专利名称：使用土壤杆菌对小麦属的植物进行基因导入的方法及小麦属的植物的转化植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及藉由土壤杆菌属细菌对小麦属的植物进行基因导入的方法。本发明还涉及利用土壤杆菌属细菌，制作小麦属的植物的转化植物的方法。
背景技术：
作为主要谷类即小麦、玉米、稻等单子叶植物的转化方法，传统上已知有电穿孔法、粒子枪法等。但是，这些物理的基因导入方法存在如下问题导入了多拷贝的基因，无法以完整形式进行基因的插入，转化植物多见畸形、不育，等等。利用土壤杆菌细菌的基因导入法作为双子叶植物的转化法有着普遍的应用。土壤杆菌属细菌的宿主仅限于双子叶植物，认为其不能寄生在单子叶植物中(非专利文献1)， 但正在进行用土壤杆菌转化单子叶植物的尝试。1990年时，有研究报告提示，在稻、玉米、小麦等稻科作物中也能够利用土壤杆菌进行基因导入，但其中的任何一个均不仅存在重现性问题，对于导入的基因的确认也是不完全的，未能给出有说服力的结果(非专利文献2)。土壤杆菌法的改良近年来，有报告称通过利用具有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基因的超级二元载体，即使在稻、玉米等单子叶植物中，也能够进行稳定、高效率的转化(非专利文献3 和4)。这些报告认为，利用土壤杆菌进行的转化除了能够实现稳定、高效率的转化之外，还具有下述优点所得转化植物的突变少，导入基因的拷贝数少、且多为完好形式。继在稻、玉米中取得成功之后，还有报告称在大麦(非专利文献6)和高粱(非专利文献7)中利用土壤杆菌进行了转化。Ishida等人(1996)(非专利文献4)以玉米自交系(inbred)为材料利用土壤杆菌进行了转化。其后，相继又有关于利用土壤杆菌转化玉米的报告(非专利文献8-10)。作为改善利用土壤杆菌转化玉米的效率的尝试，有在N6基本培养基中转化选择细胞(非专利文献9)、在培养基中添加AgNO3和羧苄西林(非专利文献9、11)、在共存培养基中添加半胱氨酸(非专利文献10)，等等。Ishida等人(非专利文献11)报告通过用含AgNO3 和羧苄西林的培养基选择共存培养后的玉米未成熟胚，提高了玉米的转化效率。Hiei等人Q006)(非专利文献1 报告称通过接种对土壤杆菌之前的稻和玉米的未成熟胚实施热处理、离心处理，转化效率提高，并且对于目前为止无法转化的品种也能够获得转化体。此外，Hiei和Komari (2006)(非专利文献13)报告称通过改变共存培养培养基的组成和凝胶化剂，籼稻中的转化效率提高。这样，通过对培养基组成、选择标记基因的修饰、作为材料的植物组织片的前处理等的钻研，在利用土壤杆菌进行的稻和玉米的转化中，与最初的报告相比，取得了显著的效率提高和适应品种扩展。未成熟胚的利用
作为利用土壤杆菌进行单子叶谷物的转化的材料，未成熟胚和短期培养的未成熟胚是最合适的。在玉米、小麦、大麦等作物中，未成熟胚是土壤杆菌感染的主要靶标(Cheng 等(2004)非专利文献14)。在主要谷类之中，对于玉米和高粱，在刚刚分离后的未成熟胚中接种土壤杆菌并进行共存培养，然后进行了转化细胞和转化植物的选择。(Frame等Q006)非专利文献15， Ishida等Q007)非专利文献16，Zhao等Q000)非专利文献7，Gurel等Q009)非专利文献17)。在以刚刚分离后的未成熟胚作为材料的稻的转化中，对接种土壤杆菌并进行共存培养后的未成熟胚切除胚轴后加以利用。共存培养后去除胚轴是为了去除共存培养中生长的芽、根(Hiei and Komari (2006)非专利文献 13，Datta and Datta (2006)非专利文献 18)。此外，对于大麦，从接种土壤杆菌前的未成熟胚切除胚轴、或者造成胚轴损伤，然后用于土壤杆菌的转化(Tingay等(1997)非专利文献6，Smrawat等Q007)非专利文献19)。从分离的大麦的未成熟胚去除胚轴是困难的，为了总是得到没有问题的未成熟胚， 需要数日的联系(Jacobsen等，(2006)非专利文献20)。该繁杂操作是为了提高来自未成熟胚的愈伤组织形成率(Siarawat等Q007)非专利文献19)。这样，对于上述的谷类，在以未成熟胚作为转化的材料时，就是否从未成熟胚去除胚轴、以及去除胚轴时进行该操作的时期而言，根据作物的种类不同有明确的区别。对于作为主要谷类之一的小麦，有报告称尝试了以未成熟胚作为材料，利用土壤杆菌制作转化植物。例如，Cheng等(1997)(非专利文献5)报告称，在小麦(品种Bobwhite)的未成熟胚、前培养后的未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织中接种土壤杆菌，用含G418的培养基进行转化细胞和植物的选择，以0. 14 4. 3%的效率获得了转化体。其后，又有关于利用土壤杆菌制作转化小麦的报告，但直至距Cheng等(1997)(非专利文献5)最初的报告已经过10年以上的今天，其效率在基本上所有的报告中均小于5%，且适应品种也受到限制。 而且，还存在下述问题难以重现已经报告的结果、不同实验获得的结果偏差大、能够获得良好植物材料的时期有限等。此外，对于小麦，在利用未成熟胚作为材料的报告中，有的报告称去除胚轴，而未提及胚轴的切除操作的报告也很多，缺少一致性(Przetakiewicz等Q004)非专利文献 21，Jones 等 ^00 非专利文献 22，Wan and Layton (2006)非专利文献 23，Wu 等 Q008) 非专利文献对，Kharma and Daggard(2003)非专利文献25)。这其中，关于在小麦的转化中进行去除胚轴的处理的报告均是从接种土壤杆菌之前的未成熟胚上切除。而且，关于作为转化的材料的小麦未成熟胚的胚轴的切除，Jones等Q005)非专利文献22)的文献中记载，“使用未成熟胚时，早熟的接合子的发芽(precocius zygotic germination)是重要的问题，但通过在培养培养基中添加二氯甲氧苯酸(二氯甲氧苯酸 a)、脱落酸、高浓度的2，4-D这样的植物激素，可以将其抑制。数个作者明确表示，为了防止接合子的发芽，而除去或致伤胚轴”。上述记载可以理解成，当在小麦的转化中使用未成熟胚时，如果使用植物激素等，则可以解决未成熟胚的发芽问题，无需特别进行胚轴的处理。此外，公开了下述内容对于小麦的未成熟种子的目标组织(胚)，在该植物存在
5于天然植物环境中的时间点接种土壤杆菌，并与该土壤杆菌共存培养，然后通过目标组织的脱分化和再生获得转化植物，但这些文献中有关于小麦未成熟胚的胚轴处理的记载(特表2002-541853 (专利文献1)、Risacher等(2009)非专利文献33)。在专利文献1中，接种土壤杆菌，并在与该土壤杆菌共存培养后切除胚轴，但该文献中是在评价了 GUS ( β -葡糖醛酸酶)的表达后去除胚轴的。这就意味着是在进行了基因导入后再切除胚轴。而且， 在专利文献1所公开的技术中，是在天然植物环境中、即小麦未成熟种子的胚附着于该植物的状态下，接种土壤杆菌的。在非专利文献33中，使用与专利文献1相似的方法在目标组织(胚)的大小约 Imm的小麦未成熟种子中接种土壤杆菌后，将未成熟种子在附着于麦穗的状态下保存2 3 天。然后，从种子分离未成熟胚，着床于包含用于除去土壤杆菌的抗生素的培养基上后，培养5天。然后，从培养后的未成熟胚切除胚轴，再于同培养基上培养7天后，进行转化细胞的选择、再分化。如以上所述，在利用土壤杆菌进行的小麦的转化中，采用传统方法虽可获得转化植物，但转化效率远低于同为单子叶作物的稻、玉米，且实验的重现性也存在问题。因而，希望开发出能够以高效率获得转化体的、重现性高的方法。此外，对于小麦，关于胚轴的切除， 在进行切除的时期方面有各种种报告，尚未获得确定的认识。现有技术文献专利文献专利文献1 特表 2002-541853专利文献2 :Μ)1"8/054961专利文献3 :W02002/012520专利文献4 特开 2000-023675专利文献5 :W02002/012521专利文献6 :W02005/017169专利文献7 :W02005/017152专利文献8 :W02007/069643非专利文献非专利文献 1 :De Cleene, Μ. and De Ley, J. (1976) The host range of crown gall. Bot. Rev. 42 :389-466.非专利文献 2 :Potrycus，I (1990) Gene transfer to cereals :an assessment. Bio/technology 8 :535-542.非专利文献3 :Hiei, Y.，Ohta，S.，Komari，Τ· and Kumashiro,T. (1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6 :271-282.非专利文献4 Jshida, Y.，Saito, H.，Ohta, S.，Hiei, Y.，Komari, Τ. and Kumashiro,Τ. (1996) High efficiency transformation of maize(Zea mays L. )mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14 :745-750.非专利文献 5 Cheng, Μ.，Fry, J. Ε.，Pang, S.，Zhou, H.，Hironaka, C. Μ.，Duncan, D. R. , Conner, Τ.W. , Wan, Y. (1997)Genetic transformation of wheat mediated byAgrobacterium tumefaciens. Plant Physiol. 