专利名称：检测不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，特别是涉及高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证中药中玉米赤霉烯酮毒素和α-玉米赤霉烯醇毒素的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又称F_2毒素，是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌及串珠镰刀菌等产生一种雌激素类真菌毒素。由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而且部分镰刀菌为产毒菌，可产生玉米赤霉烯酮毒素，而在植物体内，ZEN代谢产生其他一些产物，主要是α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-Z0L)。因此，很有必要对中药中玉米赤霉烯酮毒素及其代谢物 α -玉米赤霉烯醇进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。^N主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品如饲料等。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。^N对动物及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。
发明内容
到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料中^Ν， α -ZOL毒素的分析，对中药中^Ν，α -ZOL毒素的分析，目前还是空白。因此对中药中^Ν， α-ZOL毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的观队 α-ZOL毒素的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于中药中ΖΕΝ，α -ZOL毒素的提取、净化方法，优化了液相，液质的色谱条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的ΖΕΝ，α -ZOL毒素进行测定。本发明是通过采用高效液相色谱荧光，紫外检测法测定中药中的观N，α -ZOL毒素的方法，同时建立了不同基质中ΖΕΝ，α -ZOL毒素的液相色谱-质谱联用确证法。具体的不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素及其代谢物α -玉米赤霉烯醇毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料仪器Hitachi L-2130高效液相色谱系统，日本Hitachi公司；
Hitachi L-2485 荧光检测器，日本 Hitachi 公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色谱系统，日本Shimadzu公司；Shimadzu SPD-M20A 二极管阵列检测器，日本Shimadzu公司；高效液相色谱仪(日本岛津公司)；API4000三重四级杆质谱仪；Qilinbeier 旋涡混合器；Heraeus Multifuge X3R 低温高速离心机。CX-250HP型超声波清洗器，北京医疗设备二厂；ZD-9556型水平摇床，太仓市科教仪器厂；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司Zearala testTM HPLC 免疫亲和柱，美国 VICAM 公司；GF/A型玻璃微纤维滤纸，英国WHATMAN公司。Ultimate" XB-C18 色谱柱，Welch Materials 公司；对照品玉米赤霉烯酮毒素(ZON)标准品购自以色列!^ermentek公司，纯度彡99% ； α -玉米赤酶烯酮(α-ZOL)标准品购自sigma公司，纯度彡99% ；色谱分析用乙腈、甲醇均为为色谱纯，B&J公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。样品所测样品分别购自江西樟树、江苏镇江、海南，浙江，河北，北京以及贵州遵义，所有样品均为市场上随机购买而来，低温干燥后备用。1、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的^N* α-ZOL毒素a.色谱条件色谱柱为UltimateK XB-C18色谱柱(5 μ m，25(toimX4. 6謹)；流动相为水-乙腈 (50 50，V/V)；流速lmL/min ；柱温25°C;发射波长274nm，激发波长440nm;进样量20yL。b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取ZON和α-ZOL标准品适量，加乙腈分别制成含量为 50 μ g/mL的溶液；PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、0. 2g 氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水定容至1000ml。c.样品溶液的制备样品提取准确称取样品12. 5g于三角锥形瓶中，加入1. 25g氯化钠及50ml甲醇水(V V 80 20)，摇床振摇lh，过滤，取IOml滤液加入IOml PBS溶液稀释，用玻璃
纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。样品净化吸取上述滤液IOml于玻璃注射器中，6ml/min过免疫亲和柱至2_3ml 空气通过免疫亲和柱，以IOml水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，并使2-3ml空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速慢，收集全部洗脱液于玻璃试管中，用0.45μπι的一次性针头过滤器过滤后进样分析d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。
2、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和α -ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-乙腈(50 50，V/V)为流动相，柱温25 °C，检测波长236nm ；b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液20 μ L，注入液相色谱仪，测定。3、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件色谱柱为 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mm*2. 00mm, 3micron)。流动相A为水(含0. 甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 3min 95% B, 2. 5min 95% B, 2. 51min 10% B,4min 10B%，结束。b.质谱条件采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。 ZON, m/z 317. 0 — 272. 9 碰撞电压为-28eV，m/z 317. 0 — 174. 8 碰撞电压为 _34eV，m/ ζ 317. 0 — 131. 0 碰撞电压为-40eV ； α -ZOL, m/z319. 0 — 274. 9 碰撞电压为-30eV，m/z 319. 0 — 159. 9 5並撞电压为-44eV，m/z 319. 0 — 130. 0 5並撞电压为-46eV.c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。本发明提供了中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-荧光检测法测定；中药中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色谱-二极管阵列检测法，并采用光谱图确证了实验中的阳性结果；中药中的阳性结果的高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果确证。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素的测定方法。1、高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的^N和α -ZOL毒素；(1)标准曲线禾口 α-ZOL 混标溶液，稀释得到不同浓度(0. 01、0. 02、0. 05、0. 10、0. 20、
0. 40,0. 8、1、2. 5μ g/mL)的混标溶液，分别进样，获得的色谱峰峰面积㈧对ZEN和α -ZOL 的质量浓度(C-μ g/mL)作回归，得到α -ZOL荧光标准曲线为A = 721647C+5578. 7，r = 0. 9999，线性范围为0. 01-2. 5μ g/mL ；得到ZEN荧光标准曲线为=A = 2*10eC_13664，r = 0. 9999，线性范围为0. 01-2. 5 μ g/mL。见表1和表2
表1 α -ZOL荧光线性关系考察结果_对照品浓度C ( μ g/mL)峰面积A (均值)0. 010. 020. 050. 100. 20
18203 30076 44013 84894 139224
0. 40277263
0. 80584039
1725178
2. 51813285
表2 ZEN荧光线性关系考察结果
对照品浓度C(yg/mL)峰面积A (均值)
0. 0122930
0. 0241397
0. 0572345
0. 10115157
0. 20292014
0. 40580019
0. 6875230
2. 53807020
(2)最低检出限和定量限
根据信噪比S/N ≥ 3为该物质的最低检出限，α-ZOL毒素荧光的最低检出限为 2. 5 μg/kg, ZEN毒素荧光的最低检测限为4 μ g/kg ；根据信噪比S/N彡10为该物质的最低定量限，α -ZOL毒素荧光的最低定量限为4. 5 μ g/kg，ZEN毒素荧光的最低定量限为7. 5 μ g/kg.
