专利名称：：链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一个链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B，该基因编码的蛋白质在降解纤维素中的应用。
背景技术：
：纤维素是植物中最广泛存在的骨架多糖，是世界上最丰富的可再生的天然有机物(高洁，汤烈贵，1996，纤维素科学，科学出版社，27-28.)。纤维素具有由β_1，4-糖苷键连接单糖而形成晶体结构，必须转化成微生物可利用的形式(如葡萄糖、乙醇等化合物)才能生物转化成能源或生物化工产品(李旺，刘辉，李恒新等，2007，纤维素酶产生菌DR的筛选和优化培养，江苏农业科学，3:170-172.)。用纤维素酶水解纤维素对环境没有任何污染，使得丰富的生物质资源可以通过生物转化变成绿色能源或可再生的生化产品(RizzattiACSA，JorgeJA,TerenziHF，etal，2001，Purificationandpropertiesofathermostableextracellularβ-D-xylosidaseproducedbyathermotolerantAspergillusphoenicis.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology，26:156-160.)。纤维素结构复杂，任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能降解天然纤维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。自然界中广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等(杜风光，史吉平，张龙等，2009，纤维质生产燃料乙醇产业化研究进展，2972-73.)。细菌类有红黄纤维弧菌(Cellvibriofulvus)、普通纤维弧菌(C.vulgaris)等。细菌产生的纤维素酶一般为胞内酶，并且产量比较低，主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。纤维单胞菌和高温单胞菌是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌(李明华，张大伟，楚杰等，2006，饲料纤维素酶的研究与应用进展，新饲料，7:65-68.);放线菌类有链霉属(Streptomyces)QMB814、高温放线菌属(Thernoactinomycete)和Theremomonosporacurvata等；真菌类有黑曲霉(Aspergillusniger)、血红栓菌(Trametessanguinea)、卧孔属(Poria)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、绿色木霉(Trichldermaviride)、里氏木霉(T.reesei)等，其中里氏木霉和黑曲霉是目前应用最广的纤维素酶生产菌(TangB,PanHB,ZhangQQ,etal,2009,CloningandexpressionofcellulosegeneEGIfromRhizopusstolonifervar.reftexusTP_02inEscherichiacoli.BioresourceTechnology,100:6128-6132.)。除此之外，国内外还尝试了应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌(林丽华，秦国梅，韦宇拓等，2OO9，台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变，生物工程学报，25(6):927-931.)，同时发现部分动物体内也可以产生纤维素酶，如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蜗牛的胃液等都含有丰富的纤维素酶(DuanCJ,FengJX.,2010,Miningmetagenomesfornovelcellulasegenes.BiotechnolLett.32(12):1765-75.)。纤维素酶是能够将纤维素降解成葡萄糖的一组酶的总称，它是一类复杂水解酶的复合物，称为纤维素酶系(宋波，邓晓峯，2003，纤维素酶的研究进展，22(7)=419-495.)。一般可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。(I)内切葡聚糖酶是从纤维素分子非结晶区域羧甲基纤维素水解产生大量小分子纤维素；(2)外切葡聚糖酶是从纤维素链末端水解产生纤维二糖分子；(3)葡萄糖苷酶水解纤维二糖分子和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。学者普遍认为纤维素被纤维素酶彻底水解是这三种酶协同作用的结果(KudoH,ChengKJ,CostertonJff,1987,Electronmicroscopicstudyofthemethylcellulose-mediateddetachmentofcellulyticrumenbacteriafromcellulosefibers,33:267-270.)。