专利名称：草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶及编码序列的制作方法
技术领域：
本发明公开一种草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及编码序列，具体是涉及到从土壤宏基因组中分离克隆的一个草甘膦耐受型EPSPS编码序列和蛋白产物，本发明还涉及此EPSPS的制备和用途，属于基因工程技术领域。
背景技术：
莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5_enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase (EPSPS) (EC2. 5. I. 19)〕是莽草酸途径的关键酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSPS的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。有些微生物来源的 EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，这一途径是生物产生草甘膦抗性的被动方式。草甘膦作为一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，自1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种(任不凡等，1998)。对大多数植物具有灭生性等其它除草剂不可比拟的优点。草甘膦作为一种灭生性除草剂，对农作物同样具有灭杀作用，这就限制了其使用范围和使用时间。如果能选育出抗草甘膦或降解草甘膦的农作物新品种，则既能显著节省农业生产费用，又能极大地促进草甘膦工业的发展。目前，我国尚无进入商品化阶段的抗草甘膦转基因作物，培育我国具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物具有迫切性。土壤微生物中蕴藏着极其丰富的基因资源，但由于在绝大多数人为创造的环境中，可培养的细菌数量非常有限，通常低于I %。因此，人们对土壤基因资源宝库的了解和利用还十分有限。随着分子生物学技术的发展和微生物学研究手段的进步，宏基因组学为我们研究环境微生物(特别是目前尚不可培养的微生物)提供了手段。通过直接从环境中提取和克隆基因组DNA，理论上可以获得任何功能的基因序列。直接克隆基因组为我们获得操纵子或由复杂分子直接合成物质(例如抗生素)提供了机会，本发明提供的编码EPSPS的基因就是从土壤宏基因组中分离克隆得到的。目前，国际上使用的抗草甘膦基因主要是美国Monsanto公司从农杆菌CP4中分离的cp4-EPSPS基因。Monsanto公司拥有cp4_EPSPS基因的多项专利，其专利覆盖了抗草甘膦基因CP4-EPSPS的重要变异位点。本专利公开的抗草甘膦基因不存在Monsanto公司EPSPS基因专利(专利号US 5804425,200480009843. 2)覆盖的氨基酸的变异位点。
发明内容
本发明提供一种草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(以下简称为EPSPS)多肽及其编码序列，其编码的蛋白具有较强的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的活性，并具有良好的草甘膦抗性。本发明公开的一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于
具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在SEQ ID No. I限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一个或多个氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。本发明公开的一种编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的编码序列，其特征在于
具有如SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列，具有编码如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一个或多个碱基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的编码序列。本发明公开一种载体，其特征在于，它含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸。本发明公开一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸的载体。本发明公开一种具有EPSPS活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含 Ca)在适合的表达条件下，培养含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸载体的宿主细胞； (b)从培养物里分离出具有EPSPS活性的多肽。本发明公开一种改变植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步骤
(O携带如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸的载体的农杆菌；
(2)利用步骤(I)所述的农杆菌侵染植物的细胞，组织或者器官；
