专利名称：永生化人脐带间充质干细胞系及其建立方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种永生化人脐带间充质干细胞，具体涉及一种能够稳定表达出人端粒酶催化亚基hTERT的干细胞系。本发明还涉及该干细胞系的建立方法和应用。本发明还涉及一种含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体的构建。
背景技术：
人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells,以下简称为hMSCs)是可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞，在细胞替代与基因治疗方面具有广泛临床应用前景。但hMSCs许多方面存在有待解决的问题，尤其是自体hMSCs在移植应用中数量不 足，限制了临床应用。解决这一问题的主要途径应包括两个方面一是增强hMSCs的增殖活力，二是应用异体或异种hMSCs。但异体移植有免疫学问题，因此，永生化的人间充质干细胞的建立是非常有意义的工作。端粒是染色体末端串连、重复的TTAGGG序列，在正常细胞分裂过程中会逐渐变短。当端粒在一个或多个染色体中缩短到某一极限值时，细胞衰老和生长停止就会发生。端粒的长度是由端粒酶维持的。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶催化亚基，实验表明，外源性htert基因导入细胞可提高端粒酶活性，延缓细胞的衰老，保持了多向分化潜能并没有致瘤倾向。这说明用htert基因转染修饰hMSCs可以达到延长hMSCs生命周期、保持多向分化潜能的目的。Simonsen J. L等通过逆转录病毒载体将hTERT转入人骨髓间充质干细胞hMSCs,筛选到的骨髓hMSCs细胞克隆在体外培养到200代，细胞无衰老迹象、并保持了多向分化潜能。本研究通过构建重组慢病毒载体plvx-htert，慢病毒载体感染效率高，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在细胞内长时间的表达且安全性高。将人端粒酶的催化亚基hTERT导入到脐带间充质干细胞中，使细胞能够长期传代，建立起永生化的人脐带间充质干细胞系尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是，筛选出永生化的人脐带间充质干细胞，以解决干细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的细胞来源。本发明通过构建重组慢病毒载体plvx-htert,将人端粒酶的催化亚基基因htert导入到脐带间充质干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT的干细胞系，经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明已经获得了永生化的脐带间充质干细胞系，该细胞系保持分化能力，没有致瘤倾向，可以作为表达各种抗原与抗体的基因载体。本发明具体进行了以下研究I、构建了含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体plvx-htert。与骨架质粒共转染293T细胞，成功地包装出含有htert的重组慢病毒，并测定了重组慢病毒的滴度。2、筛选出阳性的hMSC-hTERT细胞系用含有htert重组慢病毒载体感染分离到的第二代人脐带hMSCs，在嘌呤霉素的筛选下，成功地筛选出阳性的hMSC-hTERT，并继续培养，已成功地将hMSC-hTERT细胞培养到105代细胞。将此细胞系进行了生物材料保藏，保藏编号为CGMCC No. 6609。3、用多种方法证明了上述所得hMSC-hTERT细胞系的生物活性、功能I)用实时定量PCR及常规PCR技术在DNA、RNA及水平检测了 htert基因的表达 水平明显增加；2)用端粒酶活性试剂盒(Trapeze telomerase detection kit)和银染的方法鉴定hMSC-hTERT细胞系具有端粒酶的活性；3)细胞流式分析表明该细胞系表面标记均符合hMSCs特征；4)用成骨试剂诱导hMSC-hTERT细胞系，碱性磷酸酶水平升高，证明能够诱导出成骨细胞，表明hMSC-hTERT仍然具有多向分化能力；5)核型分析表明hMSC-hTERT具有正常的二倍体特征；6)可作为基因治疗的有效的载体将用于治疗EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染的包含潜伏膜蛋白2 (LMP2)基因的重组腺病毒感染hMSC-hTERT，免疫酶方法检测结果表明，hMSC-hTERT细胞系表达出LMP2蛋白。