目前，纤维素酶已经被广泛地应用于多个领域，主要有食品、酿酒、环保、饲料加工、纺织、农业、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由于植物细胞壁的主要成分是果胶、纤维素和半纤维素等，因此，在水果与蔬菜加工的过程中适当使用纤维素酶，可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，还可使植物细胞壁发生不同程度变化，如软化、膨胀、崩溃等，提高果蔬的可消化性，并使其口感更好；在白酒及其酒精生产中以纤维素为原料发酵生产酒精，使用的是二段法，即先用纤维素酶将纤维素糖化，再经酵母发酵成酒精；在茶叶加工中用酶法低温抽提，即先用纤维素酶将茶叶的细胞壁裂解抽提其中的有效成分，最后将·高有效成分的得率，同时还可保持茶叶原有的色香味；在活性物质的提取中，如淀粉、蛋白质、活性多糖等物质的提取过程中，加入纤维素酶能大幅提高产品的收率(杜翠娇，任河，杜建敏等，2011，纤维素酶及其应用，食品工程，26-7.)以内切葡聚糖酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现69项发明专利。其中有23项发明专利是描述编码内切葡聚糖酶的基因及其应用，而其他46项是与内切葡聚糖酶在各种领域上的应用有关。在这23项与编码内切葡聚糖酶的基因及其应用相关的发明专利中的内切葡聚糖酶基因分别来自于各种细菌、霉菌、未培养微生物或人工合成的，在这23项专利中还没有一个内切葡聚糖酶基因是来自于链霉菌的。
发明内容本发明从广西南宁筛选到的链霉菌GX6的基因组中克隆到一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因，在大肠杆菌宿主细胞中表达该基因生产内切葡聚糖酶，并能以纤维素为原料降解生成葡萄寡糖。本发明涉及一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B，具有序列表中SEQIDNO1所述的碱基序列，是从链霉菌GX6的基因组中克隆得到。该内切葡聚糖酶基因Cel5B的序列是由1389个碱基组成，含有完整的内切葡聚糖酶基因Cel5B的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF),Cel5B基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。SEQIDNO:2的蛋白质是基因Cel5B编码的内切葡聚糖酶产物Cel5B，由462个氨基酸组成，和Cel5B催化功能域同源性最高的是与Streptomycessp.el4(链霉菌el4)的endoglucanaseCelA(内切葡聚糖酶CelA)，两者的一致性=402/467(86%)，相似性=419/467(90%)。基因Cel5B在大肠杆菌中表达的重组产物Cel5B能够分解纤维素。本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。本发明提供了一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因，该基因所编码的内切葡聚糖酶具有分解纤维素的用途。图I是筛选含有内切葡聚糖酶基因Cel5B重组菌株的CMC选择平板图。图2是内切葡聚糖酶Cel5B的SDS-PAGE图。从图I了解到，含有内切葡聚糖酶基因Cel5B的重组菌株能够在CMC选平板上形成透明圈。图2了解到，内切葡聚糖酶Cel5B纯化物的分子量为49.2kDa。具体实施例方式下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichiacoli)株系XLl-blue(购自TaKaRa公司)，表达载体pQE30和表达宿主M15(购自Qiagen公司)，CMC(carboxylmethylcellulose,竣甲基纤维素纳，购自Sigma公司)以及购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。下面将通过实施例对本发明作详细描述I)链霉菌StreptomycesGX6基因组DNA的提取链霉菌Sti^ptomycesGX6的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒BiospinBacteriaGenomicDNAExtractionKit(目录号BSC12S1)的使用说明来提取的。将提取好的链霉菌Sti^ptomycesGX6的基因组DNA送华大基因公司测定基因组序列。2)链霉菌Sti^ptomycesGX6的基因组序列中编码内切葡聚糖基因序列的分析将获得的链霉菌StreptomycesGX6的基因组序列用NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件ORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/Rorf/orfiR.cri)和Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。结果共获得3个与内切葡聚糖酶具有较高同源性的开放阅读框(OpenReadingFrame,0RF),本发明只涉及其中一个0RF。3)内切葡聚糖酶基因Cel5B的核苷酸序列分析基因Cel5B的开放阅读框(OpenReadingFrame,0RF)由1389个核苷酸组成,序列如SEQIDNO:1。其中，Cel5B基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。4)内切葡聚糖酶基因Cel5B编码的产物Cel5B的氨基酸序列分析内切葡聚糖酶基因Cel5B编码一个含462个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为49255.09道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http://smart,embl-heidelberg.de)分析内切葡聚糖酶Cel5B的组件结构，结果是自N端的I一32位氨基酸残基为信号肽序列、36-136位氨基酸残基为碳水化合物结合功能域II(CBD_II)、166—424位氨基酸残基为纤维素酶功能域(Pfam:Cellulase)。