115 :971-980.非专利文献 6 :Tingay, S.，McElroy，D.，Kalla, R.，Fieg, S.，Wang, Μ.，Thornton， S. , Brettell, R. (1997)Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. Plant J. 11 :1369-1376.非专利文献7 :Zhao，Ζ. _Υ·，Cai, Τ.，Tagliani，L，Miller, Μ.，Wang, N.， Peng，H.，Rudert，Μ.，Schoeder, S.，Hondred，D.，Seltzer, J.，Pierce，D. (2000) Agrobacterium-mediated sorghum transformation. Plant Mol. Biol. 44 :789-798.非专利文献 8 :Negrotto，D. ,JolleyiM. ,Beer, S.，Wenck，A.R. ,HanseniG. (2000) The use of phosphomannose-isomerase as a selection marker to recover transgenic maize plants(Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Reports 19 :798-803.9 :Zhao,Z.-Y. ,Gu, W. ，Cai，T. ,TaglianiiL. ,HondrediD. , Bond, D.， Schroeder, S.，Rudert, Μ.，Pierce，D. (2001)High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Mol. Breed. 8 :323-333.非专禾Ij 文献 10 Frame, B. R.，Shou, H.，Chikwamba，R. K.，Zhang，Ζ.，Xiang， C. ， Fonger, Τ. Μ. ， Pegg， S. Ε. K. ， Li, B. ， Nettleton, D. S. ， Pei, D. ， Wang, K. (2002) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant Physiol. 129 :13-22.非专利文献11 :Ishida，Y.，Saito，H.，Hiei，Y.，Komari, Τ. (2003) Improved protocol for transformation of maize (Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Biotechnology 20 :57-66.非专利文献12 :Hiei，Y.，Ishida，Y.，Kasaoka，K.，Komari, Τ. (2006) Improved frequency of transformation of rice and maize by treatment of immature embryos with centrifugation and heat prior to infection with Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture 87 :233-243.非专禾Ij 文献 13 :Hiei，Y.，Komari，Τ. (2006) Improved protocol for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture 85 :271-283.# ^ ^lJ i K 14 :Cheng et al. (2004) Invited revier :Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 40 :31-45.非专禾Ij文献 15 :Frame et al. (2006) Maize (Zea mays L.) Methods inMolecular Biology, vol.343 Agrobacterium prptocols， volume 1， Edited by Kan Wang, Humana Press Inc.，Totowa，NJ，185-199.非专利文献 16 :Ishida et al. (2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nature Protocols 2:1614—1621.非专禾Ij 文献 17 :Gurel et al. (2009) Eff icient， reproducible Agrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of immature embryos. Plant Cell Reports 28 :429-444.
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发明内容
发明所要解决的问题本发明的目的是提供与传统公知的土壤杆菌法相比能够以高效率进行转化的、 对小麦属(Triticum)的植物进行基因导入的方法，以及小麦属的转化植物的制作方法。解决问题的方法本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过与将接种了土壤杆菌的小麦属植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织用共存培养基进行培养的共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位，与传统方法相比，小麦属植物的转化效率提高，从而想到了本发明。本发明优选通过诸如以下记载的实施方式进行，但不限于此。[实施实施方式1]一种对小麦属(Triticum)植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织进行基因导入的方法，上述方法包括(i)进行将接种了土壤杆菌的上述组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤·’以及(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。[实施方式2]一种小麦属(Triticum)植物的转化植物的制作方法，上述方法包括(i)进行将接种了土壤杆菌的未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤；(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤；(iii)进行对上述组织用休眠培养基进行培养的休眠步骤；然后(iv)进行对上述组织用再分化培养基进行再分化的步骤。[实施方式3]实施方式1或2所述的方法，其中，在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、 幼芽和胚轴中的至少一个部位是从组织去除选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位。[实施方式4]
实施方式1 3中任一项所述的方法，其中，与所述共存步骤同时和/或在该共存步骤开始后7天以内，进行在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。[实施方式5]实施方式1 3中任一项所述的方法，其中，所述共存步骤开始后1天 3天，进行在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。[实施方式6]实施方式1 5中任一项所述的方法，其中，所述共存培养基是不含植物生长调节剂的培养基。[实施方式7]实施方式1 6中任一项所述的方法，其中，进行以下的转化效率提高处理中的至少1个。a)离心处理；b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜；c)热处理；d)热和离心处理；e)加压处理；f)在粉末存在下接种土壤杆菌的处理；g)在共存培养基中添加半胱氨酸的处理。[实施方式8]实施方式1 6中任一项所述的方法，其中，进行以下的a)和/或b)的转化效率
提高处理。a)离心处理；b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜。[实施方式9]实施方式2 8中任一项所述的方法，其中，在上述(iii)休眠步骤与(iv)再分化步骤之间包括药物选择步骤。[实施方式10]实施方式2 9中任一项所述的方法，其中，(iii)休眠培养基和/或药物选择步骤的选择培养基包含植物生长调节剂。[实施方式11]实施方式1 10中任一项所述的方法，其中，所述土壤杆菌是选自LBA4404、 EHA101、EHA105、AGL1C 和 58C1 中的菌。[实施方式12]实施方式1 11中任一项所述的方法，其中，小麦属植物是普通小麦 (T. aestivum)或硬粒小麦(T. durum)。发明的效果根据本发明，能够以高效率进行小麦属植物的转化。由此，能够稳定、且重现性好地获得转化后的植物体，还可以削减用于获得该植物体的成本。