(3)检测步骤(2)中植物的细胞、组织或者器官，将在其基因组中含有如SEQID No. 2所述的多核苷酸的细胞、组织或者器官再生成植株。本发明的EPSPS编码序列是从吉林省农业科学院长春院区周边采集的土样中分离土壤宏基因组DNA获得的。通过土壤DNA的分离、提取、重组等遗传工程技术构建了土壤宏基因组文库，并在含有草甘膦抗性的M9极限培养基上筛选、分离、鉴定了该基因在大肠杆菌中对草甘膦的抗性。进一步的草甘膦抗性实验发现，携带该基因的大肠杆菌能够耐受1200mg/L以上的草甘膦浓度。将该基因按照植物密码子偏好性进行优化后，通过农杆菌介导法转入受体植株烟草中，获得的转基因烟草植株最高能够耐受600mg/L的草甘膦除草齐U，是大田使用浓度的3-6倍。因为密码子存在兼并性，同时不同物种间存在着密码子偏好性的差异。因此，在确保其编码蛋白如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列不变的前提下，可以通过密码子偏好性优化软件对SEQ ID No. 2中所示的核苷酸序列进行优化与修改而不影响该基因的作用。同时，由于修改SEQ ID No. I所示的氨基酸序列中的若干氨基酸序列，包括添加细胞定位引导肽等，也不会影响该基因的活性。因此，本发明还包含对具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一个或多个氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；具有如SEQ ID No. 2所示的碱基序列，具有编码如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一个或多个碱基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的编码基因。具有如SEQID No. 3所示的碱基序列或具有编码如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或者对依据SEQID No. I所示的氨基酸序列及其衍生物采用其它密码子优化原则对编码碱基序列进行修饰的核酸序列。本发明的积极效果还在于
提供所述的克隆载体或表达载体，以及其转化的宿主细胞。其宿主细胞可以为原·核细胞、植物细胞、植物组织等，其中大肠杆菌的宿主细胞可因携带该基因而耐受浓度为1200mg/L的草甘膦。携带该酶编码序列的烟草宿主细胞可耐受浓度为600mg/L的草甘膦。本发明提供的基因和表达载体可用于农作物的遗传修饰，达到使植物耐受草甘膦除草剂的目的。
图I为实施例I中提取 土壤总DNA的电泳结果；
图2为实施例2中SoilA的PCR扩增结果；
图3为含实施例2中SoilA片段的载体pSYTH-SoilA的machl的细胞耐受草甘膦实验
结果;
图4为实施例2中携带载体pSYTH-SoilA和载体pSYTH的大肠杆菌细胞在不同草甘膦浓度的M9培养基中的生长状况；
图5为实施例3中载体pCAMBIA330E的PCR检测结果，其中I :Marker 200bp ladder,
2pCAMBIA330E 的 PCR 产物；
图6为实施例3烟草转基因再生植株的PCR检测结果；
图7为实施例3烟草野生型植株和转基因植株喷洒草甘膦前；
图8为实施例3烟草野生型植株和转基因植株喷洒草甘膦后。
具体实施例方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例I
编码草甘膦抗性EPSPS多核苷酸序列的获得
I、土壤总DNA的分离纯化称取2. 5g吉林省农业科学院长春院区周边的土壤样品，放入50mL离心管中，加入6750 μ L DNA提取液(DNA提取液IOOmmol / Tris-HCl,IOOmmol / L EDTA, IOOmmol / L Na3P04,1. 5mol / L NaCl, 1% CTAB, ρΗ8·0)，混匀(或在涡旋震荡器上震荡几秒)，然后加入5(^1^蛋白酶1((101^ / mL)，37°C水浴30min，每隔3 5 min上下颠倒混匀。加入750 μ L 20% SDS，65°C水浴2h，每隔15 20 min轻轻颠倒重悬；-70°C冷冻，然后65°C水浴融化，反复3次；室温6000g离心lOmin，收集上清于一新的50mL离心管中。土壤沉淀中加入2250 μ L DNA提取液和25 μ L的20% SDS，涡旋10s，65°C水浴IOmin,室温6000g离心10 min,合并上清液；向上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24 1)并混匀；12000g离心10 11^11，上层液转移至一新501^离心管中，然后加入0.6倍(V / V)异丙醇，室温沉淀lh;16000g离心20 min，弃上清收集沉淀。用预冷的70%乙醇洗涤沉淀两次，沉淀干燥后溶于50 μ L TE溶液或无菌去离子水中。通过琼脂糖凝胶电泳去除DNA中的腐植酸，用胶回收试剂盒回收DNA。提取的土壤总DNA跑1%琼脂糖凝胶的效果见图I，其中I为Marker 200bp ladder, 2为土壤总DNA。2、土壤总DNA与质粒pEAZY-Blunt Simple (简称pEAZYBS)的酶切与连接土壤总DNA用Not I进行部分酶切，Not I酶按I :300稀释，37°C，酶切时间30 min,乙醇沉淀回收。质粒载体pEAZYBS用Not I完全酶切后用SAP碱性磷酸脂酶进行末端去磷酸化，以减少载体自连。上述回收后的土壤DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pEAZYBS用2U的T4 DNA连接酶在16°C下连接16h。3、抗草甘膦基因EPSPS的筛选上述连接产物转化用CaCl2方法制备的machl TlPhage-Resistant Chemically Competent E. Coli (简称 Machl)感受态细胞,然后涂布含有200mg/L草甘膦的M9培养基平板，37°C培养48h。挑取单菌落并利用载体上的测序引物M13F和M13R对插入DNA片段进行测序分析。4、序列分析使用生物学软件vector NT I对测序后的序列进行分析。利用NCBI中的blast功能进行比对分析，发现一个新的编码EPSPS合成酶基因的开放阅读框，长度为1347bp，编码448个氨基酸。其氨基酸序列与大豆cp4_EPSPS有79%的同源性，与已经公布的专利(US 5627061, US 5804425 ,US 5633435)序列同源性最高为79%。将新的编码EPSPS合成酶编码序列命名为SoilA，并将上述重组载体命名为pEAZYBS-SoilA。
实施例2
草甘膦抗性EPSPS编码序列SoilA在大肠杆菌中的功能验证 设计引物
Pl (5，ATGTCTCATGGATCGGGCCCG 3，)、
P2 (5，TCACGCGATCCTCGCGCCGAG 3，)，