5)内切葡聚糖酶基因Cel5B的克隆和表达使用上游引物5’-ATAGGATCCGCCACCGGCTGCCGGGTCGACTACAC-3’(含有BamHI位点)和下游引物5’-AGTAAGCTTTCAGTTGGTGGGGAAGTTGTCCGGAG-3’(含有HindIII位点)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增内切葡聚糖酶基因Cel5B，用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切内切葡聚糖酶基因Cel5B后，与经BamHI和Hindi11酶切的表达载体pQE30进行连接。再将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌XLl-blue中，涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LA平板上。转化得到的单菌落点板至含有100μg/mL氨苄青霉素和O.5%(ff/V)CMC(羧甲基纤维素钠)的LA平板上，将平板置于37°C恒温箱培养5小时，对每个转点菌落逐个滴加Iμ11%(ff/V)的IPTG诱导表达，然后将平板置于37°C恒温箱继续培养5小时。时间到后，进行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒温箱使表达的Cel5B酶与CMC反应8小时。用O.1%的刚果红溶液染色15分钟后，再用IM的NaCl溶液脱色。观察选择平板。然后进一步提取在选择平板上能形成透明圈的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pQE-Cel5B，用限制性内切酶BamHI和HindIII完全酶切pQE_Cel5B后，进行O.8%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pQE-Cel5B除有一个约3.4kb的DNA片段外，还有一条大小约为I.3kb的·DNA片段。将质粒pQE_Cel5B用CaCl2法转化入大肠杆菌表达宿主M15中，涂布到含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LA平板上。挑取转化得到的单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，待OD6tltl为O.4时，加入IPTG使其终浓度为O.5mmol/L,37°C、180转诱导8小时。IlOOOrpm离心3min，收集菌体，用4mLpH7.OIOOmmoI/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min,取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL冲洗缓冲液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑，pH8.O)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8.O)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。6)内切葡聚糖酶Cel5B酶活力的测定取2μI内切葡聚糖酶Cel5B的纯化物，加入250μ11OOmmoI/L的ρΗ7·O磷酸缓冲液，与250μ12%CMC溶液混合，在37°C作用10分钟后，加入1000μIDNS溶液，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD53tl。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。所述DNS试剂配制称取I克NaOH用约40mLddH20溶解，再称取I克二硝基水杨酸、O.2克苯酚、O.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mLddH20中，两种溶液混合，定容到100mL。内切葡聚糖酶的酶活力单位(IU)定义为每分钟催化产生Iymol还原糖所需的酶量。内切葡聚糖酶的比活力的定义每mg蛋白质所含的酶活力(U/mg)。内切葡聚糖酶Cel5B的水解CMC比活力为28.4U/mg。权利要求1.一个来自链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.根据权利要求I的基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。3.—种表达载体,其特征在于,它含有权利要求I所述的基因。4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。5.权利要求2所述的蛋白质在降解纤维素的应用。全文摘要一个链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，上述基因编码的内切葡聚糖酶Cel5B，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示，以及该酶在分解纤维素中的应用。文档编号C12R1/465GK102888418SQ20121043038公开日2013年1月23日申请日期2012年11月1日优先权日2012年11月1日发明者杜丽琴,韦航,黄日波,韦宇拓,谭慧敏,雷攀先,赵英丽申请人:广西大学