图1是显示幼根、幼芽和胚轴的切除对从接种了土壤杆菌的小麦未成熟胚形成愈伤组织的影响的图表。测试各区36-43的未成熟胚。而且，在图1的实验中，在接种土壤杆菌后、切除幼根、幼芽和胚轴前，将小麦未成熟胚着床于共存培养基。纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成指数，横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴并着床于休眠培养基的天数。愈伤组织形成指数是在接种后第9天，对各个未成熟胚采用以下3个等级进行评价而得到的值1 (胚盘的一半以上愈伤组织化)、0. 5 (胚盘的一部分愈伤组织化)、0 (无愈伤组织形成)。横轴的“0天”表示在接种土壤杆菌前切除了胚轴的未成熟胚。“2天无切除”表示在未切除胚轴的情况下接种土壤杆菌后、在未切除胚轴的情况下在接种土壤杆菌后第2天着床于休眠培养基的未成熟胚。图2是显示幼根、幼芽和胚轴的切除对接种了土壤杆菌的小麦未成熟胚的愈伤组织形成的影响的图表。而且，在图2的实验中，无论在第几天进行切除，均是在接种并开始共存培养后的第2天将小麦未成熟胚着床于休眠培养基。纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成指数，横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴的天数。愈伤组织形成指数的计算方法同图1。横轴的“0天”表示在接种土壤杆菌前切除了胚轴的未成熟胚。“无切除”表示在未切除胚轴的情况下接种土壤杆菌后、在未切除胚轴的情况下在接种土壤杆菌后第2天着床于休眠培养基的未成熟胚。图3是表示针对离心处理的时期对转化效率的影响进行研究的结果的图表。在图 3中，A区是在对未成熟胚接种土壤杆菌之前，进行了 15，000rpm、10分钟的离心处理的实验区。B区是对未成熟胚接种土壤杆菌并切除了幼根、幼芽和胚轴后，进行了 15，OOOrpmUO分钟的离心处理的实验区。C区是对未成熟胚接种土壤杆菌并进行15，OOOrpm, 10分钟的离心处理后，进行了幼根、幼芽和胚轴的切除的实验区。对于各个未成熟胚，采用以下6个等级， 对用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的GUS基因的表达进行了评价4(在胚盘的75% 以上中表达)、3 (在胚盘的50-74%中表达)、2 (在胚盘的25 49%中表达)、1 (在胚盘的 5 对％中表达)、0.5(在胚盘的1 4%中表达)、0(无表达)。对于各区19 25个未成熟胚进行评价，其平均值如图3的纵轴所示。S卩，在图3中，纵轴表示根据GUS基因的表达对基因导入效率进行评价的结果。图4是显示添加在共存培养基中的5 μ M植物激素的添加对转化效率的影响的研究结果的图表。图4中的3个柱从左起分别表示未添加植物激素的实验区、添加5 μ M的细胞分裂素(kinetin)的实验区和添加5 μ M的4PU的实验区。对于各个未成熟胚，采用以下6个等级评价了用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的GUS基因的表达4 (在胚盘的 75%以上中表达)、3 (在胚盘的50-74%中表达)、2 (在胚盘的25 49%中表达)、1 (在胚盘的5 Μ%中表达)、0. 5(在胚盘的1 4%中表达)、0(无表达)。对于各区16 17 个未成熟胚进行评价，其平均值示于图4的纵轴。S卩，图4中，纵轴表示根据GUS基因的表达对各实验区的基因导入效率进行评价的结果。图5是显示添加在共存培养基中的0. 5 μ M的植物激素的添加对转化效率的影响的研究结果的图表。图5中的4个柱从左起分别表示未添加植物激素的实验区、添加0. 5 μ M 的2，4-D的实验区、添加0. 5 μ M的毒莠定的实验区、和添加0. 5 μ M的二氯甲氧苯酸的实验
11区。对于各个未成熟胚，采用以下6个等级评价了用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的⑶S基因的表达4(在胚盘的75%以上中表达)、3 (在胚盘的50-74%中表达)、2 (在胚盘的25 49 %中表达)、1 (在胚盘的5 中表达)、0. 5 (在胚盘的1 4%中表达)、 0(无表达)。对各区10个未成熟胚进行评价，其平均值示于图5的纵轴。S卩，在图5中，纵轴表示根据GUS基因的表达对各实验区的基因导入效率进行评价的结果。图6是显示添加在共存培养基中的5μΜ植物激素的添加对转化效率的影响的研究结果的图表。图6中的4个柱从左起分别表示未添加植物激素的实验区、添加5 μ M的毒莠定的实验区、添加5μ M的2，4-D的实验区、和添加5μ M的二氯甲氧苯酸(Dicamba)5yM 的实验区。对于各个未成熟胚，采用以下6个等级评价了用休眠培养基培养5天后的未成熟胚中的⑶S基因的表达4(在胚盘的75%以上中表达)、3(在胚盘的50-74%中表达)、 2 (在胚盘的25 49%中表达)、1 (在胚盘的5 中表达)、0. 5 (在胚盘的1 4%中表达)、0(无表达)。对各区18 19个未成熟胚进行评价，其平均值示于图6的纵轴。艮口， 在图6中纵轴表示根据GUS基因的表达对各实验区的基因导入效率进行评价的结果。发明的
具体实施例方式
以下对本发明的构成进行具体说明。本发明提供一种基因导入方法，其是对小麦属(Triticum)植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织进行基因导入的方法，其包括(i)进行将接种了土壤杆菌的上述组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤；(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。本发明还提供一种方法，其是小麦属(Triticum)植物的转化植物的制作方法，其包括(i)将接种了土壤杆菌的、未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤；(ii)与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，进行在上述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤；(iii)进行将上述组织用休眠培养基进行培养的休眠步骤；然后(iv)进行将上述组织用再分化培养基进行再分化的步骤。在本发明中，可使用的植物组织所来源的植物是小麦属植物。而且，作为本说明书中的“小麦属”植物的例子，并非限定，作为一粒系小麦，可以列举出野生一粒小麦 (T. aegilopoides)、沙达一粒小麦(T. thaoudar)、禾口、一粒小麦(T. monococcum)；作为二粒系小麦，可以列举出野生二粒小麦(T. dicoccoides)、栽培二粒小麦(T. dicoccum)、金字塔形穗小麦(T.pyromidale)、高粒山小麦(T. orientale)、硬粒小麦(T. durum)、圆锥小麦 (T. turgidum)、波兰小麦(T.polonicum)、和波斯小麦(T. persicum)；作为三粒系小麦，可以列举出普通小麦(T. aestivum)、斯卑尔脱小麦(T. spelta)、密穗小麦(T. compactum)、印度圆粒小麦(T. sphaerococcum)、莫迦小麦(T. maha)和瓦维洛夫小麦(T. vavilovii)。在本发明中，普通小麦(T. aestivum)或硬粒小麦(T. durum)是优选的，普通小麦(T. aestivum) 是特别优选的。
此外，在本发明中可使用的植物组织是未成熟胚和完全成熟种子，优选未成熟胚。 在本说明书中“未成熟胚”是指处于受粉后的成熟过程中的未成熟种子的胚。对用于本发明的方法的未成熟胚的时期(熟期)没有特殊限制，可以在受粉后的任何时期采集，优选受粉后7 21天后的未成熟胚。此外，在本说明书中“完全成熟种子”是指受粉后的成熟过程结束、作为种子已完全成熟。以下对上述各步骤进行具体说明。1.关于本发明的各步骤本发明的基因导入方法以及转化植物的制作方法利用土壤杆菌细菌。除了特别提及的步骤以外，可以按照公知的利用土壤杆菌细菌的基因导入方法、转化方法的各步骤来进行。(1)关于共存步骤在本发明中，进行将接种了土壤杆菌的、未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤。本步骤是通过将接种了土壤杆菌的植物组织在土壤杆菌的共存下进行培养，切实地进行从土壤杆菌向植物细胞的DNA的导入的步骤。本发明的基因导入方法和转化植物的制作方法中，优选从小麦属植物的植物体分离、采集可使用的植物组织后使用。因此，在本发明中，首先从小麦属植物的植物体分离、采集组织(未成熟胚、完全成熟种子)，然后进行对该分离、采集的组织接种土壤杆菌。在本发明中，所使用的植物组织为未成熟胚时，对其大小没有特殊限制。例如，非专利文献33中使用的小麦未成熟胚的大小是Imm ；此外，Jones等000 (非专利文献34) 记载，小麦的转化中使用的未成熟胚的大小必须是0. 8-1. 5mm。但是，本发明人等发现在小麦中，具有一定以上的大小能够进一步提高转化效率 (实施例10)。因此，在本发明中使用的小麦未成熟胚优选具有一定以上的大小。并非限定， 接种土壤杆菌时的小麦未成熟胚优选1. 2mm以上的大小、更优选超过1. 5mm的大小、最优选 2. 2mm以上。而且，进一步，对本发明中使用的小麦未成熟胚的大小的上限没有特殊限制，可以是能够从作为基因导入的对象的小麦属植物获得的最大的未成熟胚。