用含有2G12抗HIV中和抗体的重组慢病毒去感染该细胞系，用ELISA方法鉴定出细胞上清中能够表达出中和抗体2G12，浓度可以达到5μ g/ml。因此，建立的hMSC-hTERT可以闻效的表达外源基因，可作为基因治疗的有效的载体。4、证实了该细胞系的安全性小鼠致瘤实验表明，建立的hMSC-hTERT细胞系在小鼠体内没有致瘤现象，证实该细胞系没有致瘤性，比较安全。本发明解决了细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的hMSCs细胞来源。永生化的脐带hMSCs干细胞可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞。本发明的优点首先，本发明使用慢病毒载体将人端粒酶催化亚基导入到人脐带hMSCs中，慢病毒效率比较高，并且能够感染非分裂时期的细胞。第二，成功地筛选到了 hTERT阳性的细胞系hMSCs-hTERT，在体外培养已达到105代，远远地超过了脐带间充质干细胞的体外增殖能力，证明成功地获得永生化的人脐带间充质干细胞系。第三，筛选到的细胞系细胞形态及细胞表面抗原均符合人脐带间充质干细胞特征，核型分析表明该细胞仍然是二倍体细胞，保持分化潜能，并且没有致瘤倾向。
图I中，A为构建的重组慢病毒载体plvx-htert图谱；B为重组慢病毒载体plvx-htert瞬时转染293T细胞后，hTERT表达的免疫荧光结果图，图中白色亮点为hTERT阳性表达细胞，暗色为阴性表达细胞图2中，A为在RNA水平式上测定htert基因的RealTime-PCR结果，18s为内参；B为DNA水平上PCR结果图，所用两对引物均跨内含子，1、2为hMSCs-hTERT细胞系、3为hMSCs、4为阴性对照。图3为用TRAP-ELISA银染方法检测细胞中端粒酶活性图，图中PC为阳性对照，C为阴性对照，hMSCs对照，能够稳定表达出绿色荧光蛋白的hMSC-gfp细胞系及hMSC-hTERT图4是建立的人脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT不同代数可见光图片，分别是19、39、67 和 89 代 hMSC-hTERT 细胞系图5为建立的人脐带间充质干细胞系的诱导分化成骨情况图，A图为未诱导hMSC-hTERT ；B图为诱导成骨的hMSC-hTERT，经碱性磷酸酶染色结果，深色部分为碱性磷酸 酶染色图像。图6是hMSCs-hTERT小鼠致瘤实验结果图，左边组为Hela细胞，中间组为磷酸缓冲液PBS，右边组为hMSC-hTERT P70细胞图7将治疗EBV的Adv-lmp2感染hMSC-hTERT细胞系，用免疫酶检测LMP2在hMSC-hTERT中的表达情况(左阴性对照；右免疫酶检测LMP2结果)生物材料保藏信息培养物名称永生化人脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT保藏编号CGMCCNo. 6609保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏时间2012年9月28日
具体实施例方式以下实验中所用到的一些材料的来源如下
试剂或者质粒来源
穿梭质粒pivxClontech公司
Alpha MEMHyclone 公
胎牛血清FB SHyclone公司
EcoriNEB 公 n'j
XbaINEB 公司
FuGene HDRoche 公 “j
P24定量检测试剂盒Clontech公司
polybreneAmesco 公
89.6 和 NL4-3 HIV 毒株NIH
Trapeze telomerasedetection kitChemicon 公司
实施例I人脐带间充质干细胞系的建立及鉴定I.细胞分离及培养采用PercolI密度梯度离心法从脐带中分离到人脐带间充质干细胞；AlphaMEM+10%FBS常规培养，细胞生长至80%_90%以1:3传代。2.重组慢病毒载体plvx-htert的构建和鉴定分别提取高纯度的pEGFP-htert及plvx，限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切鉴定。用凝胶回收试剂盒从pEGFP-htert质粒和plvx质粒酶切产物中回收纯化htert和线形化Plvx片段。16°CT4连接酶连接，转化DH5a大肠杆菌接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基，37°C培养过夜。挑菌过夜培养，提取质粒，EcoRI和XbaI双酶切鉴定，并进行测序鉴定。鉴定正确后，将该重组载体瞬时转染HEK293细胞，用免疫荧光的方法，鉴定该质粒能否够表 出达端粒酶催化亚基hTERT蛋白(图I)。3.重组慢病毒包装及滴度测定慢病毒载体感染效率非常高，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在细胞内长时间的表达且安全性高。