(3)日内精密度实验
精密吸取同一混标溶液，按上述色谱条件连续进样6次，计算ZEN和α -ZOL的峰面积值及RSD，结果见表3。
表3荧光日内精密度试验结果
权利要求
1.检测不同基质中药中玉米赤酶烯酮毒素(ZON)及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素 (α-ZOL)的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)、用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中ZON和a-ZOL的含量；(2)、用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和a-ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；(3)、采用HPLC-ESI-MS/MS对阳性结果进行确证。
2.根据权利要求1的不同基质中药中ZON和a-ZOL的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的ZEN和a-ZOL毒素a.色谱条件色谱柱为UltimateK XB-C18色谱柱(5 μ m，250mmX4. 6mm)；流动相为水-乙腈 (50 50，V/V)；流速lmL/min ；柱温25°C;发射波长274nm，激发波长440nm;进样量20yL。b.溶液配制对照品溶液的制备精密称取ZON和α-ZOL标准品适量，加乙腈分别制成含量为 50 μ g/mL的溶液；PBS缓冲溶液的配制称取8. Og氯化钠、1. 2g磷酸氢二钠、0. 2g磷酸二氢钾、0. 2g氯化钾溶于900ml水中，用浓盐酸调节pH至7. 0，用水定容至1000ml。c.样品溶液的制备样品提取准确称取样品12. 5g于三角锥形瓶中，加入1.25g氯化钠及50ml甲醇水 (V V 80 20)，摇床振摇lh，过滤，取IOml滤液加入IOml PBS溶液稀释，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。样品净化吸取上述滤液IOml于玻璃注射器中，6ml/min过免疫亲和柱至2_3ml空气通过免疫亲和柱，以IOml水淋洗免疫亲和柱，弃去流出液，并使2-3ml空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5ml甲醇洗脱，流速慢，收集全部洗脱液于玻璃试管中，用0.45μπι的一次性针头过滤器过滤后进样分析。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。(2)用高效液相色谱-二极管阵列检测法测定中药中ZON和α-ZOL的含量、光谱图确证阳性结果；a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-乙腈(50 50，V/V)为流动相， 柱温25 °C，检测波长236nm;b.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液20μ L，注入液相色谱仪，测定。(3)采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件色谱柱为 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mnpi<2· 00mm, 3micron)。流动相 A为水(含0. 甲酸)，流动相B为乙腈(含0. 甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 3min 95% B, 2. 5min 95% B, 2. 51min 10% B,4min 10B%，结束。b.质谱条件采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监测。Ζ0Ν， m/z 317. 0 — 272. 9 碰撞电压为 _28eV，m/z 317. 0 — 174. 8 碰撞电压为 _34eV，m/z.317. 0 — 131. 0 碰撞电压为-40eV ； α -ZOL, m/z319. 0 — 274. 9 碰撞电压为 _30eV，m/z 319. 0 — 159. 9 碰撞电压为-UeY, m/z 319. 0 — 130. 0 碰撞电压为 _46eV。c.测定法分别精密吸取对照品和上述阳性样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。
3.根据权利要求2所述的检测不同基质中药中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于样品制备过程中a.提取溶剂采用甲醇水(80 20，V/V)混合溶液；b.提取方式为高速勻质提取:3min；c.稀释溶液采用pH7.0的PBS缓冲溶液。
4.根据权利要求2所述的一种检测不同基质中药中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于a.液相色谱法中采用乙腈-水(50 50, V/V)作为流动相；b.高效液相色谱-质谱联用法中采用水(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.1%甲酸)作为流动相；c.高效液相色谱-质谱联用法中采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式。
全文摘要
关于检测不同基质中药中玉米赤霉烯酮毒素及其代谢物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，包括中药样品的提取，纯化及检测，所述的样品采用甲醇-水(80∶20，V/V)提取，pH7.0吐温-PBS缓冲溶液稀释，玻璃纤维膜过滤，免疫亲和柱净化。所述测定方法包括高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-二极管阵列检测法测定，光谱及高效液相色谱-质谱联用法确证。液相色谱条件为流动相比例乙腈∶水(50∶50，V/V)，荧光检测器波长激发波长270nm，发射波长440nm；二极管整列检测器波长236nm。液质条件流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。流速为0.5mL/min，洗脱梯度为0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，结束。质谱条件为采用ESI电离源，负离子扫描，MRM检测模式。本发明具有准确，精密，可靠等特点。
文档编号G01N30/06GK102590363SQ20111000080
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者杨美华, 申红红 申请人:中国医学科学院药用植物研究所