例如，能够从Fielder 品种获得的最大的未成熟胚是通常3. Omm左右的大小，这样的未成熟胚也优选利用。诸如上述的植物组织可以进行用于提高转化效率的各种处理。作为这样的处理， 可以列举出例如加热处理(专利文献幻、离心处理(专利文献幻、热和离心处理(专利文献5)、以及加压处理(专利文献6)等。这样的处理可以在土壤杆菌的接种之前实施，也可以与土壤杆菌的接种同时进行，或者还可以在土壤杆菌的接种之后实施。这样的用于提高转化效率的处理将在后面详述。在本发明中，对小麦属植物的组织接种土壤杆菌。本说明书中使用的“接种”是指使土壤杆菌与植物的组织(例如胚盘)接触，本技术领域中各种接种土壤杆菌的方法是公知的。作为本方法，可以列举出例如在将土壤杆菌悬浮在液体培养基中而得到的悬浊液中加入植物组织的方法、将土壤杆菌的悬浊液直接滴加到共存培养基上的植物组织上的方法、向植物组织中注入土壤杆菌悬浊液的方法、和将植物组织浸渍在土壤杆菌悬浊液中并减压的方法等。然而，本发明中的土壤杆菌的接种方法不限于上述方法。在接种该土壤杆菌时，为了改善利用土壤杆菌的转化效率，可以使土壤杆菌的悬浊液中包含例如乙酰丁香酮、表面活性剂、多孔性陶瓷等各种添加剂。对本发明中可使用的土壤杆菌没有特殊限制，可以是在利用土壤杆菌的转化法中可使用的、公知的任何土壤杆菌。在本发明的优选方式中，土壤杆菌为例如LBA4404、 EHAlOl、EHA105、AGL1和C58C1等，但不限于此。当在载体方面不使用超级二元载体(非专利文献3和4)时，从转化效率的观点来看，优选使用含有土壤杆菌A281 (非专利文献31) 所具有的Ti质粒PTiBo542的菌株。公知土壤杆菌具有将插入在土壤杆菌内的质粒T-DNA中的基因导入到植物的基因组中的性质。因此，可在本发明中使用的土壤杆菌具有将希望在植物内表达的基因插入到T-DNA中而得到的质粒。于是，通过将具有该质粒的土壤杆菌接种到植物组织，可以转化植物。这样，可以赋予组织中的植物细胞以优选的性状。可在本发明中使用的土壤杆菌用质粒例如有 pSB131、U0009B、U0017S、pSB134、pNB131 和 pIG121Hm 等，但不限于此。本步骤中使用的培养基在本说明书中称为“共存培养基”。共存培养基可以是植物细胞培养中通常使用的培养基，可以列举出例如以LS无机盐类(非专利文献27)、N6无机盐类(非专利文献28)为基本成分的培养基。此外，并非限定，优选降低了诸如上述的通常在组织培养中使用的培养基中所含的无机盐类和/或维生素量的培养基，更优选降低至 1/5以下的培养基，更优选降低至1/10以下的培养基，具体地可以适合使用1/10浓度MS培养基等。Ke等Q002)(非专利文献30)公开了对于大麦使用不含植物生长调节剂的共存培
养基的例子。但是，并不限于此，在本发明中共存培养基中可以添加2，4_ 二氯苯氧基乙酸0， 4-D)、毒莠定、或其他生长素类作为生长素类。或者，还可以添加细胞分裂素、4PU这样的细胞分裂素等其他植物生长调节剂。而且，本发明人等发现如下述的实施例1和9所示，共存培养基中的生长素类的浓度低，则转化效率提高。因此，在本发明中，共存培养基中所含的生长素类的浓度没有特殊限制，优选5 μ M以下、更优选0. 5 μ M以下，最优选完全不含生长素类的方式。而且，为了提高转化效率，还可以在共存培养基中加入各种添加剂。作为这样的添加剂，可以列举出例如硝酸银(专利文献4)、硫酸铜(专利文献7)和半胱氨酸(非专利文献14)等。本步骤中“培养”是指使植物组织着床(置床)于固体化的共存培养基上或液态共存培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长发育。在本发明中，培养基的方式没有特殊限制，只要能够对植物组织充分供给培养基成分即可。共存培养基的固体化可以通过添加本技术领域公知的固体化剂来进行，作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。在本发明中，可以适合使用这样的固体化的共存培养基。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20°C _35°C、更优选在23°C进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选为1天-5天、更优选为2天。 步骤
与上述的共存步骤同时和/或在该共存步骤后，进行在组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。本发明的特征之一是通过提高该步骤基因导入的效率和植物的转化的效率。在本发明中，对用于“物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位”的手段没有特殊限制，包括各种物理的处理和化学的处理。并非进行限定，物理的处理包括例如用锋利的刀具(例如手术刀)进行切除或者伤害、利用具有锋利尖端的器具(例如镊子)进行去除或者伤害等。化学的处理包括例如利用使植物细胞的机能消失或者降低的酸性、碱性物质、对细胞具有毒性的除草剂成分等药物进行处理等。在本发明中，物理地“去除”选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位是优选的方式。而且，胚是将来成为植物体的部分，包含幼根、幼芽、胚轴。胚轴是指作为胚的轴的圆柱形部分，其上端长出幼芽，其下端长出幼根。在本说明书中，幼根、幼芽、胚轴应理解为本技术领域中通常使用的含义。此外，在本说明书中，“选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位”(以下称为“上述部位”)是指选自幼根、幼芽、胚轴中的1个、2个、或3个部位的全部组合。具体地，其组合如下；1)幼根、2)幼芽、3)胚轴、4)幼根和幼芽、5)幼根和胚轴、6)幼芽和胚轴、7)幼根和幼芽和胚轴。对于作为本发明的对象的小麦属植物而言，即使进行共存培养，该步骤中也不会有像稻一般的程度的芽、根伸长。因此，在本发明中，若在共存培养后进行去除胚轴的操作， 则实际上多是与胚轴干一起切除幼根和幼芽。但是，如果在切除胚轴时，没有伤害幼根、幼芽，则残留的幼根、幼芽有伸长的可能性。为了进行土壤杆菌介导的基因导入，有必要使植物组织脱分化而愈伤组织化，所以不优选幼根、幼芽这样地伸长。因此，与胚轴一起切除幼根、幼芽，是本发明中的适宜方式。但是，通过在尚未长出幼根、幼芽的状态的胚轴中仅去除胚轴，也能够实现本发明的目的。与共存步骤同时和/或在共存步骤后物理地/化学地损伤上述部位这一点是本发明的最显著的特征。在本说明书中，“在共存步骤之后”是指在共存步骤后进行的休眠步骤中，对在土壤杆菌共存下培养的小麦属植物的上述部位进行物理的/化学的损伤。此外，在本说明书中，“与共存步骤同时”是指在进行共存步骤的期间物理地/化学地损伤上述部位。这样的情况也包含在本发明中，作为一个方式。此外，在本说明书中，“与共存步骤同时和/或在共存步骤之后”是指1)在共存步骤中损伤上述部位的实施方式，例如，在共存步骤中将植物组织从共存培养基取出，进行损伤处理，再放回共存培养基的实施方式；2)在共存步骤后、休眠步骤前损伤上述部位的实施方式；3)在休眠步骤中损伤上述部位的方式，例如，在休眠步骤中将植物组织从休眠培养基取出，进行损伤处理，再放回休眠培养基的实施方式；和4)在上述1) 幻中任意的多个阶段中损伤上述部位的实施方式。这些实施方式全部包含在本发明中。作为进行上述的损伤的时期，并非限定，优选在共存步骤开始后7天以内进行。更优选在共存步骤开始后1天 3天进行。若在共存步骤开始后1天 3天切除幼根、幼芽切除前转移至下述的休眠培养基，均可见愈伤组织诱导率和基因导入效率的提高，如实施例2和实施例3所示。(3)关于休眠步骤本发明的转化植物的制作方法中，在上述共存步骤后进一步经过休眠步骤、再分化步骤，制作转化植物。在休眠步骤中，在共存步骤后将植物组织用休眠培养基进行培养。本步骤是在共存步骤后从植物细胞除去土壤杆菌的同时、进行植物细胞的增殖的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中中称作“休眠培养基”。休眠培养基可以是植物细胞培养中通常使用的，可以列举出例如以LS无机盐类(非专利文献27)、N6无机盐类 (非专利文献28)为基础的培养基等。而且，本步骤中的休眠培养基优选包含抗生素。休眠培养基中所含的抗生素与下述的选择步骤中使用的选择用抗生素不同，其以土壤杆菌的除菌为目的。并非限定，作为抗生素，可以优选使用头孢噻肟和/或羧苄西林。本步骤中的休眠培养基中优选包含植物生长调节剂。作为植物生长调节剂，优选包含属于生长素类的毒莠定和/或2，4-D。生长素类一般具有使植物组织脱分化的作用， 因而本步骤和接下来的选择步骤中，基本上所有植物组织的一部分或全部成为脱分化组织 (愈伤组织)。本说明书中使用的术语“脱分化组织”或“愈伤组织”是指通过用含生长素和细胞分裂素等植物生长调节剂的培养基培养经分化的植物组织的一部分(外植体)而得到的组织，该组织是无定形的未分化状态的细胞块，其不具有作为原来的植物组织的形态。 因此，所有涉及脱分化组织的实施方式，包括以脱分化组织的状态开始进行共存步骤的情况，以及分化的植物组织在共存步骤中或后续的选择步骤中全部脱分化和部分脱分化的情况等等，均在本发明的范围内。本步骤中“培养”是指使植物组织着床于固体化的休眠培养基上或液体休眠培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本发明中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对植物组织充分供给培养基成分即可。休眠培养基的固体化可以通过添加本技术领域公知的固体化剂来进行，作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20°C -35°C、更优选25°C进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选为1天-10天、更优选为5天。(4)选择步骤以下记载的选择步骤和再分化步骤为在利用土壤杆菌的植物的转化方法中通常采用的方法。而且，在本发明的转化植物的制作方法中，该选择步骤不是必需的。这是因为， 例如在进行后述的转化提高处理的情况下，即使不经过选择步骤，也能够获得目的转化体。 而且，在进行选择步骤的情况下，以下的记载仅用于示例，本发明不受以下的记载的限定。本步骤是从上述步骤获得的组织中根据基因导入的有无来选择转化体的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“选择培养基”。可作为选择培养基使用的培养基可以列举出例如以LS无机盐类(非专利文献27)、N6无机盐类(非专利文献28)为基本成分的培养基，具体地有例如LSD1. 5培养基等。根据一般的使用土壤杆菌的转化法，选择培养基中添加生长素类、优选2，4_D和/ 或毒莠定。在本发明中，选择培养基中包含植物生长调节剂也是优选的方式。本选择步骤