包装出重组慢病毒准确的测定出病毒的滴度，以适当的MOI (感染复数)去感染细胞，达到更好的效果。用质粒提取试剂盒提取高纯度plvx-htert重组质粒,并测定浓度。实验前I天，将293T细胞按照4X IO6的量接种到I个直径IOcm的培养皿中，细胞使用含有10%FBS (无四环素)的高糖DMEM培养液培养。实验当日，待细胞密度长到85%-90%时，将提取的高质量的plvx-htert质粒7 μ g与慢病毒包装质粒混合物36 μ I及FuGene HD转染试剂75 μ I混匀，孵育30min后共转染293T细胞，转染后72h收获细胞上清，300g离心后，用O. 45 μ m滤器过滤上清液。使用Clontech公司P24定量检测试剂盒对获得的重组病毒滴度进行检测。结论成功地包装出了含有htert基因的重组慢病毒，病毒滴度可以达到IX IO74.重组慢病毒感染脐带hMSCs使用含有10%FBS的a -MEM培养液进行培养，实验前I天，将hMSCs接种到六孔板中，次日，细胞达到70-90%满，将获得的重组慢病毒按照MOI 10-20:1的量感染细胞，感染时加入8 μ g/mL的polybrene，感染后6h细胞换液，感染后24_48h加入嘌呤霉素筛选，继续培养5-7天至对照细胞全部死亡时得到hMSC-hTERT细胞株。继续培养筛选到的细胞。5. PCR 及 RT-PCR 方法鉴定 hMSC-hTERT 细胞株。为了检测出导入到hMSCs细胞中的htert基因是否能够稳定的表达，分别提取hMSCs、hMSC-hTERT细胞的DNA及RNA，设计两对跨内含子的两对引物，以基因组DNA为模板，进行PCR，鉴定建立的hMSC-hTERT细胞系中htert基因的整合情况。以RNA为模板，进行RT-PCR鉴定端粒酶在建立的人脐带hMSC-hTERT及普通的人脐带hMSCs的表达水平的差异(见图2)。在DNA水平上PCR，凝胶电泳结果显示，在hMSC-hTERT细胞系中，能够扩增出大约360bp和540bp的htert基因的片段，而在未转入htert基因的hMSCs中不能够扩增出相应的片段，表明hMSC-hTERT中外源的htert基因已经成功的整合到了细胞染色体中。mRNA水平上荧光定量PCR结果显示，hMSC-hTERT中htert的检测Ct值明显低于常规的hMSCs细胞的Ct值，表明hMSC-hTERT细胞系中htert基因在mRNA上水平上的表达量远远大于未经重组慢病毒感染的hMSCs。
6. hMSC-hTERT细胞端粒酶活性检测按照端粒酶活性检测试剂盒(TRAPEZE Telomerase Detection Kit)说明书检测hMSC-hTERT细胞端粒酶活性，以hMSCs为对照。结果见图3在hMSC-hTERT细胞系经试剂盒检测并银染后，可以看到相差6bp的DNA ladder，而对照组中并未出现DNA ladder。表明在hMSC-hTERT细胞系能够表达出端粒酶，并且该酶具有端粒酶的活性。7.细胞表面标记鉴定用流式细胞仪对hMSC-hTERT细胞系进行表面抗原分析。分别对P50代的hMSC-hTERT 细胞表面抗原 CD105、CD29、CD44、CD106、CD45、CD14 进行分析。结果表明，CD105+88. 77%, CD29+ 93. 63%, CD44+ 90. 29% 不表达 cdl06, cd45, cdl4, 93. 63%细胞表型似hMSCs，建立的细胞系仍然具有hMSCs的细胞表型。核型分析和诱导分化按照常规的染色体制片技术，对hMSC-hTERT细胞系51代细胞进行染色体分析。细胞核型为二倍体。并对该细胞系制作细胞爬片，用诱导成骨培养基培养3周后，细胞进行碱性磷酸酶染色，确定细胞是否能够诱导成为成骨细胞。经过诱导后的细胞染色，颜色为深紫色(见图5)，表明有大量的碱性磷酸酶表达，是成骨细胞的一个重要特征。SCID小鼠致瘤实验为了检测建立的脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT是否具有致瘤的倾向及细胞应用的安全性，进行了 SCID小鼠的致瘤实验。接种到小鼠体内后能否形成恶性肿瘤是检验细胞是癌细胞恶性程度的重要指标。SCID小鼠因为细胞和体液免疫缺陷而有利于肿瘤细胞的增殖。实验方法将传代第70代的hMSC-hTERT细胞消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2X 107/ml。SCID雄性5周龄小鼠。各组小鼠分别于前肢皮下注射O. 25ml细胞悬液。阳性对照为Hela细胞，接种量为IXlO6 ;阴性对照为磷酸盐缓冲液PBS ;定期观察小鼠生长和肿瘤生长情况。结果小鼠接种细胞25天后，Hela细胞组(左侧三只小鼠)腋下就已经开始呈现出肿瘤，而hMSC-hTERT (中间三只)及PBS组(右侧三只)并没有产生。