以pEAZYBS- SoilA为模板，用高保真酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，获得1356bp的SoilA片段，见图2 :其中I为Marker 200bp ladder，2为SoilA片段；该片段和用A^II酶切的PSYTH质粒大片段相连接。pSYTH质粒的构建过程为frra-CAGCTG-TiTz^^片段(SP用人工合成的多核苷酸片段5’ -3’端依次为烟草叶绿体16^ rRNA操纵子的启动子、Pvull酶切位点、烟草叶绿体基因的终止子)通过平末端方式连接到pEAZYBS载体上。含SoilA片段的连接产物用CaCl2方法制备的Machl感受态细胞转化，然后涂布含有200mg/L草甘膦的M9培养基平板，37°C培养48h。提取生长菌落质粒，经测序鉴定正确后命名为pSYTH-SoilA，并用于重新转化Machl，培养带有质粒pSYTH-SoilA的Machl菌液，用枪头蘸取少量菌液在200mg/L草甘膦的M9培养基平板上做标记“EPSPS”，同时用含有质粒载体pSYTH的Machl作对照标记“CK”，37°C培养48h。结果见图3，其中“EPSPS”为携带载体pSYTH-SoilA的大肠杆菌细胞，“CK”为携带载体pSYTH的大肠杆菌细胞；发现含有pSYTH-SoilA的Machl能够正常生长，而含有pSYTH的Machl的载体不能正常生长。将含有pSYTH-SoilA的Machl和含有pSYTH的Machl的菌液按照1:200的比例分别接种于草甘膦浓度为0，200，400，800，1200，1600, 2000mg/L的M9液体培养基中，在37°C下以200rpm/min培养48h,检测菌液OD值。由图4可知(横坐标为草甘膦的浓度(mg/L),纵坐标为大肠杆菌菌液的OD值)，当草甘膦浓度低于1200mg/L时，含有pSYTH-SoilA的Machl大肠杆菌生长没有受到明显抑制，而含有pSYTH的Machl大肠杆菌在含有200mg/L的草甘膦的M9培养基上生长已经受到严重限制。实施例3
草甘膦抗性EPSPS编码基因SoilA在烟草中的功能验证 设计引物
P3 (5，agtccatggatATGTCTCATGGATCGGGCCCG 3’)、
P4 (5，atcggtgaccTCACGCGATCCTCGCGCCGAG 3’)，以pEAZYBS-SoilA为模板，用高保真酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，获得1347bp的SoilA片段；用Nco I和访II酶切该片段，和pCAMBIA3301质粒相同酶切释放的大片段相连接。验证后的重组载体命名为PCAMBIA330E，图5为pCAMBIA330E的PCR检测结果，其中I为Marker 200bp ladder，2为pCAMBIA330E的PCR产物；冻融法将载体转化到农杆菌EHA105，通过叶盘法转化烟草，如图6经PCR筛选鉴定后(烟草转基因再生植株的PCR检测结果，其中I Marker 200bp ladder, 2 :质粒pCAMBIA330E，3 :非转基因烟草植株，4_15 部分再生植株)获得107株转基因植株，移栽后喷洒草甘膦，与非转基因烟草植株相比，均具有不同程度的草甘膦耐受性。图7所示的植株经浓度为600mg/L的草甘膦连续3次、每次间隔7天的喷洒后，其生长情况如图8所示，其中ck为非转基因植株，1-3 :转化载体PCAMBIA330E的植株，代号为CK的非转基因植株无法生长，已完全枯萎死亡，而3株转基因植株(代号分别为1，2，3)能够耐受草甘膦，均可正常生长。
权利要求
1.一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在SEQ ID No. I限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一个或多个氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。
2.一种编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的编码序列，其特征在于具有如 SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列，具有编码如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一个或多个碱基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的编码序列。
3.—种载体,其特征在于它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于它含有权利要求3所述的载体。
5.一种具有EPSPS活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含Ca)在适合的表达条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；(b)从培养物里分离出具有EPSPS活性的多肽。
6.一种改变植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步骤(O携带有权利要求3所述的载体的农杆菌；(2)利用权利要求6步骤(I)所述的农杆菌侵染植物的细胞，组织或者器官；(3)检测权利要求6步骤(2)中植物的细胞，组织或者器官，将在其基因组中含有权利要求2所述的多核苷酸的再生成植株。
全文摘要
本发明公开一种草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及编码序列，其宿主细胞可以为原核细胞、植物细胞、植物组织等，其中大肠杆菌的宿主细胞可因携带该基因而耐受浓度为1200mg/L的草甘膦。携带该酶编码序列的烟草宿主细胞可耐受浓度为600mg/L的草甘膦。本发明提供的基因和表达载体可用于农作物的遗传修饰，达到使植物耐受草甘膦除草剂的目的。
文档编号C12N9/10GK102925417SQ20121043174
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者邢少辰, 王云鹏, 林春晶, 韦正乙, 马建, 蔡玉红, 刘艳芝, 孙卉 申请人:吉林省农业科学院