16中使用的生长素类没有特殊限制，优选2，4-D和/或毒莠定。而且，视需要可以加入各种添加剂。转化植物的选择，可以通过例如用含适当选择药物的选择培养基培养经过上述共存步骤和/或休眠步骤的植物，根据有无对选择药物的抗性来进行。作为可以在本步骤中使用的选择药物，可使用本技术领域通常使用的选择药物。例如，作为选择药物，可以使用抗生素或除草剂。作为抗生素，可以使用例如潮霉素(Hygromycin)、卡那霉素或灭瘟素 S(blastcidin S)等。而且，作为除草剂，可以使用例如草胺膦(phosphinothricin)、双丙氨膦(bialaphos)或草甘膦(glyphosate)等。为了进行本选择步骤，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA，不仅要包含希望在植物中表达的基因，还必须包含例如对选择药物的抗性基因等。这样的对选择药物的抗性基因在本技术领域是公知的。在本步骤中，例如在含潮霉素的选择培养基中进行选择的情况下， 除了希望在植物内表达的基因外，还必须导入潮霉素抗性基因。或者，转化植物的选择可以基于植物细胞的糖营养缺陷性(糖要求性)来进行。 已知植物细胞能够利用的糖有蔗糖、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，用仅含甘露糖作为碳源的培养基培养植物组织时，由于没有可利用的糖，植物组织会枯死。基于糖营养缺陷性的选择正是利用了这一原理。即，为了利用该选择方法，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA除了希望在植物中表达的基因外，还必须包含磷酸甘露糖异构酶(phosphomarmose isomerase :PMI)基因。此处，导入了 PMI基因的植物细胞能够利用甘露糖作为碳源。因此，仅有用如上述的土壤杆菌转化了的植物组织能够在仅以甘露糖为碳源的培养基上生长发育，这样就能够仅选择出转化植物组织(非专利文献8)。这样的方法也可以针对其它糖进行。例如，导入了木糖异构酶基因的植物细胞能够利用木糖作为碳源，因此适用于这种方法。此外，可以导入容易检测的基因作为筛选的指标，通过有无该基因的表达来进行选择。作为这种作为筛选的指标的基因，可以列举出GFP基因等。检测表达这些基因的细胞、组织的方法是本技术领域公知的。本步骤可以变更培养基的成分组成，反复进行多轮。例如，在多轮选择步骤中，通过在各轮选择步骤中提高选择药物的浓度，可以增强药物选择的切实可行性，提高获得转化植物体的可能性。本选择步骤优选进行至少1轮、更优选进行2轮。此外，在进行多轮选择步骤的情况下，通过切割取下用含选择药物的培养基培养的组织中的增殖部分，仅将该增殖部分用于下一轮选择步骤，可以高效地获得转化组织。本步骤中“培养”是指使植物组织着床于固体化的选择培养基上或液体选择培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本发明中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对培养基成分充分供给植物组织即可。选择培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20°C _35°C、更优选在 25°C进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，例如，在进行2轮选择步骤的情况下，可以第1轮选择进行2周、第2轮选择进行3 周，共计5周。此外，多轮选择步骤整体优选进行3-8周、更优选4-6周。此外，在进行多轮的选择的情况下，可以变更每轮的培养时间、温度和明暗条件。(5)再分化步骤
将用休眠培养基培养得到的组织，视需要进行选择后，进行用再分化培养基进行再分化的步骤。本步骤中使用的培养基在本说明书中称作“再分化培养基”。再分化培养基不含生长素类。作为再分化培养基，可以列举出例如以LS无机盐类、N6无机盐类为基本成分的培养基，具体例如有LSZ培养基等。再分化培养基可以包含选择药物。可以在本步骤中使用的选择药物与选择步骤中定义的相同。然而，在本步骤中，并非一定要使用与选择步骤中使用过的选择药物相同的选择药物。在这种情况下，必须从土壤杆菌向植物中导入针对2种以上的选择药物的抗性基因。本发明中“再分化”是指全部或部分脱分化的植物组织重新获得原植物组织或植物体的性质。若在共存步骤和/或选择步骤中使用生长素类，植物组织的全部或一部分脱分化。因此，通过进行本步骤，脱分化组织发生再分化，可以获得完整的转化植物体。本步骤中“培养”是指使植物组织着床于固体化的再分化培养基上或液体再分化培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间内生长发育。在本发明中，对培养基的形态没有特殊限制，能够对植物组织充分供给培养基成分即可。再分化培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20°C _35°C、更优选25°C进行。此外，本步骤的培养优选在16-M小时/天的照明下进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选7天-21天，更优选14天。2.关于本发明中采用的转化提高处理此外，在本发明的基因导入方法和转化植物的制作方法中，可以进行下述的转化提高处理。在本说明书中，“转化提高处理”是指用于实现转化效率的提高的处理。作为这样的转化提高处理，并非限定，包括例如以下这样的处理或者它们的组合。这样的处理可以在土壤杆菌接种前实施，也可以与土壤杆菌接种同时进行，或者还可以在土壤杆菌接种后实施，在土壤杆菌接种后实施时，可以在切除胚轴前或后进行。a)离心处理(参照W02002/012520 专利文献3)、b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜(参照=AgNO3 (Zhao等2001 非专利文献9、Ishida等2003 非专利文献11、专利文献4) ；CuSO4(W02005/017152 专利文献7))、c)热处理(参照W01998/0M961 专利文献2)、d)热和离心处理(参照W02002/012521 专利文献5)、e)加压处理(参照W02005/017169 专利文献6)、f)在粉末存在下接种土壤杆菌的处理(参照W02007/069643 专利文献8)、以及g)在共存培养基中添加半胱氨酸的处理(Frame等2002 非专利文献10)。这其中，离心处理、热处理、热和离心处理、加压处理、粉末的添加均是提高基因导入效率的处理，而硝酸银、硫酸铜的添加具有提高愈伤组织诱导率的效果。此外，在再分化培养基中添加硫酸铜，可以提高再分化效率。并非限定，离心处理可以采用例如W002/012520(专利文献3)所述的方法来进行。 例如，在使植物材料与土壤杆菌接触之前，以100G 25万G、优选500G 20万G、更优选 1000G 15万G的离心加速度处理1秒 4小时、更优选1秒 2小时。此外，离心处理可以在共存步骤后进行。本发明人等发现若对小麦进行离心处理，则具有提高愈伤组织诱导率的效果。这种情况下的离心处理条件可以与专利文献3所述的条件相同。具体地，可以在通常100G 25万G、500G 20万G、优选1000G 15万G、 最优选1100G 11万G左右的离心加速度范围进行。此外，离心处理的时间可以根据离心加速度适宜选择，通常优选进行1秒钟以上。对离心时间的上限没有特殊限制，通常10分钟左右即可实现目的，可以进行1秒钟 4小时、更优选1秒钟 2小时处理。此外，在离心加速度大的情况下，离心处理时间即使是极短时间、例如1秒以下也能够显著提高基因导入效率。另一方面，在离心加速度小的情况下，通过长时间进行离心处理，能够显著提高基因导入效率。而且，合适的离心处理条件可以通过常规实验容易地设定。如以上所述的离心处理可以在共存培养前进行，或者也可以在共存培养后、切除胚轴前或后进行。因此，在本发明中，共存培养前和/或共存培养后进行植物材料的离心处理是适宜方式。在共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜，记载于例如^iao等2001 (非专利文献9)、Ishida等2003(非专利文献11)、W02005/017152。