后经过两个月的观察，Hela组肿瘤继续增大，而hMSC-hTERT及PBS组仍然没有出现肿瘤的迹象。图6为接种细胞后45天小鼠经过苯巴比妥钠麻醉后拍摄照片。结论接种hMSC-hTERT细胞系两个月后，SCID小鼠仍然没有出现肿瘤的倾向，表明hMSC-hTERT没有致瘤的倾向，是安全的。hMSC-hTERT 细胞培养对hMSC-hTERT细胞系继续使用含有10%FBS的a -MEM培养液进行培养，现在已经培养到了第105代细胞，细胞形态没有发生改变(见图4)，已经远远的超过了普通的人脐带hMSCs的细胞传代次数，表明我们已经获得永生化的人脐带间充质干细胞系。实施例2EBV腺病毒疫苗Adv_lmp2在hMSC-hTERT中的表达应用LMP2是EBV病毒中的潜伏蛋白，LMP2已经被证实可以诱发较强的特异性CTL反应，可以用于对鼻咽癌的预防和治疗。用Adv-lmp2感染hMSC-hTERT细胞，使其能够不断地表达出LMP2，能够不断诱导出特异性的CTL (细胞毒性T淋巴细胞)反应。
hMSC-hTERT细胞系使用含有10%FBS的a -MEM培养液进行培养，提前实验前I天，将细胞接种到六孔板中，次日，细胞达到70-90%，将构建的重组腺病毒载体Adv-lmp2按照MOI 10:1感染细胞。4h后换液。感染后第三天，用胰酶消化收集细胞，做成细胞滴片。用免疫酶方法检测LMP2蛋白在hMSC-hTERT细胞系中的表达情况，结果表明LMP2蛋白可以有效地在hMSC-hTERT细胞系中进行表达(图7)。结论hMSC_hTERT细胞能够稳定的表达出LMP2蛋白，在体内长期表达出LMP2，可以不断得诱导体内产生特异性的CTL反应。实施例3 2G12广谱抗HIV中和抗体在hMSC-hTERT中的表达研究实验目的2G12是一种能够有效地中和HIV毒株的抗体。将表达2G12全基因的慢病毒载体去感染hMSC-hTERT，使该细胞能够持续不断地分泌出对HIV有中和活性的抗体2G12，人间充质干细胞的免疫原性低，因此hMSC-hTERT可以作为有效地表达中和抗体的载 体，在体内可以持续不断的分泌出2G12，从而达到清除HIV的目的，为艾滋病的治疗提供一个新的途径。hMSC-hTERT细胞系使用含有10%FBS的a -MEM培养液进行培养，提前实验前I天，将细胞接种到六孔板中，次日，细胞达到70-90%，将含有2G12全基因的重组慢病毒plvx-2G12按照MOI 10:1的量感染hMSC-hTERT细胞后，6h后换液。第三天用ELISA方法检测细胞上清液中2G12中和抗体的表达情况。结果在感染后第三天2G12中和抗体在hMSC-hTERT细胞系中表达量可以达到
5μ g/mlο结论建立的hMSC-hTERT可以有效地表达出广谱中和抗体2G12，可以作为中和抗体有效的载体，为HIV病毒的治疗提供一个新的途径。
权利要求
1.保藏编号为CGMCCNo. 6609的人脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT。
2.一种可稳定表达出人端粒酶的催化亚基hTERT的细胞系，其特征是人脐带间充质干细胞中导入了人端粒酶的催化亚基hTERT。
3.含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体。
4.权利要求3所述载体的构建方法，其特征是将人端粒酶催化亚基基因htert构建到表达载体plvx，然后与包装质粒包装出重组慢病毒。
5.权利要求I或2所述的干细胞系在制备防治EB病毒感染药物方面的应用。
6.权利要求I或2所述的干细胞系在制备提高端粒酶活性的制剂方面的应用。
7.权利要求I或2所述的干细胞系在制备促进细胞再生制剂方面的应用。
全文摘要
本发明获得了永生化人脐带间充质干细胞系。通过构建重组慢病毒plvx-htert载体，将人端粒酶的催化亚基hTERT导入到脐带间充质干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT的干细胞系。经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明所获得的是一种永生化的脐带间充质干细胞系，该细胞系保持分化能力。本发明还用多种方法证实了该细胞系的生物活性、功能，证明其可作为基因治疗的有效的载体。本发明还通过小鼠致瘤实验表明该细胞系的安全性，没有致瘤倾向。
文档编号C12N5/10GK102965341SQ20121043091
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者曾毅, 郝彦哲, 滕智平, 马晶, 张晓梅, 李东升 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京工业大学, 曾毅, 郝彦哲, 滕智平