经干燥、粉碎和/或筛分，以便获得杂多糖(HP)粉末。
23．如权利要求1-15任一所述的杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。
24．如权利要求1-15任一所述的杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂在石油、农用化学品、食品、化妆品、造纸和纺织业中，以及在涂料、接触镜片、胶水、墨水和家庭或工业清洁剂中的用途。
25．如权利要求1-15任一所述的杂多糖(HP)作为增稠剂和/或胶凝剂在膳食制品中的用途，以组合物或制品的重量计，杂多糖(HP)的量为0.01-5wt％，并且优选0.05-2wt％。
26．在石油、农用化学品、食品、化妆品、造纸、纺织、涂料、接触镜片、胶水、墨水和家庭或工业清洁剂领域中含有如权利要求1-15任一所述的杂多糖(HP)的组合物或制品。
全文摘要
本发明涉及一种杂多糖(HP),特征在于它可以通过发酵一种培养基获得,这种培养基含有至少一种放射形土壤杆菌I－2001(或者DSM12095)菌株、其重组体之一或其突变体之一,以及可以由所述菌株、其重组体之一或其突变体之一同化的碳源。本发明还涉及制备所述杂多糖的方法及其作为增稠剂和/或胶凝剂的用途。
文档编号C09K3/00GK1323351SQ9981207
公开日2001年11月21日 申请日期1999年10月8日 优先权日1998年10月13日
发明者R·肯蒂亚尼, A·赛尼切尔, S·瓦斯林, P·切瓦勒里奥, J－L·西蒙 申请人:罗狄亚化学公司