硝酸银和/或硫酸铜可以以例如 1 μ M 50 μ Μ、优选1 μ M 10 μ M的浓度添加到共存培养基中。热处理可以采用例如W01998/0M961(专利文献2)所述的方法来进行。例如，在使植物材料与土壤杆菌接触前，于33°C 60°C、优选37°C 52°C处理5秒 M小时、优选 1分钟 24小时。热和离心处理可以采用例如W02002/012521 (专利文献5)所述的方法来进行。热处理以及离心处理的条件可以采用例如上述条件。加压处理可以采用例如W02005/017169(专利文献6)所述的方法来进行。并非进行限定，加压处理优选在1. 7个大气压 10个大气压的范围、更优选2. 4个大气压 8个大气压的范围进行。此外，加压处理可以在共存步骤后进行。本发明人等发现若对小麦进行加压处理，则具有提高愈伤组织诱导率的效果。这种情况下的加压处理的条件可以与专利文献6 所述的方法相同。此外，加压处理可以在共存培养前进行，或者也可以在共存培养后、切除胚轴前或后进行。因此，在本发明中，共存培养前和/或共存培养后进行植物材料的加压处理是适宜方式。在粉末存在下接种土壤杆菌的处理，可以采用例如W02007/069643(专利文献8) 所述的方法。具体地，可以采用例如下述方法来进行将土壤杆菌悬浊液与粉末混合来接种植物材料，或者，将植物与粉末混合，并用土壤杆菌对其进行接种。对于粉末没有限制，可以是多孔质粉末、玻璃棉或活性炭，优选多孔性陶瓷、玻璃棉或活性炭，更优选羟基磷灰石、硅胶、玻璃棉。在共存培养基中添加半胱氨酸的处理，可以以10mg/L lg/L、优选50mg/L 750mg/L、更优选100mg/L 500mg/L在共存培养基中添加半胱氨酸。本领域技术人员可以在适宜的时机/条件下进行这些处理。此外，从提高转化效率的角度出发，更加优选对它们进行适宜组合。因此，优选的转化提高处理是离心处理、热处理、热和离心处理、加压处理、在粉末存在下接种土壤杆菌的处理、或者在共存培养基中添加半胱氨酸的处理，或者所述处理的组合。而且，如下述的实施例所示，离心处理与在共存培养基中添加AgNO3和/或CuSO4的处理的组合也是优选的本发明的方式。
3.本发明的方法的效果根据本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作方法，能够以高效率进行小麦属植物的转化。因此，能够实现植物的转化效率的提高。在本说明书中“转化效率高”是一个包含以高效率将目的基因导入植物细胞、从未成熟胚等以高效率诱导愈伤组织、以及从转化愈伤组织以高效率引起再分化的概念。此外， 在本说明书中“转化效率提高”是一个包含目的基因对植物细胞的导入效率提高、未成熟胚等的愈伤组织诱导率提高、以及转化愈伤组织的再分化效率提高的概念。而且，在后述的实施例2中，实际揭示了与传统的方法相比，本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作方法实现了愈伤组织形成率的提高和基因导入效率的提高。而且，根据本发明的基因导入方法与本发明的转化植物的制作方法，还可以得到植物的转化效率的重现性高、转化实验间的偏差少、稳定地获得转化植物等有利效果。这些效果在广义上也包含在上述的“转化效率高”、和“转化效率提高”的概念中。植物组织是否接受了基因导入，可以采用公知的各种方法来确定。例如通过使转化的基因为GUS ( β -葡糖醛酸酶)基因、萤光素基因或者GFP基因等报告基因，采用简便公知的方法目测观察这些报告基因的表达部位，可以确认有无转化。此外，可以利用抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等选择标记基因的表达，通过用含抗生素或者除草剂的培养基培养植物细胞、或者用抗生素溶液、除草剂溶液处理植物，以其抗性的表达为指标，来确认有无转化。为了更切实地确定是否发生了基因导入，例如可以这样进行采用Southern杂交法确认导入基因整合到植物染色体上、以及确认导入基因在子代植物中的表达(遗传给子代)等。Southern杂交法可以按公知方法进行，例如按分子克隆(Molecular Cloning)(非专利文献沈)中记载的方法进行。此外，子代植物中表达的确认，可以通过考察GUS基因等报告基因的表达、除草剂耐性基因等选择标记基因的表达的方法来施行。具体而言，可以按非专利文献4记载的方法进行，但不限于此。基因导入效率可以采用本领域技术人员一般使用的计算方法来确定。例如，可以通过用发生了基因导入的植物数除以接种了土壤杆菌的植物组织数而求出。关于愈伤组织形成率，可以例如通过目测分等级评价愈伤组织是否形成并取平均值。例如，可以像后述实施例那样用3个等级评价未成熟胚的愈伤组织形成1(胚盘的一半以上愈伤组织化)、0. 5 (胚盘的一部分愈伤组织化)、0 (无愈伤组织形成)(后述实施例中的愈伤组织形成指数)。或者，可以通过用愈伤组织形成数除以接种了土壤杆菌的植物组织数来求出。对于转化愈伤组织的再分化效率，例如可以通过像愈伤组织形成率那样，通过用再分化数除以接种了土壤杆菌的植物组织数来求出。
实施例以下，通过实施例说明本发明，但实施例仅为举例，并不是对本发明的限制。本发明的范围应以权利要求书的记载为准。而且，本领域技术人员基于本说明书的记载，可以容易地进行修正、变更。实施例1
■髓郝酣；材料和方法无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种=Bobwhite)的未成熟胚(大小 1. 5-2. 5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/ 1 MES、pH5. 8)洗涤1次。用于提高基因导入效率的前处理(15，OOOrpmUO分钟的离心处理)。在含100 μ M乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1. 0xl09cfu/ml的土壤杆菌系 EHA101(pIG121Hm)(非专利文献3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源， 搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含100 μ M乙酰丁香酮的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、IOg/ 1葡萄糖、0. 5g/l MES、pH5. 8、固体化剂为8g/l琼脂糖)和含5 μ M AgNO3和5 μ M CuSO4的 Co-Cul共存培养基。对照的培养基是含0. 5mg/l 2，4_D和2. 2mg/l毒莠定的Co-Cul共存培养基。从23°C、黑暗条件进行了 2天培养的未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0. 5g/l谷氨酰胺、0. lg/Ι酪蛋白水解物、0. 75g/l 六水合氯化镁、1. 95g/l MES、ρΗ5· 8、固体化剂 2g/l Gelrite、100mg/l 抗坏血酸、5 μ M AgN03、250mg/l 羧苄西林、100mg/l 头孢噻肟、2. 2mg/l 毒莠定、0. 5mg/l 2，4_D 的休眠培养基，25°C、黑暗条件下培养5天。将未成熟胚浸渍于含0. 1% Triton X-100的
0.IM磷酸缓冲液(pH 6.8)中，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1. OmM 5-溴-4-氯-3-吲哚基- β -D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理 M小时后，考察了⑶S基因的表达。MM在用包含2，4_D和毒莠定作为植物生长调节剂的对照的共存培养基培养的未成熟胚方面，在X-gluc染色后，染色的25个未成熟胚中均未见显示GUS基因的瞬时表达的蓝色斑点。与此相对，在用不含植物生长调节剂的共存培养基培养的未成熟胚方面，18个未成熟胚中有3个未成熟胚可见直径Imm以上的蓝色斑点。而且，在用添加了硝酸银和硫酸铜的不含植物生长调节剂的共存培养基培养的未成熟胚方面，18个未成熟胚中的7个未成熟胚可见直径Imm以上的蓝色斑点。这样可知通过从共存培养基除去植物生长调节剂，基因导入效率提高；通过添加硝酸银、硫酸铜，进一步促进了基因导入。实施例2幼禾艮、幼芽禾PKtt^li刀除对愈伤組jR形成禾口基因导入效率的效果(着床于共存J吝养基盲至切除)材料和方法无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种=Bobwhite)的未成熟胚(大小
1.5-2. 5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/ 1 MES、pH5. 8)洗涤1次。进行用于提高基因导入效率的前处理(15，OOOrpmUO分钟的离心处理)。在含100 μ M乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1. 0xl09cfu/ml的土壤杆菌系EHAlOl (pIG121Hm)(非专利文献3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。对于对照的未成熟胚，用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴后，接种了土壤杆菌。对于其他的未成熟胚，在保留幼根、幼芽和胚轴的状态下，接种了土壤杆菌。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含100 μ M乙酰丁香酮、5 μ M AgNO3和5 μ M CuSO4的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0.5g/l MES、pH5.8、固体化剂为8g/l琼脂糖)。23°C、黑暗条件下进行共
存培养。共存培养开始后第1、2、3天分别从约40个的未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、 幼芽和胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0. 5g/l谷氨酰胺、0. lg/Ι酪蛋白水解物、0. 75g/l六水合氯化镁、1. 95g/l MES、pH5. 8、固体化剂为2g/l Gelrite、100mg/l 抗坏血酸、5 μ M AgN03、250mg/l羧苄西林、100mg/l头孢噻肟、2. 2mg/l毒莠定、0. 5mg/l 2， 4-D的休眠培养基。对于接种土壤杆菌之前去除了幼根、幼芽和胚轴的对照的未成熟胚，共存培养开始后第2天使其着床于休眠培养基。此外，对于一部分的未成熟胚，在不除去幼根、幼芽和胚轴的状态下使其在共存培养开始后第2天着床于休眠培养基。25°C、黑暗条件下培养7-9天后，采用以下3个等级评价了未成熟胚的愈伤组织形成1 (胚盘的一半以上愈伤组织化)、0. 5 (胚盘的一部分愈伤组织化)、0 (无愈伤组织形成)(愈伤组织形成指数)。此外，对于共存培养开始后第2天去除了胚轴的未成熟胚、和接种土壤杆菌之前去除了胚轴的对照的未成熟胚中的一部分，将其浸渍于含0. 1% Triton X-100的0. IM磷酸缓冲液(PH6. 8)，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1. OmM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理M小时后，考察了 ⑶S基因的表达。MM1)愈伤组织形成愈伤组织形成的结果如图1所示。在图1中，纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成， 横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴并着床于休眠培养基的天数。共存培养开始后第1天去除幼根、幼芽和胚轴并着床于休眠培养基的未成熟胚显示出最高的愈伤组织形成率。随着直至去除幼根、幼芽和胚轴的期间延长，愈伤组织形成率降低。与共存培养开始后第2天未去除幼根、幼芽和胚轴而着床于休眠培养基的未成熟胚 (图1 :2天无切除)相比，同日去除幼根、幼芽和胚轴后着床于休眠培养基的未成熟胚显示出高的愈伤组织形成率。此外，在去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤杆菌的未成熟胚(图1 0天)中，基本未见愈伤组织形成。去除幼根、幼芽和胚轴后接种了土壤杆菌的未成熟胚中的愈伤组织形成指数为 0. 10 (图1 :0天)，未去除幼根、幼芽和胚轴而进行休眠培养的未成熟胚中的愈伤组织形成指数0. 33(图1 :2天无切除)，与此相对，共存培养开始后第1天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 51 (图1 :1天)，因此，愈伤组织形成率与接种土壤杆菌前切除幼根、幼芽和胚轴的传统方法相比提高至5倍，而与不切除胚轴的传统方法相比提高至1. 5倍。2)基因导入效率对于去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤杆菌的未成熟胚，18个未成熟胚中的1个未成熟胚了表达GUS基因。与此相对，对于共存培养开始后第2天切除幼根、幼芽和胚轴的
22未成熟胚，19个未成熟胚中的15个未成熟胚可见GUS基因的表达。实施例3鐘、白侧佘龍懒中、##士咨 ^m^fsm 2铺1 棚·縣，絲m /1沃剩彻佘)材料和方法无菌采集开花后第14天的普通小麦(品种=Bobwhite)的未成熟胚(大小 1. 5-2. 5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/ 1 MES、pH5. 8)洗涤1次。进行用于提高基因导入效率的前处理(15，OOOrpmUO分钟的离心处理)。在含100 μ M乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1. 0xl09cfu/ml的土壤杆菌系EHAlOl (pIG121Hm)(非专利文献3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含100 μ M乙酰丁香酮、5 μ M AgNO3和5 μ M CuSO4的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS 无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/l MES、ρΗ5· 8、固体化剂为8g/l琼脂糖)。23°C、 黑暗条件下进行共存培养。共存培养开始后第0、1、2、3、4、5天分别从15 16个未成熟胚用手术刀和镊子去除了幼根、幼芽和胚轴。对于共存培养刚开始后(第0天)去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，用Co-Cul共存培养基培养2天后，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、 0. 5g/l谷氨酰胺、0. lg/Ι酪蛋白水解物、0. 75g/l六水合氯化镁、1. 95g/l MES、pH5. 8、固体化剂为 2g/l GelriteU00mg/l 抗坏血酸、5 μ M AgN03、250mg/l 羧苄西林、100mg/l 头孢噻肟、2. 2mg/l毒莠定、0. 5mg/l 2，4_D的休眠培养基。而且，在本实施例中，无论第几天进行切除，均在接种开始共存培养后第2天着床于休眠培养基。对于共存培养开始后第1天去除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，用Co-Cul 共存培养基再培养1天后，着床于休眠培养基。对于共存培养开始后第2天去除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，在去除幼根、幼芽和胚轴后立即着床于休眠培养基。对于其他的未成熟胚，以带幼根、幼芽和胚轴的状态、在共存培养开始后第2天全部着床于休眠培养基。着床于休眠培养基后第1、2、3天(即共存培养开始后第3、4、5天)去除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚继续用休眠培养基进行培养。此外，对于一部分的未成熟胚，不去除幼根、幼芽和胚轴而在共存培养开始后第2天着床于休眠培养基(无切除)。25°C、黑暗条件下从接种起培养7天后，采用以下3个等级评价了未成熟胚的愈伤组织形成1 (胚盘的一半以上愈伤组织化)、0. 5 (胚盘的一部分愈伤组织化)、0 (无愈伤组织形成)(愈伤组织形成指数)。将愈伤组织形成评价后的未成熟胚浸渍于含0. 1 % Triton X-100的0. IM磷酸缓冲液(pH6.8)，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含1.0mM5-溴-4-氯-3-吲哚基- β -D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C、处理M小时后，考察了显示⑶S基因的表达的未成熟胚数。MM1)愈伤组织形成愈伤组织形成的结果如图2所示。在图2中，纵轴表示未成熟胚的愈伤组织形成指数，横轴表示自接种土壤杆菌后、直至从未成熟胚切除幼根、幼芽和胚轴的天数。共存培养开始后第2天去除幼根、幼芽和胚轴并着床于休眠培养基的未成熟胚显示出最高的愈伤组织形成指数。然后，随着直至去除幼根、幼芽和胚轴的期间的延长，愈伤组织形成率降低。 共存培养开始后第2天未切除幼根、幼芽和胚轴而着床于休眠培养基的未成熟胚(无切除) 显示出与共存培养开始后第5天切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚同等的愈伤组织形成指数。此外，去除幼根、幼芽和胚轴后接种土壤杆菌的未成熟胚显示出与共存培养后立即切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚(第0天)同等的愈伤组织形成指数。去除幼根、幼芽和胚轴后接种了土壤杆菌的未成熟胚，以及共存培养后立即切除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数为0. 23(图2 :0天)，而未切除幼根、幼芽和胚轴就进行休眠培养的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 10(图2 无切除)。 另一方面，共存培养开始后第1天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 40 (图2 :1天)。共存培养开始后第2天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 80 (图2 :2天)。共存培养开始后第3天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 30 (图2 :3天)。共存培养开始后第4天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 13(图2 :4天)。共存培养开始后第5天去除了幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚中的愈伤组织形成指数是0. 06 (图2 :5天)。 因此，与第2天去除幼根、幼芽和胚轴的数据比较(图2 :2天)，愈伤组织形成率与在接种土壤杆菌前切除幼根、幼芽和胚轴的传统方法相比提高至3. 5倍(图2 :0天)，与不切除胚轴的传统方法相比提高至8倍(图2 无切除)。2)基因导入效率对于在共存培养后立即去除幼根、幼芽和胚轴然后接种土壤杆菌的未成熟胚，15 个未成熟胚中的1个未成熟胚表达GUS基因。与此相对，对于在共存培养开始后第2天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，15个未成熟胚中的8个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于在共存培养开始后第3天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，15个未成熟胚中的11个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于在共存培养开始后第4天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，15个未成熟胚中的9个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于在共存培养开始后第5 天切除幼根、幼芽和胚轴的未成熟胚，16个未成熟胚中的7个未成熟胚可见GUS基因的表达。对于未切除幼根、幼芽和胚轴就进行休眠培养的未成熟胚，15个未成熟胚中的3个未成熟胚表达了⑶S基因。实施例4转化植物的制作材料和方法无菌采集在人工气象室KG-206SHL(小糸工业株式会社)、带空调机的温室、和常规玻璃温室中分别栽培的开花后第14天的普通小麦(品种=Bobwhite)的未成熟胚(大小 1. 5-2. 5mm)，用Inf液体培养基(1/10浓度的MS无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/ 1 MES、pH5. 8)洗涤1次。进行用于提高基因导入效率的前处理(15，OOOrpmUO分钟的离心处理)。在含100 μ M乙酰丁香酮的Inf液体培养基中悬浮约1. 0xl09cfu/ml的土壤杆菌系EHAlOl (pIG121Hm)(非专利文献3)，作为接种源。在离心处理后的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。使接种了土壤杆菌的未成熟胚以胚盘在上的方式着床于含100 μ M乙酰丁香酮、5 μ M AgNO3和5 μ M CuSO4的Co-Cul共存培养基(1/10浓度的MS 无机盐和MS维生素、10g/l葡萄糖、0. 5g/l MES、ρΗ5· 8、固体化剂为8g/l琼脂糖)。23°C、黑暗条件下进行共存培养。共存培养后开始后第2天从未成熟胚用手术刀和镊子去除幼根、幼芽和胚轴，着床于含MS无机盐和MS维生素、40g/l麦芽糖、0. 5g/l谷氨酰胺、0. lg/Ι酪蛋白水解物、 0. 75g/l六水合氯化镁、1. 95g/l MES、pH5. 8、固体化剂为2g/l Gelrite、100mg/l抗坏血酸、 5 μ M AgN03、250mg/l 羧苄西林、100mg/l 头孢噻肟、2. 2mg/l 毒莠定、0. 5mg/l 2，4_D 的休眠培养基。25°C、黑暗条件下培养5天后，将未成熟胚着床于在休眠培养基中添加15mg/l的潮霉素而得到的1次选择培养基。在相同条件下培养2星期后，将未成熟胚着床于在休眠培养基中添加30mg/l的潮霉素而得到的2次选择培养基。相同条件下培养3星期后，着床于添加有30mg/l的潮霉素的LSZ培养基(非专利文献4)，25°C、照明下培养2星期。将再分化的植物着床于添加有15mg/l的潮霉素的LSF 培养基(非专利文献16)，相同条件下培养2星期。将可见生根的植物着床于不含潮霉素的LSF培养基，培养1-2星期。将充分生根的植物移植到装有土的钵中，在人工气象机中进行栽培。将再分化的植物的叶的一部分浸渍于含0. 1% Triton X-100的0. IM磷酸缓冲液 (pH6.8)，37°C静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了包含LOmM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸缓冲液。37°C处理M小时后，考察了⑶S 基因的表达。MM2008年4月 5月、2008年12月 2009年3月合计进行了 7次试验。结果如表 1所示。采集于人工气象室(人工气象机)、带空调机的温室(空调温室)、常规玻璃温室 (常规温室)中栽培的作为材料的小麦。在表1中，接种了的未成熟胚数为(A)，潮霉素耐性、GUS阳性的植物个体数为(B)，以(B)/(A)表示的转化效率示于最右栏。在任何试验中，从接种的未成熟胚均获得了显示潮霉素耐性的1 2个个体的独立的再分化植物。所得植物均表达GUS基因，显示其为经基因导入的转化植物。这些转化植物均显示正常形态，且具有可育性。可知这样通过本方法，即使在以不同时期、不同环境下栽培的植物作为材料的情况下，也能够稳定地获得转化小麦。[表 1]小麦转化结果
权利要求
1.一种对小麦属(Triticum)植物的未成熟胚或完全成熟种子的组织进行基因导入的方法，该方法包括(i)将接种了土壤杆菌的上述组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤；以及( )与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。
2.一种小麦属(Triticum)植物的转化植物的制作方法，该方法包括(i)将接种了土壤杆菌的未成熟胚或完全成熟种子的组织在该土壤杆菌的存在下进行培养的共存步骤；( )与该共存步骤同时和/或在该共存步骤之后，在上述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤；(iii)将上述组织用休眠培养基进行培养的休眠步骤；然后(iv)将上述组织用再分化培养基进行再分化的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位是从组织去除选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，与所述共存步骤同时和/或在该共存步骤开始后7天以内，在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。
5.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，在所述共存步骤开始后1天 3 天，在所述组织中物理地/化学地损伤选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，所述共存培养基是不含植物生长调节剂的培养基。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，进行下述转化效率提高处理中的至少1项a)离心处理；b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜；c)热处理；d)热和离心处理；e)加压处理；f)在粉末存在下接种土壤杆菌的处理；g)在共存培养基中添加半胱氨酸的处理。
8.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，进行下述a)和/或b)的转化效率提高处理a)离心处理；b)向共存培养基中添加硝酸银和/或硫酸铜。
9.根据权利要求2 8中任一项所述的方法，其中，上述(iii)休眠步骤和(iv)再分化步骤之间包括药物选择步骤。
10.根据权利要求2 9中任一项所述的方法，其中，(iii)休眠培养基和/或药物选择步骤的选择培养基包含植物生长调节剂。
11.根据权利要求1 10中任一项所述的方法，其中，所述土壤杆菌是选自LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1C 和 58C1 中的菌。
12.根据权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，所述小麦属植物是普通小麦 (T. aestivum)或硬粒小麦(T. durum)。
全文摘要
本发明的方法的特征是包含将接种了土壤杆菌的植物组织用共存培养基培养后，去除选自幼根、幼芽和胚轴中的至少一个部位的步骤。通过本发明，能够提供与传统公知的土壤杆菌法相比，以高效率进行小麦属植物的转化的基因导入方法和转化植物的制作方法。
文档编号A01H1/00GK102469769SQ20108003304
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者樋江井佑弘, 石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社